神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3-殼聚糖載體對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)皮層損傷后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和運(yùn)動(dòng)功能的效果

楊飛祥，張皚峰，郝鵬，尚俊奎，段紅梅，楊朝陽,3，李曉光,3

·基礎(chǔ)研究·

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3-殼聚糖載體對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)皮層損傷后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和運(yùn)動(dòng)功能的效果

楊飛祥1，張皚峰2，郝鵬1，尚俊奎1，段紅梅1，楊朝陽1,3，李曉光1,3

目的觀察神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3)-殼聚糖載體對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)皮層損傷后的前肢行為學(xué)功能恢復(fù)的效果，并檢測(cè)其對(duì)損傷區(qū)及側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖和分化的影響。方法65只Wistar大鼠分為正常對(duì)照組(n=7)、單純損傷組(n=29)和NT3-殼聚糖組(n=29)。制作大鼠運(yùn)動(dòng)皮層吸除損傷性腦損傷模型。NT3-殼聚糖組于手術(shù)后立即植入NT3-殼聚糖載體，單純損傷組不給予任何治療措施。分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d、1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月，應(yīng)用食物球抓取實(shí)驗(yàn)觀察大鼠前肢功能恢復(fù)情況，應(yīng)用HE染色觀察損傷區(qū)的空腔體積，應(yīng)用免疫熒光染色評(píng)價(jià)NSCs的增殖和分化。結(jié)果NT3-殼聚糖組右側(cè)前肢抓取成功率高于單純損傷組右側(cè)(F＞6.00,P≤0.05)。NT3-殼聚糖組空腔體積均顯著小于單純損傷組(F＞629.5,P＜0.001)。在NSCs分化實(shí)驗(yàn)中，NT3-殼聚糖組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)BrdU細(xì)胞數(shù)均顯著高于單純損傷組(F＞171.43,P＜0.001)。在NSCs增殖實(shí)驗(yàn)中，NT3-殼聚糖組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對(duì)照組和單純損傷組(F＞155.06,P＜0.001)，術(shù)后7 d損傷同側(cè)Dcx陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于單純損傷組(F=62.367,P＜0.001)，BrdU/Dcx雙陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(F=33.527,P＜0.001)。結(jié)論NT3-殼聚糖載體可增加腦損傷所致的側(cè)腦室下區(qū)NSCs的增殖，促進(jìn)損傷區(qū)新生神經(jīng)元的發(fā)生以及大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3；殼聚糖；內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生；運(yùn)動(dòng)功能；大鼠

[本文著錄格式]楊飛祥，張皚峰，郝鵬，等.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3-殼聚糖載體對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)皮層損傷后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和運(yùn)動(dòng)功能的效果[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(2):155-161.

CITED AS:Yang FX,Zhang AF,Hao P,et al.Effect of neurotrophin 3-chitosan on endogenous neurogenesis and motor function after motor cortex injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(2):155-161.

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種常見的外力引起的神經(jīng)外科疾病，其治療方法對(duì)神經(jīng)外科醫(yī)生而言是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)[1]。大腦受到損傷后，由于猛烈的外力撞擊，損傷中心和周圍腦組織會(huì)發(fā)生壞死，同時(shí)伴有重要生理功能神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致其所調(diào)控的運(yùn)動(dòng)功能障礙和意識(shí)缺失[2]。隨著損傷區(qū)周圍組織和細(xì)胞丟失，會(huì)引起繼發(fā)性損傷，如缺血、水腫、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放和炎癥反應(yīng)等[3]，而損傷后興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、炎癥因子的浸潤(rùn)和膠質(zhì)瘢痕的形成等損傷微環(huán)境都不利于神經(jīng)發(fā)生。

大腦皮層是一個(gè)包含幾十種神經(jīng)元類型的復(fù)雜細(xì)胞集合區(qū)，與大腦的其余區(qū)域密切聯(lián)系，從而對(duì)身體形成多樣化和精細(xì)的調(diào)控[4]。研究表明，成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)仍然存在持續(xù)神經(jīng)發(fā)生的區(qū)域，如嗅球(olfactory bulb,OB)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)[5]。在腦內(nèi)的側(cè)腦室下區(qū)[6]、海馬齒狀回下區(qū)[7]和脊髓的中央管[8]等也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)，在腦內(nèi)發(fā)揮著重要作用。隨著腦內(nèi)NSCs的發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生為治療腦損傷提供了新的思路，成為非常有前景的一種治療方法。

本課題組既往研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neurotrophin 3,NT3)-殼聚糖載體可以在生理狀態(tài)下緩慢釋放NT3長(zhǎng)達(dá)14周[9]，并通過激活TrkC受體促進(jìn)NSCs的增殖，提高神經(jīng)元分化的比例[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，NT3-殼聚糖載體能夠激活大鼠完全性脊髓橫斷后脊髓內(nèi)源性NSCs，誘導(dǎo)其分化成功能性神經(jīng)元并與宿主脊髓建立功能性神經(jīng)環(huán)路，最終導(dǎo)致截癱后功能的恢復(fù)，是迄今為止最接近臨床應(yīng)用的治療脊髓損傷的方法[11]。應(yīng)用加權(quán)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析方法(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)分析也顯示，NT3-殼聚糖載體對(duì)增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生、減少炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用[12]。

在腦損傷方面，既往研究發(fā)現(xiàn)，NT3-殼聚糖載體可以促進(jìn)海馬CA1區(qū)損傷后核因子(nuclear factor,NF)陽性細(xì)胞和軸突的產(chǎn)生，進(jìn)而提高大鼠認(rèn)知功能[13]。海馬CA1區(qū)以上皮質(zhì)主要包括聯(lián)絡(luò)皮質(zhì)和一小部分次級(jí)感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)，目前沒有方法檢測(cè)該皮質(zhì)損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，因此制備大鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)損傷并觀察功能恢復(fù)非常重要。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自制腦吸除裝置制作成年Wistar雌性大鼠運(yùn)動(dòng)皮層吸除性腦損傷模型，根據(jù)在損傷區(qū)是否移植NT3-殼聚糖載體，分為單純損傷組和NT3-殼聚糖組，同時(shí)設(shè)有正常對(duì)照組。免疫熒光染色觀察損傷區(qū)和側(cè)腦室下區(qū)NSCs的增殖和分化以研究?jī)?nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，食物抓取行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠前肢功能恢復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組

65只成年Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量220 g，SPF級(jí)，首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，許可證號(hào)SYXK (京)2013-0004。所有動(dòng)物分為正常對(duì)照組(n=7)、單純損傷組(n=29)和NT3-殼聚糖組(n=29)。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)倫理委員會(huì)審批，并按照首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 模型制備

采用自制的腦吸除裝置制備成年大鼠吸除性腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷模型。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮后沿中線切開皮膚及皮下組織，暴露顱骨，確定前囟位置并標(biāo)記。以前囟-0.5～+1.5 mm，左旁開1～3 mm為標(biāo)記，用牙科鉆鉆開一個(gè)2×2 mm大小的骨窗，注意不要損傷硬腦膜。手術(shù)顯微鏡下切開硬腦膜，應(yīng)用自制的腦吸除裝置吸除左側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層，吸除深度1 mm，吸除腦組織體積為2×2×1 mm。

NT3-殼聚糖組于手術(shù)后立即植入NT3-殼聚糖載體，單純損傷組不給予任何治療措施。術(shù)后縫合皮膚，碘伏消毒傷口，于溫暖環(huán)境中待大鼠蘇醒，給予食水。術(shù)后第1天腹腔注射青霉素10萬U/次，每天1次，連續(xù)注射7 d。

1.3 內(nèi)源性NSCs標(biāo)記

單純損傷組和NT3-殼聚糖組取各取9只大鼠分別于3 d、7 d和14 d取材3只，正常對(duì)照組取3只于7 d取材，取材前7 d開始腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2?-deoxyuridine,BrdU)100 mg/kg，每天注射1次，連續(xù)注射7 d，來觀察NSCs增殖情況。

單純損傷組和NT3-殼聚糖組各取20只大鼠術(shù)后立即開始腹腔注射BrdU 100 mg/kg，每天注射1次，連續(xù)注射7 d，分別于7 d、14 d、1個(gè)月、2個(gè)月各取材3只，來觀察NSCs分化情況。剩余大鼠備用。

1.4 動(dòng)物灌流和組織標(biāo)本處理

6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水沖洗血管，4%多聚甲醛灌流固定，小心取出腦組織，置于4%多聚甲醛于4℃冰箱固定過夜。30%蔗糖脫水1周。取出脫水后的大腦，可以看到皮層損傷區(qū)，應(yīng)用大鼠腦模具對(duì)大腦修塊，取以損傷區(qū)為中心，前后各1 mm大腦組織塊，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度30 μm，均勻分成六套，每套10個(gè)切片，-20℃冰箱保存。

1.5 HE染色

取出一套冰凍切片，室溫復(fù)溫0.5 h；蒸餾水搖床浸潤(rùn)2 min，共2次；蘇木素10 min，蒸餾水清洗；1%鹽酸酒精分化15 s，自來水返藍(lán)8 min，蒸餾水清洗；伊紅1 min，蒸餾水清洗；75%乙醇2 min，80%乙醇2 min，90%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇2 min，共2次；二甲苯Ⅰ2 min，二甲苯Ⅱ2 min；中性樹膠封片，通風(fēng)櫥晾干，顯微鏡觀察攝片，Image-Pro Plus 6.0軟件分別于7 d、1個(gè)月、3個(gè)月測(cè)量損傷區(qū)空腔體積。

1.6 免疫熒光染色和試劑

選取各組術(shù)后3 d、7 d、14 d、1個(gè)月和2個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的一套腦組織切片，一抗4℃孵育60 h，二抗常溫避光孵育8 h，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI，1∶3000)，室溫繼續(xù)孵育5 min，50%甘油磷酸緩沖液(phosphate buffer, PB)封片，熒光顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6.0軟件照相并計(jì)數(shù)。

小鼠抗BrdU(1∶200)：SIGMA公司。兔抗Nestin (1∶100)：SIGMA公司。兔抗Tuj-1(1∶500)：MILLIPORE公司。兔抗Dcx(1∶200)：SIGMA公司。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗(1∶200)、Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(1∶200)：INVITROGEN。

1.7 食物球抓取行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

手術(shù)前2周各組取4只大鼠進(jìn)行食物抓取訓(xùn)練，訓(xùn)練開始前1 d禁食，以后定量喂食。將食物球(質(zhì)量100～125 mg、直徑0.2～0.3 mm)放置測(cè)試盒(無蓋玻璃盒，45×18×38 cm，前端玻璃面中間有1 cm縫)前段的食物架上兩個(gè)圓孔內(nèi)，大鼠前肢可以通過中間縫抓取圓孔內(nèi)的食物球，手動(dòng)訓(xùn)練大鼠來抓食物球。每天每只大鼠抓取20個(gè)食物球后放回籠子，定量喂食(25～30)g/d。一般2周后，大鼠前肢抓取動(dòng)作熟練，此時(shí)，測(cè)定4只正常大鼠左前肢和右前肢一次成功抓取20個(gè)食物球的成功率，作為基準(zhǔn)。然后進(jìn)行皮層損傷手術(shù)，并于3 d、7 d、14 d，1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月時(shí)間點(diǎn)取單純損傷組和NT3-殼聚糖組各4只進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有的數(shù)據(jù)均以(±s)表示。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食物球抓取成功率

正常對(duì)照組大鼠兩側(cè)前肢的食物抓取成功率為60%，左右側(cè)前肢無明顯差異。單純損傷組右側(cè)前肢術(shù)后3 d的抓取成功率小于5%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抓取成功率逐漸升高，最高達(dá)18.75%。術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月，NT3-殼聚糖組右側(cè)前肢抓取成功率高于單純損傷組右側(cè)(P≤0.05)。

2.2 空腔體積

術(shù)后7 d、1個(gè)月、3個(gè)月，NT3-殼聚糖組還能看到未降解的NT3-殼聚糖載體，且損傷區(qū)內(nèi)填充有大量的再生腦組織，NT3-殼聚糖組空腔體積均顯著小于單純損傷組(P＜0.001)。見圖1、表2。

2.3 NSCs分化情況

NT3-殼聚糖組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)BrdU細(xì)胞數(shù)均顯著高于單純損傷組(P＜0.001)。見圖2A、2B，表3。為了明確這些增殖細(xì)胞的類型，我們進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記。術(shù)后14 d，NT3-殼聚糖組損傷區(qū)內(nèi)檢測(cè)到大量Nestin陽性細(xì)胞，其中有與BrdU共標(biāo)記(圖2C、2D)。術(shù)后1個(gè)月，相比單純損傷組，NT3-殼聚糖組大鼠的損傷區(qū)可檢測(cè)到更多的Tuj1陽性神經(jīng)元，其中有與BrdU共標(biāo)記(圖2E、2F)。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)食物球成功抓取率比較(%)

圖1 術(shù)后7 d單純損傷組和NT3-殼聚糖組損傷區(qū)空腔體積(HE染色)

圖2 各組大腦切片損傷區(qū)免疫熒光染色

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)空腔體積比較(mm3)

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)BrdU細(xì)胞數(shù)(/mm3)

2.4 NSCs增殖情況

正常對(duì)照組BrdU陽性細(xì)胞分布比較稀疏。NT3-殼聚糖組BrdU陽性細(xì)胞于術(shù)后3 d開始增多，術(shù)后7 d達(dá)到高峰(P＜0.001)，且顯著高于正常對(duì)照組和單純損傷組(P＜0.001)。術(shù)后14 d仍維持在較高水平(P＜0.05)。見表4、圖3。

圖3 各組術(shù)后7 d大腦切片側(cè)腦室下區(qū)BrdU免疫熒光染色(bar=200 μm)

圖4 各組術(shù)后7 d大腦切片側(cè)腦室下區(qū)BrdU(紅色)/Dcx(綠色)免疫熒光染色(bar=40 μm)

NT3-殼聚糖組術(shù)后7 d損傷同側(cè)Dcx陽性細(xì)胞(168.250±14.014)/mm3顯著高于單純損傷組(98.345± 7.250)/mm3(F=62.367,P＜0.001)，且NT3-殼聚糖組BrdU/Dcx雙陽性細(xì)胞數(shù)(104.470±17.084)相比正常對(duì)照組(30.840±2.653)顯著增加(F=33.527,P＜0.001)。見圖4。

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)BrdU細(xì)胞數(shù)(/mm3)

3 討論

目前研究表明，腦內(nèi)不僅存在NSCs，而且神經(jīng)發(fā)生貫穿整個(gè)生命周期[14]。應(yīng)用組織工程學(xué)方法，通過緩慢釋放支持再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，創(chuàng)造有利于自我修復(fù)的微環(huán)境，進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，成為治療中樞神經(jīng)損傷的新策略，這種策略是修復(fù)神經(jīng)損傷最理想的辦法。

前期研究證明，NT3-殼聚糖載體可促進(jìn)脊髓[15]和海馬[16]損傷后的神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù)，激活內(nèi)源性NSCs，促進(jìn)成熟神經(jīng)元產(chǎn)生，和宿主形成功能性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。本研究基于此治療策略來治療大腦皮層損傷，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)大鼠行為學(xué)恢復(fù)，并增強(qiáng)損傷區(qū)和側(cè)腦室下區(qū)NSCs的增殖和分化。研究表明，運(yùn)動(dòng)皮層損傷會(huì)激活側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回下區(qū)的NSCs增殖，部分激活的NSCs會(huì)異位遷移到損傷皮層，但大多分化成膠質(zhì)細(xì)胞，很少向神經(jīng)元分化[17-18]。在本研究中，將NT3和殼聚糖通過氫鍵作用連接一起，可實(shí)現(xiàn)在生理狀態(tài)下的長(zhǎng)期緩慢釋放NT3，長(zhǎng)達(dá)14周〔可溶性NT3在常溫下半衰期是(1.28±0.07)min〕，從而改善損傷區(qū)局部惡劣的炎癥微環(huán)境，一方面減輕繼發(fā)性損傷所帶來的傷害，另一方面能夠保護(hù)新生的神經(jīng)組織，繼而促進(jìn)內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生[15]。

在食物球抓取行為學(xué)試驗(yàn)中，術(shù)后損傷對(duì)側(cè)前肢抓取成功率明顯降低，證明TBI手術(shù)成功，運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)吸除后可引起大鼠損傷對(duì)側(cè)前肢的運(yùn)動(dòng)功能障礙。雖然隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，單純損傷組大鼠損傷對(duì)側(cè)前肢的功能有自發(fā)性恢復(fù)傾向，但食物抓取成功率并未達(dá)正常對(duì)照組水平。NT3-殼聚糖組大鼠在術(shù)后短時(shí)間內(nèi)前肢的運(yùn)功功能無明顯改善，可能與新生神經(jīng)元數(shù)量較少和新生神經(jīng)元尚不成熟有關(guān)。在2～3個(gè)月期間內(nèi)NT3-殼聚糖組比單純損傷組成功率高，說明NT3-殼聚糖可以改善運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)損傷所致的大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能下降。

本研究采用HE染色觀察術(shù)后NT3-殼聚糖組和單純損傷組空腔體積的差異。與單純損傷組相比，NT3-殼聚糖組空腔體積明顯減小，并且損傷區(qū)內(nèi)填充有大量的再生腦組織。說明大鼠行為學(xué)功能的恢復(fù)可能與NT3-殼聚糖減少損傷區(qū)空腔體積，并促進(jìn)腦組織再生有關(guān)。為了明確這些增殖細(xì)胞的類型，我們進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記。術(shù)后14 d，NT3-殼聚糖組損傷區(qū)內(nèi)檢測(cè)到大量Nestin陽性細(xì)胞，其中有與BrdU共標(biāo)記，說明這些細(xì)胞是損傷后新生的，NT3-殼聚糖可以激活內(nèi)源性NSCs，并促進(jìn)它們向損傷區(qū)的遷移。術(shù)后1個(gè)月，NT3-殼聚糖組大鼠的損傷區(qū)可檢測(cè)到Tuj1陽性神經(jīng)元，其中有與BrdU共標(biāo)記，說明遷移至損傷的NSCs可以分化為神經(jīng)元，NT3-殼聚糖促進(jìn)TBI后的神經(jīng)發(fā)生。

損傷區(qū)內(nèi)檢測(cè)到的新生神經(jīng)元可能來源于前腦神經(jīng)發(fā)生區(qū)側(cè)腦室下區(qū)的NSCs。因此我們檢測(cè)損傷后NT3-殼聚糖載體對(duì)側(cè)腦室下區(qū)NSCs的影響。正常對(duì)照組大鼠側(cè)腦室下區(qū)檢測(cè)到少量的BrdU陽性細(xì)胞，細(xì)胞分布比較稀疏。我們?cè)贜T3-殼聚糖組的損傷側(cè)側(cè)腦室下區(qū)觀察到增生細(xì)胞增多。

Dcx是遷移細(xì)胞的標(biāo)記物，應(yīng)用BrdU和Dcx的免疫熒光雙標(biāo)記可以觀察并定量遷移的NSCs。NT3-殼聚糖組術(shù)后7 d損傷同側(cè)Dcx陽性細(xì)胞顯著增多，并且NT3-殼聚糖組BrdU/Dcx雙陽性細(xì)胞數(shù)相比正常對(duì)照組顯著增加。這一結(jié)果說明，NT3-殼聚糖載體增加側(cè)腦室下區(qū)新生NSCs的數(shù)量。

遷移到損傷區(qū)的NSCs可能是來自于側(cè)腦室下區(qū)或海馬齒狀回下區(qū)，也可能來自于新皮層存在的NSCs[17]。研究表明，缺血性腦損傷模型中，損傷區(qū)用sox2和Nestin來標(biāo)記NSCs，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的細(xì)胞，表明這些細(xì)胞可能來自于損傷區(qū)皮層激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞[19]。在本研究中，損傷區(qū)的NSCs可能來自于側(cè)腦室下區(qū)，因?yàn)閭?cè)腦室下區(qū)在損傷后經(jīng)NT3-殼聚糖載體修復(fù)后，檢測(cè)到大量新生遷移的NSCs。但新生神經(jīng)元的明確來源有待于進(jìn)一步探究。

TBI后通過內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生修復(fù)大腦損傷，可以避免外源性NSCs移植修復(fù)腦損傷所產(chǎn)生的外來細(xì)胞不可控制的增生問題；把這些再生的細(xì)胞有效整合到正常的腦組織并發(fā)揮功能，是治療TBI的手段[20]。腦本身的原始自發(fā)恢復(fù)能力是有限的，在損傷區(qū)域NSCs很難自發(fā)神經(jīng)分化，通過一些外在方法來加強(qiáng)內(nèi)源性過程非常必要[21]。

在未來研究中，腦損傷修復(fù)問題會(huì)一直是重大的醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。而利用生物材料系統(tǒng)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，既不涉及倫理學(xué)問題，也不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。哺乳動(dòng)物腦內(nèi)多個(gè)區(qū)域存在NSCs，損傷區(qū)內(nèi)的NSCs來源問題和如何特異性誘導(dǎo)分化將是我們研究的重點(diǎn)。未來有可能會(huì)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞特異性活化為目標(biāo)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。

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Effect of Neurotrophin 3-chitosan on Endogenous Neurogenesis and Motor Function after Motor Cortex Injury in Rats

YANG Fei-xiang1,ZHANG Ai-feng2,HAO Peng1,SHANG Jun-kui1,DUAN Hong-mei1,YANG Zhao-yang1,3,LI Xiao-guang1,3
1.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China；2.Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University,Beijing 100050,China；3.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

LI Xiao-guang.E-mail:lxgchina@sina.com

ObjectiveTo observe the effects of neurotrophin 3(NT3)-chitosan on motor function,and proliferation and differentiation of the neural stem cells(NSCs)in the injury area and subventricular zone(SVZ)in rats with motor cortex injury.MethodsSixty-five Wistar rats were divided into control group(n=7),injury group(n=29)and NT3-chitosan group(n=29).The motor cortex was aspirated and removed as cerebral injury model.NT3-chitosan was immediately implanted into the injured area after operation,and the control group received no intervention.Pellet reaching test was performed to detect the recovery of the forelimb function,HE staining was used to observe the lesion cavity size,and immunofluorescence staining was used to observe the proliferation and differentiation of NSCs 3 days,7 days,14 days,1 month,2 months and 3 months after operation.ResultsThe grasp success rate was higher(F＞6.00,P≤0.05),and the lesion cavity size was significantly smaller(F＞629.5,P＜0.001)in the NT3-chitosan group than in the injury group.In the NSCs differentiation experiment,the number of BrdU cells at all the time points was significantly higher in the NT3-chitosan group than in the injury group(F＞171.43,P＜0.001).In the NSCs proliferation experiment,the number of BrdU positive cells was still significantly higher in the NT3-chitosan group than in the control group and in the injury group(F＞155.06,P＜0.001),the number of Dcx positive cells was significantly higher in theNT3-chitosan group than in the injury group(F=62.367,P＜0.001),and the number of BrdU/Dcx positive cells was significantly higher in the NT3-chitosan group than in the control group(F=33.527,P＜0.001).ConclusionNT3-chitosan could activate NSCs in the SVZ,and promote endogenous neurogenesis and forelimb function recovery in rats after motor cortex injury.

traumatic brain injury；neurotrophin 3；chitosan；endogenous neurogenesis；motor function；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.02.008

R651.1

A

1006-9771(2017)02-0155-07

2016-10-20

2016-12-02)

1.國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.31130022)；2.國家自然科學(xué)基金國際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(No.31320103903)；3.國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.31271037；No.31670988)；4.國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項(xiàng)目(No.31650001)；5.高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.201356)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京市100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科，北京市100050；3.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191。作者簡(jiǎn)介：楊飛祥(1990-)，男，漢族，河南開封市人，碩士研究生，主要研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性腦損傷和修復(fù)。通訊作者：李曉光。郵箱:lxgchina@sina.com。