4種抑菌化合物影響杧果炭疽病菌漆酶的轉(zhuǎn)錄

譚晴 ，劉曉妹 ，張夢(mèng)婷 ，董玲玲 ，肖春麗 ，蒲金基 ，張賀 *

（1.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

杧果炭疽病是杧果生長(zhǎng)期和采后貯藏期危害最嚴(yán)重的病害之一，在世界杧果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生［1］，主要由半知菌類刺盤孢屬膠胞炭疽菌（Colletotri?chum gloeosporioides）所引起［2］，其寄主范圍廣，除杧果外，絕大部分亞熱帶、熱帶果樹，多種蔬菜、水果、花卉、經(jīng)濟(jì)林木和中草藥等都是其寄主。膠孢炭疽菌侵入寄主主要是通過(guò)其分生孢子萌發(fā)形成附著胞，黑化的附著胞會(huì)產(chǎn)生巨大的膨壓使得侵入釘能夠侵入寄主內(nèi)，從而在寄主內(nèi)擴(kuò)展蔓延，最終導(dǎo)致寄主發(fā)?。?］。杧果炭疽病的防治目前主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但其已對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈、噻菌靈產(chǎn)生了抗藥性［4-5］，對(duì)咪鮮胺也已表現(xiàn)出潛在的抗性風(fēng)險(xiǎn)［5-6］。對(duì)苯醚甲環(huán)唑也產(chǎn)生了耐藥性［2］?？梢娞矫鳀x果炭疽病致病機(jī)理和尋找新的防治靶標(biāo)顯得尤為重要，如茶多酚、白藜蘆醇和丁香酚對(duì)膠孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)有較好的抑制作用［7-10］。

漆酶（Laccases，p-benzenediol： dioxygenoxido?reductases，EC 1.10.3.2，lac），是一種含有金屬銅離子的多酚氧化酶［11-12］，能催化各種芳香基化合物的單電子氧化，同時(shí)伴隨著氧氣還原為水［13］。漆酶以非等位多基因家族的形式存在于基因組中，編碼具有不同作用的多酚氧化酶同工酶。在同種病原菌中，不同漆酶基因家族成員的功能也存在一定的差異，并不是所有的漆酶基因在植物病原菌中都發(fā)揮與致病相關(guān)的作用［14］。漆酶可作為潛在的抑菌化合物靶標(biāo)，致病真菌馬爾尼菲籃狀菌（Talaromy?ces marneffei）漆酶基因和致病真菌新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）漆酶基因lac1被敲除后都對(duì)抑菌化合物敏感性增加，所以漆酶被認(rèn)為是潛在的抑菌化合物靶標(biāo)［15-17］，不同漆酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控不盡相同。漆酶基因家族成員在同一物種中具有不同的表達(dá)水平，糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）的12個(gè)漆酶中l(wèi)acc2和lacc10是漆酶活性的主要來(lái)源［18］。漆酶基因的表達(dá)具有明顯的組織差異性，香菇10個(gè)漆酶基因在不同的發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在明顯差異［19］。漆酶家族基因的表達(dá)受到營(yíng)養(yǎng)條件及外源性物質(zhì)的誘導(dǎo)。

作者前期在杧果炭疽病菌中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)漆酶基因［20］，本研究通過(guò)開展測(cè)定4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)、附著胞形成及對(duì)黑色素合成的影響，同時(shí)測(cè)定這4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌漆酶家族13個(gè)成員的表達(dá)影響及對(duì)漆酶酶活的影響，旨在為尋求杧果炭疽病菌抑菌化合物提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

杧果炭疽病菌（C.gloeosporioides）A2菌株，由實(shí)驗(yàn)室提供，試管斜面保存。

1.1.2 供試試劑

98%白藜蘆醇和98.5%丁香酚購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，98%茶多酚和98%氟康唑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，99.9%二甲基亞砜（DMSO）為國(guó)產(chǎn)分析純。漆酶酶活性試劑盒來(lái)源于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。SuperReal Pre?Mix Plus （SYBR Green）、FastKing RTKit來(lái)源于Tiangen。植物RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均來(lái)源于TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 4種抑菌化合物對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。將新鮮菌餅接入終濃度為 10 000、5000、2500、1250、625、0 mg·L-1茶多酚，終濃度為6055、3027、1514、757、378、0 mg·L-1白藜蘆醇，終濃度為 657、328、164、82、41、0 mg·L-1的 丁 香 酚 及 終 濃 度 為 3063、1531、766、383、191、0 mg·L-1的氟康唑的PDA平板上，以不含藥劑的PDA平板作對(duì)照。對(duì)溶于水的抑菌化合物以滅菌無(wú)菌水進(jìn)行配置，對(duì)照為等量無(wú)菌水，對(duì)不溶于水的其余抑菌化合物用二甲基亞砜溶解，相應(yīng)對(duì)照用等量二甲基亞砜代替，每處理重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。用Excel作圖分析，以濃度對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)，抑菌率的機(jī)率值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，求得各抑菌化合物對(duì)杧果膠孢炭菌病菌的毒力回歸方程、EC50和R2［21］，確定 4種抑菌化合物對(duì)供試菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.2 4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響

參照董玲玲等［20］的方法，配置各抑菌化合物母液，用終濃度為 100 mg·L-1的茶多酚、168 mg·L-1的白藜蘆醇、164 mg·L-1丁香酚和 306 mg·L-1氟康唑處理分生孢子并使分生孢子終濃度為5×105個(gè)·L-1進(jìn)行混勻。以分生孢子芽管長(zhǎng)度超過(guò)分生孢子直徑的1/2為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，附著胞完全黑化為附著胞形成標(biāo)準(zhǔn)［22］，6 h開始測(cè)定各處理對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，12 h開始測(cè)定各處理對(duì)附著胞形成的影響。

1.2.3 4種抑菌化合物對(duì)病菌黑色素形成的影響

根據(jù)各抑菌化合物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC50測(cè)定各處理對(duì)供試菌株黑色素合成的影響。將供試菌株分別接種在終濃度為 15 010、1 109.88、308.26、163.52 mg·L-1的茶多酚、白藜蘆醇、丁香酚和氟康唑 PDA 平板上，28 ℃培養(yǎng) 10 d，參照 Wei等［23］的方法，提取各處理等質(zhì)量菌絲體的胞內(nèi)黑色素。

1.2.4 抑菌化合物對(duì)病菌漆酶基因家族成員相對(duì)表達(dá)量的影響

參考董玲玲等［20］的方法，取1 mL分生孢子懸浮液加入終濃度為100 mg·L-1的茶多酚，168 mg·L-1的白藜蘆醇、164 mg·L-1的丁香酚和 306 mg·L-1的氟康唑的PD培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1搖培1 d后取菌絲提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參考肖春麗等［24］委托北京六合華大基因公司合成表1引物并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA［24］。

表1 用于炭疽病菌漆酶基因家族成員的定量引物［24］Table 1 Primers for quantification of laccase gene family members of Colletotrichum gloeosporioides

1.2.5 抑菌化合物對(duì)病菌胞外漆酶活性的作用

參照董玲玲等［20］的方法，第10天是胞外酶活產(chǎn)漆酶高峰期，因此將第10 d的培養(yǎng)液12 000xg離心10 min，離心后棄沉淀，所得上清即為胞外粗漆酶。后續(xù)按照漆酶酶活試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種外源抑菌化合物對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，杧果炭疽病菌在不同抑菌化合物不同濃度處理下，4種抑菌化合物對(duì)菌絲的生長(zhǎng)都起到顯著的抑制作用，隨著濃度升高，抑制菌絲生長(zhǎng)越顯著（圖1）。根據(jù)表2，4種抑菌化合物的EC50值中茶多酚最大，其次為白藜蘆醇、丁香酚和氟康唑，其 EC50值依次為 15 010、1 109.88、308.26、163.52 mg·L-1。根據(jù)回歸方程中斜率分析來(lái)看，杧果炭疽病菌對(duì)丁香酚最敏感，其次分別為白藜蘆醇、茶多酚，最后為氟康唑。綜合上述，3種酚類抑菌化合物的抑菌效果顯著且敏感，而咪唑類化合物氟康唑EC50值雖較低，但病原菌對(duì)其敏感度較低。

圖1 4種抑菌化合物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of four antibacterial compounds on mycelium growth

表2 4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of four antibacterial compounds on Colletotrichum gloeosporioides

2.2 4種外源抑菌化合物對(duì)病菌黑色素含量的影響

與對(duì)照組相比，茶多酚和白藜蘆醇的胞內(nèi)黑色素含量均顯著下降7%（圖2）。而丁香酚和氟康唑的胞內(nèi)黑色素含量均較對(duì)照顯著增加，其中丁香酚增加了3.3%，而氟康唑增加了18.5%。表明這4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌黑色素合成的影響程度差異顯著。

圖2 4種抑菌化合物對(duì)黑色素含量的影響Fig.2 Effect of four antibacterial compounds on melanin content

2.3 4種抑菌化合物對(duì)分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響

通過(guò)觀察分生孢子萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)（圖3），茶多酚、白藜蘆醇、丁香酚和氟康唑都較對(duì)照組顯著促進(jìn)分生孢子萌發(fā)。相比于對(duì)照，茶多酚促進(jìn)了28.3%的孢子萌發(fā)，白藜蘆醇促進(jìn)了12.0%的孢子萌發(fā)，丁香酚促進(jìn)了26.0%的孢子萌發(fā)，氟康唑促進(jìn)了18.6%的孢子萌發(fā)。相反，在附著胞形成方面，這4種化合物都出現(xiàn)了顯著的抑制作用。相比于對(duì)照組，茶多酚抑制了50.3%的附著胞形成，白藜蘆醇抑制了28.4%附著胞形成，丁香酚抑制了54.9%附著胞形成，氟康唑抑制了38.0%附著胞形成。表明這4種抑菌化合物都能對(duì)分生孢子萌發(fā)起促進(jìn)作用，但對(duì)附著胞的形成有抑制作用。

圖3 4種抑菌化合物對(duì)分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響Fig.3 Effects of four antibacterial compounds on conidial germina?tion and appressorium formation

2.4 4種抑菌化合物對(duì)病菌漆酶家族成員表達(dá)的影響

通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)（圖4），與對(duì)照組相比，茶多酚和白藜蘆醇都對(duì)約15%的家族成員的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用，丁香酚和氟康唑都對(duì)約23%的家族成員的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用。茶多酚對(duì)Cglac6、Cglac11的相對(duì)表達(dá)量起抑制作用，相比于對(duì)照，Cglac6的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)62.6%，Cglac11的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了49.0%。白藜蘆醇對(duì)Cglac11、Cglac13的相對(duì)表達(dá)量起抑制作用，相比于對(duì)照，Cglac11的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)82.3%，Cglac13的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了76.8%。丁香酚對(duì)Cglac4、Cglac5、Cglac13的相對(duì)表達(dá)量起抑制作用，相比于對(duì)照，Cglac4的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)94.2%，Cglac5的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了94.9%，Cglac13的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)99.9%。氟康唑?qū)glac4、Cglac9、Cglac13的相對(duì)表達(dá)量起抑制作用，相比于對(duì)照，Cglac4的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)71.2%，Cglac9的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了65.7%，Cglac13的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)99.9%?？傊?，各處理對(duì)杧果炭疽病菌漆酶家族成員各基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有所差異。

圖4 4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌漆酶家族成員表達(dá)的影響Fig.4 Effects of four antibacterial compounds on the expression of laccase family members of Colletotrichum gloeosporioides

2.5 4種抑菌化合物對(duì)病菌相對(duì)胞外漆酶酶活的作用

結(jié)果表明（圖5），杧果炭疽病菌胞外漆酶酶活受茶多酚、白藜蘆醇、丁香酚和氟康唑影響顯著，與對(duì)照組相比茶多酚抑制了96%的酶活，白藜蘆醇抑制了67%的酶活，丁香酚抑制了84%的酶活，氟康唑抑制了17%的酶活；茶多酚、白藜蘆醇和丁香酚對(duì)漆酶的抑制效果均高于氟康唑。

圖5 4種抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌相對(duì)胞外漆酶酶活的作用Fig.5 Effects of four antibacterial compounds on the activity of ex?tracellular laccase of anthrax bacteria from Colletotrichum gloeosporioides

3 討論

茶多酚對(duì)多種刺盤孢屬病原菌的抑制中濃度均在3000~50 000 mg·L-1之間，其中對(duì)茶炭疽病菌的抑制效果最好，對(duì)梨炭疽病菌的抑制效果相對(duì)較差［7］；茶多酚抑制八角炭疽病菌的EC50值為12 840 mg·L-1［8］。而本文中茶多酚對(duì)杧果炭疽病菌的 EC50為15 010 mg·L-1，低于多個(gè)刺盤孢屬成員，高于八角炭疽病菌。茶多酚濃度為10 000 mg·L-1時(shí)，對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)抑制率為20.50%，對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率為 23.33%［25］；濃度為 2000 mg·L-1和3330 mg·L-1的茶多酚處理稻瘟菌的分生孢子，分生孢子雖能萌發(fā)，但芽管的伸長(zhǎng)受到限制從而起到抑菌作用，而濃度 5000 mg·L-1和 10 000 mg·L-1的茶多酚處理稻瘟菌分生孢子，分生孢子不能萌發(fā)、會(huì)破裂，且菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)100%，起到殺菌作用［26］；而本試驗(yàn)中使用 100 mg·L-1的茶多酚濃度處理分生孢子，雖起到了促進(jìn)分生孢子萌發(fā)的現(xiàn)象，但抑制附著胞的形成。白藜蘆醇對(duì)草莓膠孢炭疽菌的 EC50值 為 3200 mg·L-1［9］，10 mg·L-1和 50 mg·L-1的白藜蘆醇能顯著抑制灰葡萄孢菌的分生孢子萌發(fā)，200 mg·L-1的白藜蘆醇對(duì)4株灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為18.4%~38.1%［27］，而本文中測(cè)定的168 mg·L-1的白藜蘆醇促進(jìn)了12.0%的分生孢子萌發(fā)、抑制附著胞的形成，菌絲生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)，白藜蘆醇濃度為1 109.88 mg·L-1。何庭玉等［10］表明丁香油中的丁香酚對(duì)杧果炭疽病菌有抑菌效果且與丁香酚含量成正比，與本文研究的結(jié)果一致，且本試驗(yàn)所測(cè)得的 EC50為 308.26 mg·L-1。王江來(lái)等［28］表明，丁香酚對(duì)腐皮鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)均有抑制作用，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果中，丁香酚對(duì)杧果炭疽病菌分生孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，表明，同種化合物對(duì)不同病原菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)存在差異。

在漆酶家族基因表達(dá)分析中茶多酚和白藜蘆醇均對(duì)15%家族成員的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用，丁香酚和氟康唑分別抑制30%和23%家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且都對(duì)漆酶基因CgLac4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有顯著抑制作用。在作者前期研究［20］，已測(cè)定Fe2+等不同離子和肉桂酸等有機(jī)物對(duì)杧果炭疽病菌漆酶家族成員表達(dá)的影響，其中Fe2+等13種離子以及半胱氨酸、對(duì)甲氧基苯胺、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸和香草酸等都對(duì)杧果炭疽病菌胞外漆酶活性起抑制作用。本試驗(yàn)中的茶多酚、白藜蘆醇、丁香酚和氟康唑所測(cè)定的濃度中均起抑制作用。白藜蘆醇在玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）中會(huì)抑制漆酶基因Stlac1的表達(dá)［25］，茶多酚、丁香酚和氟康唑?qū)x果炭疽病菌的調(diào)控作用屬于本文首次報(bào)道。這說(shuō)明通過(guò)添加外源的離子、酚類可以起到抑制病原菌漆酶活性的作用，具有一定的田間應(yīng)用潛力，可以與化學(xué)藥劑共同施用，增加病害的防治效果。

病原菌附著胞侵入寄主需要黑色素產(chǎn)生巨大的膨壓才能進(jìn)行，DHN黑色素前體分子需要漆酶參與將其轉(zhuǎn)變?yōu)镈HN自由基，再經(jīng)分子間交聯(lián)聚合形成DHN黑色素［26］。這4種化合物都顯著抑制漆酶酶活，并且茶多酚和白藜蘆醇都顯著抑制了菌絲中黑色素含量，與試驗(yàn)結(jié)果一致。然而，丁香酚和氟康唑雖對(duì)漆酶酶活有抑制，反而卻促進(jìn)了黑色素合成，丁香酚和氟康唑的EC50值都小于茶多酚和白藜蘆醇，表明同樣抑菌效果下，所需丁香酚和氟康唑的濃度都低于茶多酚和白藜蘆醇的濃度。雖然丁香酚和氟康唑雖促進(jìn)黑色素形成，但在菌絲生長(zhǎng)方面卻有好的抑制作用，而白藜蘆醇雖抑制酶活和黑色素含量，但其抑菌效果沒(méi)有丁香酚和氟康唑好，在灰葡萄孢侵染過(guò)程中，其漆酶可以將植物分泌的植保素白藜蘆醇氧化成維尼非林（viniferin）［27］，且致病性強(qiáng)弱與病菌的漆酶酶活有關(guān)。由于漆酶底物廣泛性和同工酶復(fù)雜性，其底物多為次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有數(shù)量多、含量少、鑒定困難等特點(diǎn)，從而導(dǎo)致對(duì)漆酶生物功能的解析多停留在表型分析，也導(dǎo)致研究困難［28］。

4 結(jié)論

本文測(cè)試了4種外源抑菌化合物對(duì)杧果炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)，分生孢子萌發(fā)與附著胞形成、黑色素含量、對(duì)家族成員轉(zhuǎn)錄的影響以及對(duì)漆酶酶活的影響。在菌絲生長(zhǎng)中，丁香酚的有效中濃度較低且病原菌對(duì)其最敏感，氟康唑的有效中濃度最低，這2個(gè)抑菌化合物都抑制附著胞的形成和胞外酶活性，同時(shí)也對(duì)漆酶基因Cglac4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有顯著抑制作用。后續(xù)將進(jìn)一步研究這2個(gè)抑菌化合物與漆酶基因Cglac4的關(guān)系，為尋找杧果膠孢炭疽病菌漆酶基因Cglac4的抑菌化合物提供參考。