莢膜紅細(xì)菌尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)甲基酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)

康潔，房歡，董會(huì)娜，宋文軍，張大偉

1 天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

莢膜紅細(xì)菌尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)甲基酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)

康潔1,2，房歡2，董會(huì)娜2，宋文軍1，張大偉2

1 天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴型尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)甲基酶 (S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲmethyltransferase, SUMT) 催化尿卟啉原Ⅲ (Uroprophyrinogen Ⅲ, urogen Ⅲ) 的中心碳原子C-2和C-7位上甲基化生成前咕啉-2，是維生素B12生物合成途徑中的一步關(guān)鍵酶，但大部分SUMT受其底物urogen Ⅲ和副產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸 (S-adenosy-L-homocysteine, SAH) 的抑制作用。為了挖掘能耐受高濃度urogen Ⅲ的轉(zhuǎn)甲基酶，文中從莢膜紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus SB1003中克隆2個(gè)SUMT基因 (RCcobA1, RCcobA2)，經(jīng)表達(dá)與純化后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RCcobA1和RCcobA2的酶活分別為27.3 U/mg和68.9 U/mg，后者比VB12工業(yè)生產(chǎn)菌株脫氮假單胞菌Pseudomonas denitrificans中內(nèi)源的SUMT (PDcobA，27.9 U/mg) 高2.4倍，并且當(dāng)urogen Ⅲ濃度高達(dá)70 μmol/L時(shí)都幾乎不受抑制作用。因此，RCcobA2的發(fā)現(xiàn)可以為解除VB12合成途徑的瓶頸以及提高VB12產(chǎn)量提供理論支持和方向指導(dǎo)。

維生素 B12，尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)甲基酶，尿卟啉原Ⅲ，酶偶聯(lián)法，莢膜紅細(xì)菌

在維生素B12(VB12)生物合成途徑中，8分子5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid, ALA)在氨基乙酰丙酸脫氫酶 (HemB)、膽色素原脫氨酶 (HemC)、尿卟啉原Ⅲ合成酶 (HemD)的逐級(jí)催化作用下，經(jīng)縮合、脫氨、聚合、環(huán)化等反應(yīng)，最終合成urogen Ⅲ[1]。Urogen Ⅲ的合成不僅標(biāo)志著VB12中心環(huán)碳骨架初步形成，而且也是合成其他天然四吡咯環(huán)類化合物，如血紅素、葉綠素等分支的前體[2](圖1)。因此，SUMT催化2分子S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到urogen Ⅲ生成前咕啉-2是將 urogen Ⅲ引入VB12合成途徑的第一步關(guān)鍵酶。根據(jù)功能和大小不同，將參與不同合成途徑中的SUMT分為3類，具體信息如表1所示。

構(gòu)建信息化資源平臺(tái)，設(shè)計(jì)多種特色數(shù)據(jù)庫，將信息資源分門別類收集。信息資源平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)在于與其他信息資源機(jī)構(gòu)進(jìn)行強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將數(shù)據(jù)信息互通有無，開放交換權(quán)限，最大限度地實(shí)現(xiàn)信息資源的共享與利用，提升智庫成果研究的效率與轉(zhuǎn)化率。高校圖書館之間的資源共享，也可以在一定程度上改變圖書館信息資源不對(duì)稱、更新慢、滯后性等缺點(diǎn)，一舉數(shù)得。

目前為止，來自幾個(gè)不同物種的SUMT，如沙門氏菌Salmonella enterica的CysG[13]、脫氮假單胞菌Pseudomonas denitrificans的PDCobA[14]、嗜熱棲熱菌Thermus thermophiles的ttSUMT[15]、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的NirE[16]等，都經(jīng)過酶學(xué)性質(zhì)的初步探究和晶體結(jié)構(gòu)解析，得出了較為一致的結(jié)論：大部分SUMT都受自身底物urogen Ⅲ和副產(chǎn)物SAH的抑制作用，但卻不受前咕啉-2和代謝途徑終產(chǎn)物 VB12的反饋抑制。這種特殊的酶學(xué)性質(zhì)可能是合成VB12代謝途徑中一種重要的調(diào)控方式，也可能是導(dǎo)致VB12微生物發(fā)酵產(chǎn)量無法突破的原因之一。法國的 RPR公司曾經(jīng)提高了P. denitrificans中cobA基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)提高VB12產(chǎn)量有所幫助[17]，為了進(jìn)一步克服urogen Ⅲ的抑制作用，RPR公司建議在P. denitrificans中異源表達(dá)來自產(chǎn)甲烷菌Methanobacterium ivanovii的SUMT編碼基因[18]。Piao 等[19]在費(fèi)氏丙酸菌 Propionibacterium freudenreichii中過表達(dá)內(nèi)源的cobA基因，使VB12產(chǎn)量比空載菌株提高1.7倍。目前，國內(nèi)外還沒有報(bào)道能夠完全解除底物 urogen Ⅲ和 SAH抑制作用的SUMT。

圖1 四吡咯環(huán)類化合物合成路徑簡(jiǎn)圖Fig. 1 Synthesis pathway of tetrapyrroles.

莢膜紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus是紫色非硫光合細(xì)菌，具有在有氧或無氧、黑暗或光照等環(huán)境下生存的能力，能夠合成多種吡咯環(huán)類化合物適應(yīng)不同條件下的代謝需求[20]。但在無氧和有氧條件下，都需要合成VB12輔助完成DNA修復(fù)、甲硫氨酸合成等生理功能，并且，R. capsulatus具有縮減其他分支途徑，使代謝流直接流向特定路徑的復(fù)雜而周密的調(diào)控機(jī)制[21]。因此，推測(cè)來源于R. capsulatus的SUMT可能在VB12合成代謝流中有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。此外，Deery等[22]報(bào)道在大腸桿菌中表達(dá)含有 R. capsulatus中的SUMT編碼基因的操縱子，合成了VB12途徑的中間代謝物氫咕啉酸，推測(cè)可能是R. capsulatus的SUMT催化更多urogen Ⅲ進(jìn)入VB12代謝流，緩解了合成途徑的瓶頸。為了研究R. capsulatus的SUMT是否確實(shí)具有合成VB12的優(yōu)勢(shì)，本文進(jìn)行了R. capsulatus SB1003中SUMT的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。

表1 SUMT的分類及特點(diǎn)Table 1 Classification and features of SUMTs

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與設(shè)計(jì)的引物

文中所用菌株、質(zhì)粒列于表2，引物均列于表3中。

1.2 培養(yǎng)基、酶及主要試劑

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（）表示，配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LB 培養(yǎng)基 (1 L)：氯化鈉 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g。

表2 菌株與質(zhì)粒Table 2 Strains and plasmids

表3 文中所用引物Table 3 Primers used in this study

酶：限制性內(nèi)切酶購于 Thermo Fisher Scientific公司。DNA聚合酶PrimerSTAR Mix購自TaKaRa公司。2×Taq PCR MasterMix購于北京天根生化科技有限公司。

主要試劑：基因組 DNA 提取試劑盒(DP302-02)，質(zhì)粒小提試劑盒 (D6943-02)，膠回收試劑盒和柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(D6492-02) 購于OMEGA。引物合成和測(cè)序都在金唯智公司。Millipore超濾管購于上?？￡晒尽i-NTA填料購于GE Healthcare。其他未特殊指明的試劑均購于Sigma公司。平衡緩沖液：20 mmol/L磷酸二氫鈉，0.5 mol/L氯化鈉，30 mmol/L咪唑，pH 7.4；洗滌緩沖液：20 mmol/L磷酸二氫鈉，0.5 mol/L氯化鈉，100 mmol/L咪唑，pH 7.4；洗脫緩沖液：20 mmol/L磷酸二氫鈉，0.5 mol/L氯化鈉，500 mmol/L咪唑，pH 7.4；蛋白保存緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L氯化鈉，20% (V/V) 甘油，pH 7.5。

[4] Blanche F, Debussche L, Thibaut D, et al. Purification and characterization of S-adenosyl-L-methionine: uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase from Pseudomonas denitrificans. J Bacteriol, 1989, 171(8): 4222–4231.

1.3 主要器材

PTC-1148型PCR儀，美國BIO-RAD公司；連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 (SpectraMax M5)，美國MD公司；高壓細(xì)胞破碎儀 (JN-3000 Plus)，天津上善科技公司；真空離心濃縮儀 (PTSB2012-059)，天津美瑞泰克公司；厭氧培養(yǎng)箱 (Sci-tive N)，北京隆福佳公司。

1.4 方法

1.4.1 基因克隆與構(gòu)建表達(dá)菌株

從P. denitrifican和SB1003菌株中提取基因組總DNA，并以此為模板，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增 3個(gè)編碼 SUMT基因片段，并和表達(dá)載體pET-28a(+)分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割、連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coli DH5α，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素 50 μg/mL的LB 平板上培養(yǎng)，T7載體常用引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，送陽性克隆到公司測(cè)序。重組質(zhì)粒pET28a-PDcobA、pET28a-RCcobA1和pET28a-RCcobA2分別導(dǎo)入表達(dá)菌株 BL21(DE3)，凍存菌液。基因hemB、hemC、hemD和sirC的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建按照文獻(xiàn)[21]操作。

1.4.2 蛋白的表達(dá)與純化

將上述表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600至0.6-0.8，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，16 ℃培養(yǎng)過夜。

以下所有操作都在 4 ℃或冰上進(jìn)行。離心(5 000 r/min、20 min) 收集菌體，用平衡緩沖液重懸，高壓破碎后，11 000 r/min離心1 h，0.22 μm濾膜過濾，過鎳柱；接著用洗滌緩沖液沖洗3次，每次洗10倍的柱體積；最后用3–5倍柱體積的洗脫緩沖液將結(jié)合到填料上的目的蛋白洗脫下來，并借助超濾管將目的蛋白中的緩沖液更換成蛋白保存緩沖液，最后儲(chǔ)存在–20 ℃。

制備蛋白樣，通過SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳的方法判斷蛋白的表達(dá)與純化。按照BCA試劑盒對(duì)蛋白定量。

1.4.3 酶偶聯(lián)法

為了驗(yàn)證酶偶聯(lián)法實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裰噩F(xiàn)，按照文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行操作。反應(yīng)體系如下：5 mmol/L ALA，200 μmol/L SAM，1 mmol/L 1-萘乙酰胺(NAD+)，5×緩沖液 (脫氣)，0.32 μmol/L HemB，2.27 μmol/L HemC，2.12 μmol/L HemD，10.69 μmol/L SUMT，1 μmol/L SirC，水補(bǔ)齊至總體積為100 μL。以不加SUMT的反應(yīng)液為對(duì)照，分別添加PDcobA、RCcobA1和RCcobA2的反應(yīng)液為實(shí)驗(yàn)組，在黑色96孔板中，37 ℃溫育20 min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行光譜掃描 (200–700 nm)。

經(jīng)過與PDB編號(hào)為2YBO、1S4D、1VA0、1VE2的蛋白比對(duì)后，用Discovery Studio 4.1的MODELLER方法同源建模，進(jìn)行重疊比較，結(jié)果如圖2B所示。4個(gè)SUMT的結(jié)構(gòu)折疊方式非常相似，形成“螃蟹”的構(gòu)型，分析發(fā)現(xiàn)，其 N端 (β3-α2結(jié)構(gòu)域) 和 C端 (β6-α5結(jié)構(gòu)域) 分別存在1個(gè)氨基酸序列非保守的loop，組成2個(gè)“螯”形，與一些內(nèi)部的氨基酸殘基共同構(gòu)成底物urogen Ⅲ的結(jié)合口袋，并且loop折疊方式和長(zhǎng)度存在不同。Storbeck等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NirE的loop區(qū)氨基酸殘基可能參與底物羧基化反應(yīng)或?qū)具h(huán)的質(zhì)子重排發(fā)揮重要作用。因此，4個(gè)SUMT的loop區(qū)不同，形成的底物結(jié)合口袋也不同，可能會(huì)對(duì)酶本身的催化機(jī)制和對(duì)底物urogen Ⅲ耐受性造成差異。

1.4.4 酶活測(cè)定

酶促反應(yīng)體系按照 1.4.3。待反應(yīng)液溫育10 min后，快速加入ALA，振蕩混勻，用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)3-20 min之間吸光度值隨時(shí)間的變化。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道 Sirohydrochlorin (SHC) 的摩爾吸光系數(shù) (ε 376 nm) 為2.4×105mol/(L·cm)，計(jì)算酶促反應(yīng)初速度，折算出酶活，酶活單位 (U)定義為在最適條件下，1 h內(nèi)催化1 nmol ALA轉(zhuǎn)化成前咕啉-2所需要的酶量 (mg)。

1.4.5 urogen Ⅲ的制備

2.1 核苷酸序列比對(duì)分析

1.4.6 urogen Ⅲ和SAH對(duì)酶活的抑制

反應(yīng)體系為：5×緩沖液 (脫氣)，200 mmol/L SAM，100 μmol/L NAD+，1 mmol/L SirC，2 μmol/L SUMT，按照方法1.4.4分別檢測(cè)不同濃度urogenⅢ (0-70 μmol/L) 和SAH (0-60 μmol/L) 條件下對(duì)應(yīng)的初速度，利用雙倒數(shù)法測(cè)定米氏方程中的參數(shù)Km和Kcat。

2 結(jié)果與分析

由于沒有商品化的urogen Ⅲ，參照文獻(xiàn)[24]報(bào)道的方法 (方法略有改動(dòng))，進(jìn)行 urogen III制備實(shí)驗(yàn)。在厭氧箱中，利用裹有錫箔紙的厭氧玻璃瓶為反應(yīng)容器，加入5×緩沖液 (脫氣)，5 mmol/L ALA，0.32 μmol/L HemB，2.27 μmol/L HemC，2.12 μmol/L HemD，水補(bǔ)齊至總體積為20 mL，37 ℃反應(yīng)2 h，隨后將反應(yīng)液80 ℃熱處理15 min，使酶失活。0.22 μm濾膜過濾，將濾液在真空條件下離心濃縮后，無氧凍存。取10 μL的制備樣，加90 μL 1 mol/L HCl暴露光下1 h，用酶標(biāo)儀掃描405 nm處的吸光度值并計(jì)算urogen Ⅲ的濃度 (ε 405 nm=5.4×105mol/(L·cm))。

用 Clustal Omega軟件對(duì)克隆獲得的基因PDcobA、RCcobA1和RCcobA2與數(shù)據(jù)庫中已登錄的來自不同物種的編碼SUMT基因進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析。結(jié)果如表 4所示，不同種屬來源的基因，其序列的同源性介于 40%-65%之間，親緣關(guān)系較近的不同屬之間的序列同源性在80%左右，同屬的不同菌種，SUMT的同源性均在90%以上，說明SUMT的核苷酸序列相對(duì)較保守，酶學(xué)特性的差異受蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

表4 SUMT的核苷酸序列比較Table 4 Nucleotide sequence alignment of SUMTs

2.2 高級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析

為了分析3個(gè)SUMT的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，用ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/ index.php) 軟件，以PDcobA作為預(yù)測(cè)模板，將RCcobA1，RCcobA2和NirE進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)(圖2A)。發(fā)現(xiàn)氨基酸序列的同源性都接近50%，亞基的主要構(gòu)成組分都是由10個(gè)β-折疊片層和9個(gè)α-螺旋交替排列的，其中C端的β8和β9之間是用β-轉(zhuǎn)角連接，模體中還存在2個(gè)310-螺旋(η) 及0.08%無規(guī)則卷曲 (特指loop)。RCcobA1和RCcobA2與SUMT序列上高度保守區(qū)域的存在初步說明了它們具有相似的轉(zhuǎn)甲基功能。

2.2.1 兩組治療RAU總有效率的比較 共納入12篇文獻(xiàn)，合計(jì)有效率治療組為89.89%（880／979），對(duì)照組為 75.13%（580／772），I2＝52%，采用隨機(jī)效應(yīng)模型機(jī)型分析，有效率的 RR合并值為1.21，95%CI：1.14～1.29，兩組之間治 RAU總有效率的總效應(yīng)Z＝6.62，P＜0.001，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.3 SUMT 表達(dá)與純化

文獻(xiàn)[25-26]報(bào)道，當(dāng)SUMT在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，催化產(chǎn)物在紫外燈照射下可以發(fā)出粉紅色熒光。為了初步判斷3個(gè)基因是否在BL21中正常表達(dá)，以BL21/pET28a菌株活化后的平板為對(duì)照，觀察上述3種重組菌的顏色對(duì)比，結(jié)果如圖3所示，BL21/pET28a-PDcobA和BL21/ pET28a-RCcobA2兩株菌都發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光，與預(yù)期結(jié)果一致，說明SUMT基因在BL21中能正常表達(dá)且具有酶活。BL21/pET28a-RCcobA1有微弱熒光，推測(cè)可能是RCcobA1的酶活較低，積累熒光產(chǎn)物量較少的原因。

總的來看，銅仁市由于中低云量偏多，多陰天及陰雨天氣，日照時(shí)數(shù)大部分地區(qū)在1 100～1 300小時(shí)之間，日照較少，是全國日照低值區(qū)之一。但由于季節(jié)分布的不均勻性，秋收作物生育期光照條件比較好，光能的有效性高，能滿足花生生長(zhǎng)需要。

[8] Storbeck S, Walther J, Müller J, et al. The Pseudomonas aeruginosa nirE gene encodes the S-adenosyl-L-methionine-dependent uroporphyrinogen Ⅲmethyltransferase required for heme d1biosynthesis. FEBS J, 2009, 276(20): 5973–5982.

3.3 臨床指南的應(yīng)用與推廣 指南的成功應(yīng)用與4個(gè)地區(qū)性因素息息相關(guān)，即疾病負(fù)擔(dān)、信仰、花費(fèi)和障礙[14]。據(jù)2010年的一項(xiàng)不完全統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[15]，中國眼科醫(yī)師數(shù)量已達(dá)世界之最，其同時(shí)也有數(shù)量最為龐大的服務(wù)對(duì)象。針對(duì)如此龐大的眼科醫(yī)師群體及其服務(wù)人群，臨床指南的推廣與應(yīng)用顯得尤為重要。

2.4 酶活及動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

房歡等[23]曾經(jīng)報(bào)道，利用酶偶聯(lián)法可以將SUMT催化產(chǎn)生的不穩(wěn)定產(chǎn)物前咕啉-2轉(zhuǎn)化成在376 nm處有特征吸收峰的化合物SHC。結(jié)果如圖 5所示，不加 SUMT的多酶反應(yīng)體系在400 nm和500 nm處有吸收峰，應(yīng)該是urogen Ⅲ的特征吸收峰。而分別添加3個(gè)SUMT的反應(yīng)液都在376 nm處多1個(gè)新的吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。說明此方法可以快速、準(zhǔn)確的判斷新物質(zhì)SHC的合成，并且可以用于SUMT酶活檢測(cè)。

在相同檢測(cè)條件下，RCcobA2的酶活(68.9 U/mg) 比PDcobA的酶活 (27.9 U/mg) 高2.4倍，但RCcobA1的酶活與PDcobA基本一致，動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表5。文獻(xiàn)[23]報(bào)道，對(duì)CysG結(jié)構(gòu)的 N端 loop中氨基酸 (Lys-72) 定點(diǎn)突變后，酶活變化很大，而根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RCcobA1在對(duì)應(yīng)位置的氨基酸殘基是苯丙氨酸 (F)，而其他2個(gè)SUMT的氨基酸殘基為甘氨酸 (G)，雖然都是非極性氨基酸，但后者形成的空間位阻較小，可能利于酶與底物的快速結(jié)合，進(jìn)而酶活相對(duì)較高。

圖2 幾個(gè)SUMT的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì) (A) 和以PDcobA為模板的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖 (B)Fig. 2 Structure-based amino acid sequence alignment (A) and superposition of tertiary structure models (B) from RCcobA1 and RCcobA2 with NirE and PDcobA. Helices and β-structures as found in PDcobA are indicated. Red boxes highlight identical amino acids among these four SUMTs. The tertiary structural models are shown in ribbon representation: PDcobA (red) and NirE (yellow) and RCcobA1 (green) as well as RCcobA2 (p