干細胞與自體星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)治療脊髓損傷的研究進展

肖雪飛，李經(jīng)輝，張翔，鄒楊鴻，黃鷂，余化霖

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

干細胞與自體星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)治療脊髓損傷的研究進展

肖雪飛，李經(jīng)輝，張翔，鄒楊鴻，黃鷂，余化霖

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病，采用外科手術(shù)、藥物治療效果不佳。干細胞療法可以有效修復(fù)損傷脊髓，但因為存在倫理道德的限制以及免疫排斥、細胞移植繼發(fā)損傷和潛在致瘤性等難以解決的問題，目前研究進展緩慢。自體細胞重編程技術(shù)通過在體內(nèi)重編程內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞獲得成神經(jīng)細胞，補充神經(jīng)元，以促進神經(jīng)傳導(dǎo)通路再生和脊髓功能恢復(fù)。該技術(shù)可能為SCI的治療帶來突破性進展。

脊髓損傷；干細胞；星形膠質(zhì)細胞；重編程

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病，具有高發(fā)病率、高耗費的特點，對患者身心健康和社會福利產(chǎn)生嚴重影響，給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[1]。目前臨床上對SCI的干預(yù)很大程度上是姑息性治療及后期康復(fù)治療，患者的癥狀或許有一定改善，但預(yù)后卻不佳。近年來研究結(jié)果證明，干細胞療法在修復(fù)損傷脊髓和重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路上擁有極大潛力，在臨床應(yīng)用卻存在諸多困難[2]。最新研究提出，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子可以在體內(nèi)將自體星形膠質(zhì)細胞直接重編程為微管相關(guān)蛋白(DCX)陽性的成神經(jīng)細胞，并可以在體內(nèi)誘導(dǎo)分化為成熟的功能性神經(jīng)元[3，4]。這為SCI的治療提供了一個全新的方向。本文針對干細胞及自體星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)治療SCI的研究進展作一綜述。

1 SCI的特征

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，對于SCI的認識程度也在不斷加深。目前認為SCI的病理生理變化主要分為三個階段：第一階段，原發(fā)性機械損傷直接造成脊髓組織結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致部分神經(jīng)細胞死亡。第二階段，脊髓組織完整性被破壞，由于血管的損傷，造成出血、缺血、血管通透性變化，局部組織發(fā)生水腫、缺血、壞死；細胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基釋放增加，神經(jīng)元大量破壞、崩解；中性粒細胞浸潤、興奮性細胞毒性和不明機制的神經(jīng)元凋亡程序啟動，造成大量神經(jīng)元死亡。第三階段，神經(jīng)元持續(xù)凋亡，損傷部位出現(xiàn)不同程度的脫髓鞘病變和脊髓空洞，膠質(zhì)瘢痕形成并產(chǎn)生抑制因子影響神經(jīng)元存活和軸突生長[2]。目前臨床中對SCI主要運用外科手術(shù)、藥物、康復(fù)等治療，可以減輕繼發(fā)性損傷，減少膠質(zhì)瘢痕形成，促使神經(jīng)元軸突生長，在短期內(nèi)可以得到一定程度的治療效果，但中遠期預(yù)后均不理想，其原因在于目前的治療方法均不能使丟失的神經(jīng)元得到補充，也不能完全消除膠質(zhì)瘢痕形成的物理屏障，脊髓功能不能得到完全恢復(fù)[1，5]。

2 干細胞療法

干細胞療法是近年的研究熱點，相對傳統(tǒng)治療方法，干細胞治療擁有獨特的優(yōu)勢，通過移植干細胞并在體內(nèi)分化以補充丟失的神經(jīng)元使神經(jīng)通路得以修復(fù)，促使脊髓功能恢復(fù)。

2.1 干細胞的種類及功能

2.1.1 胚胎干細胞(ESCs)和誘導(dǎo)多潛能干細胞(iPSCs) ESCs是來源于早期胚胎的干細胞，在體外培養(yǎng)可以無限增殖，并具有自我更新和多向分化的特性。iPSCs運用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4 、c-Myc)導(dǎo)入體細胞，使其重編程得到的在遺傳表觀和功能上類似于ESCs的具有多向分化潛能的干細胞[6]。已有研究表明，移植ESCs和iPSCs在體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞(NSCs)能夠逆轉(zhuǎn)SCI后局部不利的微環(huán)境，在體內(nèi)遷移分化，有效補充損傷脊髓內(nèi)丟失的包括神經(jīng)元在內(nèi)的各種神經(jīng)細胞，重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，達到修復(fù)脊髓的目的[7～9]。

2.1.2 間充質(zhì)干細胞(MSCs) MSCs是非神經(jīng)源類型的多能干細胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有跨越譜系分化為神經(jīng)細胞的能力[10，11]，大量用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。目前用于SCI治療相關(guān)研究的MSCs主要有骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞和臍血干細胞等。研究表明，在SCI模型中，植入MSCs表現(xiàn)出明顯的免疫抑制作用，減輕局部炎癥反應(yīng)。同時分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促使內(nèi)源性NSCs增殖、分化，并促使損傷灶血管增生，發(fā)揮促神經(jīng)細胞生長和神經(jīng)保護作用，達到治療SCI的效果[12～14]。

2.1.3 NSCs NSCs是神經(jīng)系統(tǒng)中的一類具有自我維持和自我更新能力的單能干細胞，能夠在體內(nèi)增殖并分化為不同神經(jīng)細胞。脊髓中內(nèi)源性NSCs來源主要為分布于脊髓中央管的室管膜細胞。SCI后，室管膜細胞迅速分裂增殖，分化成大量星形膠質(zhì)細胞和部分少突膠質(zhì)細胞，極少分化為神經(jīng)元[15]。移植外源性NSCs進入脊髓后其存活率較低，存活下來的細胞也主要向星形膠質(zhì)細胞分化。Lu等[16]通過向移植部位填充部分纖維蛋白支架和神經(jīng)生長因子以增加NSCs的存活率，大約1/3的NSCs最后分化成神經(jīng)元，并與宿主神經(jīng)元形成突觸連接。另有研究表明，植入NSCs可以誘導(dǎo)脊髓內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子表達，促進血管生成，使肢體運動功能恢復(fù)[17]。

2.2 干細胞治療SCI的缺陷 現(xiàn)階段研究表明，干細胞移植治療SCI在理論上可行，但實際臨床應(yīng)用存在困難。第一，運用人體胚胎來源的ESCs或異體干細胞存在著難以避免的倫理道德和免疫排斥問題[7]。第二，將自體細胞進行體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)為iPSCs所需時間較長，會錯過SCI最佳治療時間窗[18]。第三，干細胞移植過程本身可能造成繼發(fā)損傷，或?qū)е戮植磕X脊液泄露、注入點囊性包裹形成等，都可能加重SCI。另外，干細胞移植于體內(nèi)還有潛在的致瘤風(fēng)險[19]。因此，將干細胞安全、可靠地用于SCI的臨床治療、發(fā)掘更合適來源的干細胞將是今后研究重點。

3 內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)

Takahashi等[6]發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、c-Myc、Sox2、Klf48重編程小鼠成纖維細胞獲得iPSCs。有學(xué)者用同樣方法將人源星形膠質(zhì)細胞重編程為iPSCs，發(fā)現(xiàn)可以獲得更高的誘導(dǎo)效率，并且得到的iPSCs也可以被引導(dǎo)分化為NSCs，因此星形膠質(zhì)細胞可能具有較高的干細胞潛能[20]。Corti等[21]發(fā)現(xiàn)，Oct4、Sox2和Nanog可以將人類大腦來源的星形膠質(zhì)細胞在體外直接編程為神經(jīng)干細胞，并且編程過程也可以在小鼠體內(nèi)完成。另有研究表明，通過慢病毒將轉(zhuǎn)錄因子Sox2導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，可以將內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞直接重編程為DCX陽性的成神經(jīng)細胞，且可通過藥物干預(yù)分化為成熟的神經(jīng)元并整合到局部的神經(jīng)通路中[22]。Guo等[4]通過研究證實，在成年小鼠腦損傷后，用逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼NeuroD2神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子，可以將腦皮層增生的反應(yīng)性膠質(zhì)細胞重新編程轉(zhuǎn)換成功能性神經(jīng)元，并可檢測到轉(zhuǎn)換來的神經(jīng)元突觸電生理信號。

目前針對內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞直接重編程為成神經(jīng)干細胞治療SCI的報道不多。Su等[23]發(fā)現(xiàn)，將轉(zhuǎn)錄因子Sox2通過慢病毒載體導(dǎo)入小鼠SCI模型中并表達，可以將神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的主要成分——星形膠質(zhì)細胞，逆轉(zhuǎn)錄為可增殖的成神經(jīng)細胞。且腹腔注射組蛋白脫乙酰酶抑制劑促使新生神經(jīng)元成熟，形成γ-氨基丁酸中間神經(jīng)元，與先前的膽堿能運動神經(jīng)元突觸連接。該研究在體內(nèi)將內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞直接重編程為成神經(jīng)細胞，并整合到脊髓神經(jīng)系統(tǒng)通路中，克服了干細胞移植所面臨的尷尬處境，為內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)治療SCI提供了強有力的基礎(chǔ)。

雖然目前暫時無星形膠質(zhì)細胞體內(nèi)重編程技術(shù)存在負面效應(yīng)的報道，但已有學(xué)者指出，包括c-Myc、Oct4、Sox2在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子或基因在腫瘤細胞有表達，且直接或間接參與了腫瘤的發(fā)生過程，如在部分惡性腫瘤中c-Myc過表達是細胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[24]。而目前常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在自然界中的宿主通常為人或其他脊椎動物，擁有感染細胞并將遺傳信息整合到宿主基因的能力，可能會破壞腫瘤抑制基因的調(diào)節(jié)機制或激活原癌基因，存在潛在生物學(xué)危險因素。因此，如何將星形膠質(zhì)細胞體內(nèi)重編程技術(shù)安全用于SCI治療也是值得研究的課題。

SCI的病理生理變化是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，隨著對SCI不同階段分子機制理解的深入，越來越多的治療相關(guān)研究策略被提出。目前認為SCI治療的關(guān)鍵在于：促進神經(jīng)元再生和克服膠質(zhì)瘢痕的物理屏障。干細胞療法作為一種有前途的治療方式，在現(xiàn)有的研究中體現(xiàn)出了極高的潛力。雖然將干細胞療法運用于臨床仍然存在爭議、風(fēng)險及技術(shù)上的困難，但不可否認其臨床運用前景十分廣闊。而星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)作為一種全新的方法，相比以往的干細胞療法擁有獨特優(yōu)勢，首先使用內(nèi)源性星形膠質(zhì)細胞進行重編程不存在倫理道德問題和免疫排異反應(yīng)；其次星形膠質(zhì)細胞廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而膠質(zhì)瘢痕的主要成分也是星形膠質(zhì)細胞，重編程的目的細胞來源廣泛，且重編程技術(shù)在膠質(zhì)瘢痕中重建神經(jīng)通路有很大潛力；相比以前的譜系編程技術(shù)(如iPSCs)，星形膠質(zhì)細胞直接重編程為神經(jīng)干細胞的過程更加高效，且保持了相同的細胞譜系，其遺傳表觀相對穩(wěn)定；和干細胞植入相比，直接導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒致瘤風(fēng)險相對較低，且植入病毒的體積相對更小，對脊髓組織的損傷更輕。雖然目前看來星形膠質(zhì)細胞重編程技術(shù)可能存在風(fēng)險，但這一發(fā)現(xiàn)對治療SCI有重大意義，希望在不久的將來這項技術(shù)能為SCI治療帶來突破性進展。

[1] Singh A, Tetreault L, Kalsi-Ryan S, et al. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury[J]. Clin Epidemiol, 2014,23(6):309-331.

[2] Silva NA, Sousa N, Reis RL, et al. From basics to clinical: a comprehensive review on spinal cord injury[J]. Prog Neurobiol, 2014,114(3):25-57.

[3] Torper O, Pfisterer U, Wolf DA, et al. Generation of induced neurons via direct conversion in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(17)：7038-7043.

[4] Guo Z, Zhang L, Wu Z, et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer′s disease model[J]. Cell Stem Cell, 2014,14(2):188-202.

[5 ] McDonald JW, Becker D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals[J]. Am J Phys Med Rehabil， 2003，82(10)：38-49.

[6] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006,126(4)：663-676.

[7] Ryan P, Robert A, Carl Shen, et al. Transplantation of neural stem cells clonally derived from embryonic stem cells promotes recovery after murine spinal cord injury[J]. Stem Cells Dev, 2015,24(1)：36-50.

[8] Nori S, Okada Y, Yasuda A, et al. Grafted human-induced pluripotent stem-cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(40)：16825-16830.

[9] Romanyuk N, Amemori T, Turnovcova K, et al. Beneficial effect of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors in spinal cord injury repair[J]. Cell Transplant, 2015,24(9):1781-1797.

[10] Rezniczek GA, Kumbruch S, Scheich J, et al. Factors influencing yield and neuronal differentiation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and matrix[J]. Regen Med, 2016,11(5):465-474.

[11] 余化龍，何寧，劉志剛，等.骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合EPO對急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)運動功能的影響及機制探討[J].山東醫(yī)藥，2016，56(18)：37-39.

[12] Novikova LN, Brohlin M, Kingham PJ, et al. Neuroprotective and growth-promoting effects of bone marrow stromal cells after cervical spinal cord injury in adult rats[J]. Cytotherapy, 2011,13(7)：873-887.

[13] Oh JS, Park IS, Kim KN, et al. Transplantation of an adipose stem cell cluster in a spinal cord injury[J]. Neuroreport, 2012,23(5)：277-282.

[14] Ning G, Tang L, Wu Q, et al. Human umbilical cord blood stem cells for spinal cord injury:early transplantation results in better local angiogenesis[J]. Regen Med, 2013,8(3)：271-281.

[15] Sabelstr?m H, Stenudd M, Frisén J, et al. Neural stem cells in the adult spinal cord[J]. Exp Neurol, 2014,260(10):44-49.

[16] Lu P, Kadoya K, Tuszynski MH, et al. Axonal growth and connectivity from neural stem cell grafts in models of spinal cord njury[J]. Curr Opin Neurobiol, 2014,27(8)：103-109.

[17] Li Z, Guo GH, Wang GS, et al. Influence of neural stem cell transplantation on angiogenesis in rats with spinal cord injury[J]. Genet Mol Res, 2014,13(3)：6083-6092.

[18] Okano H, Nakamura M, Yoshida K, et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells[J].Circ Res, 2013,112(3)：523-533.

[19] Nishio M, Nakahara M, Yuo A, et al. Human pluripotent stem cells: Towards therapeutic development for the treatment of lifestyle diseases[J]. World J Stem Cells, 2016,8(2)：56-61.

[20] Ruiz S, Brennand K, Panopoulos AD, et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes[J]. PLoS One, 2010,5(12)：e15526.

[21] Corti S, Nizzardo M, Simone C, et al. Direct reprogramming of human astrocytes into neural stem cells and neurons[J]. Exp Cell Res, 2012,318(13)：1528-1541.

[22] Niu W, Zang T, Zou Y, et al. In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain [J]. Nature Cell Biology, 2013,15(10)：1164-1175.

[23] Su Z, Niu W, Liu ML, et al. In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord[J]. Nat Commun, 2014,5(8)：3338.

[24] Chen BJ, Wu YL, Tanaka Y, et al. Small molecules targeting c-Myc oncogene: promising anti-cancer therapeutics[J]. Int J Biol Sci, 2014,13(10)：1084-1096.

(責(zé)任編輯：2016-09-26)

云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2013Y287)。

余化霖(E-mail：yuhl308@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.036

R744

A

1002-266X(2017)05-0107-03