GRP78基因沉默對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制

李平，潘銀鳳，王艷偉，焦燕

(1山東能源新汶礦業(yè)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院，山東萊蕪271103；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

GRP78基因沉默對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制

李平1，潘銀鳳2，王艷偉1，焦燕1

(1山東能源新汶礦業(yè)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院，山東萊蕪271103；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

目的 探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因沉默對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制。方法 設(shè)計(jì)、合成針對(duì)GRP78基因的短發(fā)夾RNA干擾序列，構(gòu)建GRP78載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒(GRP78 shRNA)。將培養(yǎng)好的SKOV3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、空白載體組、實(shí)驗(yàn)組，將空白質(zhì)粒、GRP78 shRNA分別轉(zhuǎn)染至空白載體組、實(shí)驗(yàn)組。用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GRP78、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)及增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)蛋白表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染24、48、72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率升高(P均<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，CHOP、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。結(jié)論 沉默SKOV3細(xì)胞內(nèi)GRP78基因后，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。

卵巢腫瘤；SKOV3細(xì)胞；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

卵巢癌是婦科常見的惡性疾病，其發(fā)病率占婦科癌癥的20%。中、晚期卵巢癌患者5年生存率不足20%[1]。卵巢癌以手術(shù)治療及化療為主，但效果并不理想。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶蛋白，與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及死亡抵抗有密切關(guān)系[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是近年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡機(jī)制，現(xiàn)階段研究認(rèn)為ERS發(fā)生的主要原因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白功能異常，導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積[3]，短時(shí)間的ERS是細(xì)胞自我修復(fù)的一種方法，但長(zhǎng)期的ERS即可引起細(xì)胞凋亡。已有研究表明，沉默GRP78可直接影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲力和遷移力，但具體機(jī)制尚不完全清楚[4]。2016年1～6月，本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞GRP78的表達(dá)，探討GRP78基因沉默對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制，為卵巢癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 shRNA慢病毒(沈陽萬類生物科技有限公司)；人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司)，293T細(xì)胞(上海紀(jì)寧生物公司)；GRP78、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體(Boster公司)，GAPDH內(nèi)參抗體(中國(guó)Wanleibio公司)；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)SIGMA公司)，RPMI1640(美國(guó)GIBCO公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，WD-9405B型水平搖床(中國(guó)六一公司)，LSR-Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 慢病毒載體構(gòu)建 用Ambion公司軟件，針對(duì)人GRP78基因mRNA(NM 005347.3)設(shè)計(jì)shRNA序列，構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。根據(jù)其對(duì)GRP78的抑制效率，確定有效RNAi模版序列：正義3′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-5′、反義3′-UCUAGUAUCAAUGCGCUCCTT-5′。慢病毒骨架質(zhì)粒pLVTHM經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切消化后與雙鏈DNA進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)其克隆進(jìn)行菌種培養(yǎng)擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒DNA。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，將重組的慢病毒骨架質(zhì)粒與包裝輔助質(zhì)粒用磷酸鈣共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞293T，培養(yǎng)12 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細(xì)胞上清液，于4 ℃、4 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，經(jīng)0.45 μm濾器過濾后置于25 000 r/min超速離心10 min, 而后以PBS液重懸病毒沉淀，制備完成慢病毒載體GRP78 shRNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 SKOV3細(xì)胞加入10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，條件：37 ℃、5% CO2，飽和濕度，2～3 d傳代1次。將細(xì)胞懸液以5×104/孔接種于24孔板，細(xì)胞融合80%～90%，隨機(jī)分為對(duì)照組、空白載體組及實(shí)驗(yàn)組。將空白質(zhì)粒、GRP78 shRNA分別轉(zhuǎn)染至空白載體組、實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)基中加入8 μg/mL ploybrene以提高感染效率，混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。孵育24 h后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)液，在原有條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h[4]。采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞GRP78表達(dá)，以驗(yàn)證GRP78是否轉(zhuǎn)染成功。

1.4 SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)算 采用MTT法。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為4×107/L，取200 μL接種于96 孔板中(每組細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔)，培養(yǎng)72 h，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清液，逐一加入DMSO 100 μL振蕩混勻，待藍(lán)色晶體完全溶解反應(yīng)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm 處的吸光度值(A值)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%[5]。

1.5 SKOV3細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染72 h取各組細(xì)胞，經(jīng)消化、PBS沖洗、懸浮、300目尼龍網(wǎng)過濾后加入Binding Buffer 懸濁細(xì)胞300 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL混合，再加入Propidium Iodide 10 μL充分混勻；常溫下避光反應(yīng)20 min；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 SKOV3細(xì)胞內(nèi)GRP78、Caspase-3及CHOP蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染72 h取各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF，提取蛋白質(zhì)，測(cè)定濃度。取樣15 μL以10%的SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉，加一抗anti-GRP78(1∶500)、anti-Caspase-3(1∶500)及anti-CHOP(1∶200)4 ℃孵育過夜，TBST洗脫5 min×3次，辣根過氧化酶標(biāo)抗二抗室溫孵育2 h，TBST洗脫10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯像[6]。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 結(jié)果

2.1 沉默GRP78對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖及凋亡的影響 轉(zhuǎn)染24、48、72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)抑制率升高(P均<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組凋亡率升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率比較

注：與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)間點(diǎn)比較*P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.2 沉默GRP78對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)GRP78、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染72 h，與對(duì)照組、空白載體組比較，實(shí)驗(yàn)組GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，CHOP、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組GRP78、CHOP和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05。

3 討論

癌細(xì)胞由于其自身瘋狂繁殖和易于轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，使傳統(tǒng)抗癌藥物難以將癌細(xì)胞殺死?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)于細(xì)胞的靶向誘導(dǎo)逐漸成熟，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的希望和研究熱點(diǎn)[7，8]。大量研究證實(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)和繁殖，致使腫瘤細(xì)胞普遍缺氧并發(fā)生ERS，但發(fā)生ERS的腫瘤細(xì)胞并不走向凋亡，這可能與腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)已產(chǎn)生耐缺氧及ERS耐受有關(guān)[9～11]。

卵巢癌因發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，預(yù)后極差，現(xiàn)階段手術(shù)治療效果欠佳，臨床治療多以化療為主[12]。但化療藥物具有不良反應(yīng)大、靶向性不明確、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中受到了諸多限制。因此，尋找高效、靶向治療卵巢癌的方法是亟待解決的問題。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白。Glembotski等[13]研究顯示，GRP78通過重新折疊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的“錯(cuò)誤折疊蛋白”，起到保護(hù)細(xì)胞不受損傷的作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的微環(huán)境可誘導(dǎo)GRP78高表達(dá)，高表達(dá)的GRP78又通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及死亡抵抗[2]，可見GRP78的高表達(dá)是腫瘤發(fā)病因素之一。Kaira等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GRP78是預(yù)測(cè)腫瘤不良預(yù)后的獨(dú)立因素。通過抑制GRP78的表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)化療藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷能力[14，15]。因此，降低腫瘤細(xì)胞中GRP78的表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，可能成為靶向治療或輔助治療卵巢癌的新方向。

在眾多靶向沉默技術(shù)中慢病毒轉(zhuǎn)染沉默技術(shù)的穩(wěn)定性和成功率最高[16]。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)選擇性沉默GRP78基因表達(dá)。卵巢癌SKOV3細(xì)胞沉默GRP78基因后，細(xì)胞凋亡率升高，且細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)抑制率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說明沉默GRP78可有效打破卵巢癌細(xì)胞ERS耐受，并減慢腫瘤細(xì)胞繁殖速度；且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可加重未折疊蛋白在SKOV3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的堆積，激活ERS凋亡通路，促進(jìn)腫胞凋亡。

CHOP又稱生長(zhǎng)停滯及誘導(dǎo)DNA損傷的基因153，可直接參與調(diào)節(jié)下游凋亡基因的表達(dá)，通過直接調(diào)節(jié)核內(nèi)的靶基因，增加細(xì)胞對(duì)ERS介導(dǎo)凋亡的敏感性[17]。Caspase家族至今已發(fā)現(xiàn)14位家庭成員，其中Caspase-12為ERS下游的凋亡因子，經(jīng)Caspase-12→Caspase-8→Caspase-3“瀑布式”激活，凋亡執(zhí)行核心蛋白Caspase-3可通過多種機(jī)制引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默GRP78基因表達(dá)后，SKOV3細(xì)胞中CHOP及Caspase-3表達(dá)升高，推測(cè)沉默GRP78后，SKOV3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積的錯(cuò)誤折疊蛋白不能降解，可能激活ERS凋亡信號(hào)通路，通過PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP、IRE1→CHOP、ATF-6→CHOP、Caspase-12→Caspase-8→Caspase-3等途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19，20]。

總之，本研究結(jié)果表明，沉默GRP78基因可通過激活ERS凋亡信號(hào)通路，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此為靶向治療卵巢癌提供了理論依據(jù)。將沉默GRP78作為“生物導(dǎo)彈”，局部靶向給藥，可能成為臨床治療卵巢癌的新方法。本研究也有不足之處，ERS凋亡信號(hào)通路較多，本研究未逐一探明，下一步研究將證實(shí)SKOV3細(xì)胞沉默GRP78后，對(duì)ERS凋亡信號(hào)通路的影響。

[1] 張彤，沈丹華，陳云新，等. PTEN、PAX-2和β-catenin在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2014，23(2)：85-88.

[2] 賈鵬宇，何苗，魏敏杰.GRP78在腫瘤發(fā)生發(fā)展及干性形成中的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2015，35(4)：559-564.

[3] 王伊林，趙雅君，楊洋，等.磷酸肌酸鈉對(duì)慢病毒介導(dǎo)Calumenin蛋白沉默阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的作用[J].臨床心血管病雜志，2015，31(10)：1119-1122.

[4] 范麗梅，魏敏，楊淑麗，等.沉默GRP78基因?qū)θ寺殉舶㏒KOV3細(xì)胞侵襲力的抑制作用[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30(23):3516-3519.

[5] Kim SH, Kim KY, Yu SN, et al. Silibinin induces mitochondrial NOX4-mediated endoplasmic reticulum stress response and its subsequent apoptosis[J]. BMC Cancer, 2016,16(1):452.

[6] 王伊林，單曉彤，柴花，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉腹腔注射對(duì)阿霉素心肌病大鼠心功能及左室纖維化的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56(7)：34-36.

[7] 胡明英，王曉莉，畢學(xué)輝，等.RNA干擾沉默AKT基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞增殖與凋亡影響研究[J]. 中華腫瘤防治雜志，2013，20(24)：1869-1873.

[8] 劉曼，胡明英，王曉莉，等. AKT基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及Fas、Fasl、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56(7)：29-30.

[9] Kaira K, Toyoda M, Shimizu A, et al. Expression of ER stress markers(GRP78/BiP and PERK) in patients with tongue cancer[J]. Neoplasma, 2016,63(4):588-594.

[10] 吳芳，安永康，朱艷琴.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22(9): 2228-2231.

[11] Zhang B, Han H, Fu S, et al. Dehydroeffusol inhibits gastric cancer cell growth and tumorigenicity by selectively inducing tumor-suppressive endoplasmic reticulum stress and a moderate apoptosis[J]. Biochem Pharmacol, 2016,15(104):8-18.

[12] 高翔，劉永軍，李曉丹，等.細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞聯(lián)合多西他賽、卡鉑治療晚期卵巢癌的療效及安全性[J].山東醫(yī)藥，2015，55(5)：82-84.

[13] Glembotski CC. The role of the unfolded protein response in the heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2008,44(3):453-459.

[14] Stope MB, Hettenbach D, Kaul A, et al. The Tumor Suppressor MicroRNA-1 exhibits restricted inhibition of proliferation of ovarian cancer cells[J]. Anticancer Res, 2016,36(7):3329-3334.

[15] 范麗梅，張立會(huì)，崔松花，等.特異性下調(diào)GRP78基因表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，37(2)：255-259.

[16] Lei CJ, Yao C, Pan QY, et al. Lentivirus vectors construction of SiRNA targeting interference GPC3 gene and its biological effects on liver cancer cell lines Huh-7[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014,7(10):780-786.

[17] 黃金燕，趙連友，林可，等.高血壓大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中GRP78和CHOP表達(dá)的變化及對(duì)血管重構(gòu)的影響[J].心臟雜志，2011，23(1):20-26.

[18] Zhang Q, Liu J, Chen S, et al. Caspase-12 is involved in stretch-induced apoptosis mediated endoplasmic reticulum stress[J]. Apoptosis, 2016,21(4):432-442.

[19] Ma J, Yang YR, Chen W, et al. Fluoxetine synergizes with temozolomide to induce the CHOP-dependent endoplasmic reticulum stress-related apoptosis pathway in glioma cells[J]. Oncol Rep, 2016,36(2):676-684.

[20] 趙彥超，顧耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2013，41(4)：285-288.

李平(E-mail：wylteam@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.012

R737.31

A

1002-266X(2017)05-0040-03

2016-07-15)