紅棕象甲幼蟲對吡蟲啉敏感性測定及中毒行為學反應(yīng)

張楚毓 ，袁偉欽 ，趙建超 ，李龍偉 ，呂朝軍 ，陳拓 ，鐘寶珠 ，覃偉權(quán) *

（1.海南大學 熱帶作物學院，海南 ?？?570100；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 椰子研究所，海南 文昌，571339；3.華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；4.云南農(nóng)業(yè)大學 熱帶作物學院，云南 昆明 650000）

紅棕象甲（Rhynchophorus ferruqineusFab.）是我國檢疫性高風險有害生物［1］，對棕櫚科植物危害極大，目前已傳入大多數(shù)棕櫚科引種區(qū)和分布區(qū)［2］。該蟲以成蟲在植物組織傷口、樹冠芯部或葉基部產(chǎn)卵，卵孵化后幼蟲取食莖干組織，最終導致植株在6~8個月內(nèi)死亡［3］。目前紅棕象甲已入侵到我國海南、廣西、廣東、云南、西藏（墨脫）、福建、江西、湖南、貴州、四川、重慶、上海、浙江、香港特別行政區(qū)、臺灣等地［4］。紅棕象甲防控技術(shù)研發(fā)在生物防治、化學防治及物理防治等方面均有開展［5-8］，其中化學防治應(yīng)用最為廣泛。吡蟲啉是當前使用最廣的新煙堿類藥物，具有低毒、廣譜、高效、速效、有效期長等特點［9］，其對天牛［10］、小蠹［11］、吉?。?2］、象甲［13］及木蠹蛾［14］等樹干鉆蛀性害蟲均具有較好的防控效果，但害蟲對該藥劑的應(yīng)激性反應(yīng)還未可知。本文以紅棕象甲7~8齡幼蟲為供試對象，研究了吡蟲啉對紅棕象甲幼蟲的毒力水平，并對處理后紅棕象甲的行為學反應(yīng)進行了記錄和分析，以期為紅棕象甲化學防治策略的制定和吡蟲啉的科學利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試昆蟲：紅棕象甲為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所昆蟲繁育室自繁自養(yǎng)，繼代不少于10代。試驗前選用發(fā)育良好健康、外觀無傷痕、活動力強的8齡幼蟲供試。試驗環(huán)境為（26±1） ℃、相關(guān)濕度70%±5%、光周期L∶D=16∶8。

供試藥劑：吡蟲啉含量為96%原粉，購自海南宏遠達科技有限公司。使用前以丙酮為溶劑稀釋至系列濃度備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅棕象甲幼蟲對吡蟲啉的敏感性測定

用經(jīng)口注射法。用移液槍分別將每頭25、62.5、125、250、500 μg有效劑量從紅棕象甲幼蟲口腔注射入體內(nèi)。為保證藥液完全經(jīng)口進入蟲體，采用少量多次法（8~10次）將藥液緩慢注射入試蟲的口中。處理完成后將試蟲分別轉(zhuǎn)移至單獨的飼養(yǎng)盒（φ4.5 cm×5.5 cm）中。每個濃度設(shè)置3個重復，每個重復20頭試蟲，以丙酮處理為對照組。處理后24、48、72、96 h統(tǒng)計試蟲死亡率，以昆蟲針觸碰蟲體無任何反應(yīng)為死亡。

1.2.2 高劑量吡蟲啉處理后紅棕象甲幼蟲中毒反應(yīng)

處理方法同1.2.1。從藥劑處理完畢后立即開始計時，至其完全喪失行動能力（用試蟲針觸動無移動反應(yīng)）時停止。記錄單頭試蟲在其間的癥狀表現(xiàn)：各狀態(tài)保持30 s以上則被記錄。記錄時間秒鐘（s）>30 s時舍棄秒鐘單位數(shù)值，并在原分鐘單位數(shù)值上加1，秒鐘≤30 s則舍棄秒鐘單位數(shù)值，原分鐘單位保持不變。

1.2.3 低劑量吡蟲啉處理后紅棕象甲幼蟲中毒反應(yīng)

用經(jīng)口注射法，用移液槍分別將每頭1.5、1.75、2、2.25、2.5 μg的有效劑量藥液從紅棕象甲幼蟲口腔注射入體內(nèi)。其余處理方法同1.2.2。處理后每12 h觀察一次，連續(xù)觀察4 d，記錄各試蟲的癥狀表現(xiàn)。

1.2.4 吡蟲啉處理下紅棕象甲幼蟲后期取食量

處理方法同1.2.1。處理后48 h對各試蟲進行特異性應(yīng)激反應(yīng)觀察，之后補充喂食去皮甘蔗段（φ 4 cm×3 cm）。取食量標準為：取食量<1%為無取食，10%>取食量≥1%極少取食，20%>取食量≥10%為輕微取食，30%>取食量≥20%為少量取食，取食量≥30%為明顯取食。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

參照黃劍等［15］的方法分析毒力回歸方程及LD50/LT50、LD50/LT50的95%置信區(qū)間。用Origin V.2021對數(shù)據(jù)進行圖形繪制分析。

2 結(jié)果分析

2.1 紅棕象甲幼蟲對吡蟲啉的敏感性測定

不同劑量吡蟲啉處理紅棕象甲幼蟲的LT50結(jié)果如表1。在各供試劑量下，LT50的95%置信限重疊，LT50值無顯著性差異。不同處理時間后，吡蟲啉對紅棕象甲幼蟲的死亡率結(jié)果（表2）顯示，在處理后24 h和48 h的LD50差異不顯著，但均高于72 h和96 h，隨供試時間延長，LD50呈現(xiàn)降低趨勢，其中在處理后96 h的LD50為每頭0.43 μg，與24 h和48 h處理組結(jié)果差異顯著。

表1 吡蟲啉不同劑量處理紅棕象甲幼蟲的LT50統(tǒng)計結(jié)果Table 1 LT50 of R.ferrugineus larvae treated with different dosages of imidacloprid

表2 吡蟲啉不同時間處理對紅棕象甲幼蟲的LD50Table2 Statistical analysis of LD50 of R.ferrugineus lar?vae treated with imidacloprid after different time

2.2 吡蟲啉處理后紅棕象甲的行為學反應(yīng)

吡蟲啉處理后，紅棕象甲中毒行為主要表現(xiàn)為：失禁、嘔吐、胸部蜷縮、向背蜷縮、口器持續(xù)大張狀態(tài)、S狀蜷縮、L狀蜷縮、C狀蜷縮、全身蜷縮、鉤狀蜷縮、螺旋蜷縮、中部縊縮、尾部縊縮、長條狀縊縮、體壁松軟等，具體見圖1。在各狀態(tài)中，表現(xiàn)為中部縊縮、尾部縊縮、長條狀縊縮這3種狀態(tài)中的大部分試蟲最終轉(zhuǎn)變?yōu)樾夭框榭s狀態(tài)。

2.2.1 高劑量吡蟲啉處理后紅棕象甲中毒行為學分析

吡蟲啉在高劑量梯度（每頭25~500 μg）中的最低劑量每頭25 μg處理后，紅棕象甲喪失行動能力時間平均為10.35 min（9 min 56 s~11 min），在供試較高劑量下，試蟲喪失行動能力時間的時間跨度增加（1~30 min）。在所有的中毒狀態(tài)中，試蟲口器持續(xù)大張狀態(tài)在各劑量中均大量表現(xiàn)。在最高劑量（每頭500 μg）中呈現(xiàn)失禁狀態(tài)的試蟲數(shù)量顯著多于呈現(xiàn)嘔吐狀態(tài)的個體數(shù)量，而較低劑量（每頭25~62.5 μg）處理中則呈現(xiàn)相反結(jié)果。在各劑量處理中均有超過50%個體出現(xiàn)胸部蜷縮狀態(tài)。在觀察中統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，當蟲體出現(xiàn)明顯的嘔吐、失禁、蜷縮、體壁松軟狀態(tài)后1~2 min 基本會完全喪失行動能力。藥劑處理后期，供試較高劑量處理（每頭250、500 μg的蟲體在背中線部位出現(xiàn)羽狀皺縮（如圖1J），其它部位呈現(xiàn)球狀凸起，個別蟲體出現(xiàn)蟲體爆裂后內(nèi)容物崩出死亡（如圖1K）。

圖1 吡蟲啉處理后紅棕象甲幼蟲的中毒行為學反應(yīng)Fig.1 Behavioural response of red palm weevil larvae to imidacloprid treatment

2.2.2 低劑量吡蟲啉對紅棕象甲高齡幼蟲處理后行為學觀察

在經(jīng)吡蟲啉低劑量處理后紅棕象甲幼蟲亦會出現(xiàn)蜷縮、皺縮、抖動、口器持續(xù)大張、松軟、平衡感缺失等中毒癥狀，各癥狀出現(xiàn)的先后依次為：胸部蜷縮、C狀蜷縮、L狀蜷縮、S狀蜷縮、鉤狀蜷縮、螺旋蜷縮、向背蜷縮、全身蜷縮、口器持續(xù)大張、皺縮狀態(tài)，最后進入體壁松軟狀態(tài)，在此之后會短暫隨機出現(xiàn)抖動、張口、蜷縮等狀態(tài)，并伴隨個別蟲體出現(xiàn)爬行失衡。所有出現(xiàn)蜷縮狀態(tài)的個體均會有長短不一的體壁僵硬狀態(tài)。在低劑量梯度下沒有內(nèi)容物崩出的現(xiàn)象出現(xiàn)。

出現(xiàn)蜷縮癥狀的試蟲中，有70%以上個體前期僅胸部出現(xiàn)縊縮，處理后期胸部縊縮個體數(shù)量減少，并轉(zhuǎn)化為其它蜷縮狀態(tài)，而向背蜷縮的個體會身體后仰伴隨大量排泄。

在試蟲出現(xiàn)口器持續(xù)大張行為前期，部分個體會出現(xiàn)單個上顎開合，或雙顎交叉快速高頻率2~4次·s-1開合，此過程持續(xù)約5~30 min后即上顎間歇性大張持續(xù)2~3 d。

2.3 吡蟲啉處理后紅棕象甲幼蟲反應(yīng)劑量-時間效應(yīng)關(guān)系

吡蟲啉每頭1.5~2.5 μg有效劑量處理后各試蟲出現(xiàn)中毒反應(yīng)的時間差異如圖2所示。各劑量處理中紅棕象甲幼蟲出現(xiàn)抖動狀態(tài)的個體比例均在24~36 h間達到最高，其中最高處理劑量（每頭2.5μg）的個體數(shù)量較最低劑量（每頭1.5 μg）的峰值高出30%，比例峰值出現(xiàn)時間提前12 h，并且在處理后24 h內(nèi)各處理中均呈現(xiàn)上升趨勢，之后下降并最終穩(wěn)定在10%左右。處理后出現(xiàn)口器持續(xù)大張狀態(tài)和體壁僵硬狀態(tài)的個體比例均在12~36 h間達到峰值，其中最高處理劑量（每頭2.5 μg）處理的峰值較最低劑量處理組（每頭1.5 μg）的峰值高出20%，峰值出現(xiàn)時間延后12 h。此狀態(tài)出現(xiàn)比例在各劑量處理后36 h均呈現(xiàn)上升趨勢，之后整體呈現(xiàn)起伏下降的趨勢。處理后體壁松軟狀態(tài)的個體比例除最高劑量（每頭2.5 μg）處理在84 h達到峰值，其他濃度均在36~48 h間達到峰值。處理后平衡感缺失后恢復狀態(tài)個體在12 h內(nèi)時較少，最高劑量（每頭2.5μg）處理組在所有時間內(nèi)均未恢復。在48 h后再次喂食對口器持續(xù)大張狀態(tài)以及平衡感缺失后恢復狀態(tài)有較大的影響。

圖2 相同劑量下不同時間各特異性狀態(tài)分析Fig.2 Analysis of each specific state under the same dosage at different time

呈現(xiàn)各中毒反應(yīng)的試蟲個體比例峰值與首次谷值的濃度-時間表如表3所示。從表中可知，在行為表現(xiàn)中，抖動、口器持續(xù)大張、體壁僵硬狀態(tài)在處理后峰值出現(xiàn)在24~36 h內(nèi)，且比例均高于60%，首次谷值均出現(xiàn)在36~60 h之間，且比例均為0；體壁松軟、平衡感缺失后恢復狀態(tài)在處理后峰值出現(xiàn)在36~48 h，且比例均為50%，首次谷值均出現(xiàn)在24~36 h，且比例均為0。

除口器持續(xù)大張狀態(tài)和體壁僵硬外，各特異性狀態(tài)的首次谷值出現(xiàn)的濃度與峰值濃度對應(yīng)相反；各特異性狀表現(xiàn)所占比隨時間的增長都出現(xiàn)了起伏式變化。

同時從表3和圖2中還可看出，在各相同時間不同劑量處理的紅棕象甲幼蟲的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)為：在處理12 h后各不同濃度平均占比中抖動狀態(tài)占比26%、體壁僵硬狀態(tài)占比30%、口器持續(xù)大張為狀態(tài)占比48%，這3個狀態(tài)都有明顯平均起始表現(xiàn)，占比都超過了25%，而體壁松軟狀態(tài)占比10%，平衡感缺失后恢復狀態(tài)占比8%，這兩個狀態(tài)的平均起始表現(xiàn)都沒有超過10%。處理后24~96 h各不同劑量平均占比中相較于12 h平均起始表現(xiàn)，抖動狀態(tài)占比低9%，口器持續(xù)大張狀態(tài)占比低15%，體壁僵硬占比低27%，體壁松軟占比高6%，平衡感缺失后恢復狀態(tài)占比高3%。

表3 呈現(xiàn)各狀態(tài)的試蟲個體比例峰值與首次谷值的劑量?時間表Table 3 Dosage?time table of the proportion of individuals with peak value and the first valley value in each state

2.4 吡蟲啉處理對紅棕象甲幼蟲二次取食情況影響

48 h后喂食相同劑量下不同時間的取食情況分析見圖3。結(jié)果表明，在除每頭2.25 μg有效激勵外，其它各劑量處理均在96 h達到峰值，其中各劑量處理無取食現(xiàn)象整體表現(xiàn)平穩(wěn)呈現(xiàn)隨時間的推移上升的趨勢；處理后極少取食現(xiàn)象整體表現(xiàn)低迷呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，整體穩(wěn)定在0~20%，最終該現(xiàn)象消失在96 h；處理后輕微取食現(xiàn)象整體表現(xiàn)呈現(xiàn)下降趨勢，除最高劑量每頭2.5 μg外其他劑量處理有較高的取食行為表現(xiàn)，并在72 h后僅有每頭1.5 μg處理有少量表現(xiàn)，最終逐漸消失；處理后少量取食現(xiàn)象整體表現(xiàn)明顯呈現(xiàn)起伏上升趨勢，每頭1.75~2.25 μg劑量處理組有較高的取食行為表現(xiàn)；處理后明顯取食現(xiàn)象整體表現(xiàn)起伏上升的趨勢，每頭1.5 μg處理組有較高的取食行為表現(xiàn)。

圖3 48 h再次喂食后相同劑量下不同時間的取食Fig.3 Analysis of feeding conditions at the same dosage at different times after 48h re-feeding

48 h喂食后各取食情況峰值與首次谷值的濃度與時間表如表4所示，結(jié)果表明，根據(jù)相同濃度下不同時間取食情況曲線走勢與喂食后各取食情況峰值與首次谷值比較可知在各取食情況中，無取食、極少取食、輕微取食、在中高劑量中表現(xiàn)明顯，其中又以最高劑量每頭2.5 μg的無取食狀態(tài)表現(xiàn)突出，峰值達到了90%；少量取食、明顯取食現(xiàn)象，在低劑量中表現(xiàn)明顯，其中又以最低劑量每頭1.5 μg處理組明顯取食現(xiàn)象表現(xiàn)突出，峰值達到了60%。除輕微取食現(xiàn)象外，各取食情況的峰值與首次谷值對應(yīng)相反，各取食情況的峰值表現(xiàn)的時間點都十分靠后，集中在84 h后；各取食情況的首次谷值表現(xiàn)的時間點都十分靠前，集中在60 h這個起始記錄時間點。

表4 48 h喂食后各取食情況峰值與首次谷值的劑量-時間表Table 4 Dosage?time tables of peak value and first valley value in each feeding situation after 48 hours of feeding

3 討論與結(jié)論

在經(jīng)口注高劑量（每頭25~500 μg）吡蟲啉后紅棕象甲大齡幼蟲平均會在11 min之內(nèi)喪失行動能力，并且隨著處理的有效劑量越高，蟲體會出現(xiàn)不同的耐受時間，從1~30 min不等，故而推測在高劑量出現(xiàn)不同的耐受時長與蟲體個體差異有關(guān)。而在每頭25 μg劑量下從注藥到喪失活動能力的時長穩(wěn)定在10~11 min的現(xiàn)象有待研究。吡蟲啉與煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）結(jié)合后，干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的刺激傳導，引起神經(jīng)通路的阻塞進而造成乙酰膽堿的蓄積，導致昆蟲麻痹并出現(xiàn)典型的中毒癥狀：異常興奮、痙攣、身體搖晃至衰竭死亡［16］。在經(jīng)過本次試驗的觀察中在經(jīng)口注射低濃度（每頭1.5~2.5 μg）吡蟲啉后紅棕象甲大齡幼蟲會在5 min內(nèi)會出現(xiàn)明顯的應(yīng)激反應(yīng)，最先出現(xiàn)的多是不同程度的蜷縮及體壁僵硬。隨后1 h內(nèi)能觀察到移動平衡能力下降，移動活力逐漸喪失，會有蟲體體壁僵硬與體壁松軟不斷反復的出現(xiàn)。處理后12 h內(nèi)，所有劑量下的蟲體都會出現(xiàn)排便失禁的情況并伴隨著嘔吐的發(fā)生。體壁僵硬狀態(tài)會在各劑量各時間段有明顯的表現(xiàn)，是吡蟲啉喂毒后最明顯的消極特異性狀態(tài)。在處理后出現(xiàn)的抖動、口器持續(xù)大張、體壁僵硬、體壁松軟、平衡感缺失后恢復等5種特異性狀態(tài)中，大部分表現(xiàn)與吡蟲啉的生物學作用及機制如阻斷昆蟲正常的神經(jīng)傳導，使昆蟲異常興奮，最終麻痹死亡相關(guān)。根據(jù)各特異性狀態(tài)的整體表現(xiàn)，我們不難觀察出各特異狀態(tài)占比不論是平穩(wěn)、上升還是下降始終表現(xiàn)出起伏式曲線，并且各特異性狀態(tài)同時交替反復出現(xiàn)。

喂食后會促進蟲體消化系統(tǒng)的功能運動。在大部分昆蟲中腸腸道內(nèi)存在圍食膜，圍食膜是半滲透性的，它可以允許營養(yǎng)物質(zhì)、消化酶和防御因子的通過，但會阻止腸道上皮細胞與腸道微生物和有毒物質(zhì)的直接接觸［17］。在本次試驗中48 h喂食后，口器持續(xù)大張狀態(tài)出現(xiàn)了較為明顯的減輕。同時可發(fā)現(xiàn)，喂食與否，于蟲體的抖動、口器持續(xù)大張、體壁僵硬、體壁松軟等消極特異性的表現(xiàn)強弱會根據(jù)劑量的高低呈現(xiàn)負相關(guān)性，劑量越高相關(guān)性越弱越不易受到進食的影響，劑量越低相關(guān)性越強越容易受到進食的影響而出現(xiàn)消極特異性狀態(tài)的減弱或消失。前人結(jié)果表明，昆蟲腸道是宿主與外部環(huán)境之間的重要交界面，棲息著大量的微生物［18］。腸道有益微生物參與宿主代謝，提供營養(yǎng)物質(zhì)［19］，參與有害物質(zhì)降解［20］。因此作者認為本研究中出現(xiàn)以上癥狀可能是因為喂食這一行為確實減輕了吡蟲啉施藥后的一些癥狀，但是并沒有讓所有的消極癥狀都有明顯的改善，說明在吡蟲啉施用后幼蟲進食與否，在其整體的應(yīng)激反應(yīng)來看影響不大。

蟲體體內(nèi)的解毒酶，主要是解毒或代謝各種異種物質(zhì)，在脂質(zhì)代謝中也起著重要的生理作用［21-22］。相關(guān)研究表明害蟲對煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性主要與害蟲解毒代謝酶活性增強有關(guān)，其中P450s的改變被認為是主要原因，如煙粉虱對吡蟲啉等煙堿類殺蟲劑的抗性，與具有解毒作用的細胞色素氧化酶P450的過量表達相關(guān)［23］。通過本試驗結(jié)果分析，紅棕象甲施用吡蟲啉后，整體上該蟲在各濃度的消極表現(xiàn)會隨著時間的增長而減輕，相對應(yīng)的積極影響也在同時隨時間的增長出現(xiàn)增加的趨勢。

目前，采用化學防治技術(shù)控制紅棕象甲，仍是治理紅棕象甲危害的重要且有效的應(yīng)急防控措施［24］。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)了紅棕象甲幼蟲對吡蟲啉的應(yīng)激反應(yīng)總體上與吡蟲啉的生物學作用與機制相關(guān)，并且在一定濃度下紅棕象甲幼蟲有一定的排毒解毒的恢復能力，相關(guān)研究結(jié)果對于紅棕象甲等鉆蛀性害蟲的防治以及樹干注射藥物的研發(fā)等具有一定的借鑒意義。