鼠李糖乳桿菌顆粒表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建

蘇潤雨，聶伯堯，袁盛凌，陶好霞，劉純杰，楊百亮，王艷春

1 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

鼠李糖乳桿菌顆粒表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建

蘇潤雨1，聶伯堯1，袁盛凌2，陶好霞2，劉純杰2，楊百亮1，王艷春2

1 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

為了比較不同錨鉤蛋白基序結(jié)合活性，構(gòu)建新型的鼠李糖乳桿菌顆粒表面展示系統(tǒng)。首先，用熱酸處理法制備鼠李糖乳桿菌GEM (Gram-positive enhancer matrix，GEM) 顆粒，并通過電鏡觀察、RT-PCR檢測和SDS-PAGE檢測鑒定其處理效果；同時，利用大腸桿菌表達(dá)了錨定蛋白PA3-EGFP和 P60-EGFP并將其與GEM顆粒共同孵育結(jié)合；最后，使用免疫印跡、電鏡觀察、熒光顯微鏡觀察和熒光分光光度法評價鼠李糖乳桿菌GEM顆粒與錨定蛋白的結(jié)合效率。結(jié)果表明，使用10%的TCA處理鼠李糖乳桿菌得到了滅活的肽聚糖骨架 (GEM顆粒)，經(jīng)鑒定其大小形態(tài)均一，絕大部分無蛋白殘留，3.8×106個GEM顆粒樣品中的DNA拷貝數(shù)僅為32；免疫印跡和熒光顯微鏡觀察均可檢測到融合蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP錨定在GEM顆粒上，且結(jié)合在GEM顆粒表面的錨定蛋白呈絮狀。熒光分光光度計法檢測結(jié)果顯示錨定蛋白PA3-EGFP結(jié)合GEM的效率稍高于P60-EGFP，但差異不顯著 (P>0.05)。以上結(jié)果表明由鼠李糖乳桿菌制得的GEM顆粒與錨定蛋白PA3、P60的結(jié)合效率良好，可用于構(gòu)建新型的外源蛋白表面展示系統(tǒng)，進(jìn)而為后續(xù)的細(xì)菌樣顆粒疫苗的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

鼠李糖乳桿菌LGG，GEM顆粒，錨定蛋白，表面展示，鑒定

鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus GG，LGG) 為革蘭氏陽性菌，是研究最廣泛的乳酸菌之一，具有生長速度快、生物安全性高等優(yōu)點，能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群和提高機體免疫力[1]。近些年，在基因工程技術(shù)的推動下，關(guān)于包括鼠李糖乳桿菌在內(nèi)的多種乳酸菌 (Lactis acid bacteria，LAB)已被成功用于疫苗抗原蛋白表達(dá)、疫苗抗原遞送等方面的研究[2–4]。然而在食品生產(chǎn)和醫(yī)療健康的應(yīng)用領(lǐng)域中，基因工程技術(shù)的應(yīng)用受到了倫理和法律上的嚴(yán)格限制。因此，利用未經(jīng)基因修飾手段獲得的革蘭氏陽性增強基質(zhì)-蛋白錨鉤 (Gram-positive enhancer matrix-protein anchor，GEM-PA) 表面展示系統(tǒng)越來越受到研究者的關(guān)注。GEM-PA系統(tǒng)是從乳酸菌表面展示技術(shù)衍生而來的非基因修飾的疫苗載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)由革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁肽聚糖骨架 (GEM) 和蛋白錨鉤 (PA) 組成，均為食品級元件，生物安全性高[5]。該系統(tǒng)的核心部分即為發(fā)揮結(jié)合作用的錨鉤蛋白 (PA)[6]，目前研究較多的是將乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶(AcmA) 的C端結(jié)構(gòu)域作為錨定蛋白[7]，該結(jié)構(gòu)域由 3個細(xì)胞溶解酶基序(LysM)與間隔序列構(gòu)成，命名為“PA3”[8–9]。其中，LysM結(jié)構(gòu)域具有特異性非共價結(jié)合革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁肽聚糖的能力，因此外源蛋白可通過與 PA3融合而獲得錨定功能[10–11]。此外，由單核細(xì)胞增多性李斯特菌產(chǎn)生的分泌蛋白 P60也具有類似的結(jié)構(gòu)單元。有研究顯示，其C端區(qū)域為Nlpc/p60家族結(jié)構(gòu)域氨基酸基序，N端區(qū)域含有 2個LysM和 SH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸基序，可以預(yù)測P60蛋白的 N端結(jié)構(gòu)域也具有錨定細(xì)胞壁的功能[12]，但目前尚無將P60蛋白N端基序作為表面展示顆粒疫苗錨定結(jié)構(gòu)的相關(guān)報道。目前，運用乳酸乳球菌GEM-PA系統(tǒng)的亞單位或多肽疫苗已被證明在多種動物模型中能夠激發(fā)機體的免疫保護(hù)，已成功用于瘧原蟲環(huán)孢子 (CSP)亞單位疫苗[13]、呼吸道合胞病毒疫苗[14]、人肺炎鏈球菌粘膜疫苗[15]和鼠疫 LcrV 亞單位疫苗等研制[16–17]。但該系統(tǒng)的主要缺點在于錨定蛋白與GEM顆粒的結(jié)合較松散，相對易解離，因此有必要開發(fā)設(shè)計結(jié)合能力更強的GEM-PA系統(tǒng)。本研究嘗試選用鼠李糖乳桿菌GEM顆粒分別與錨定蛋白PA3和P60進(jìn)行組合，旨在構(gòu)建新型的GEM-PA系統(tǒng)，希望為研究安全、有效、廉價的細(xì)菌樣顆粒疫苗提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鼠李糖乳桿菌GG (L. rhamnosus GG，LGG)由本實驗室保存；原核表達(dá)載體pET28a-EGFP由本實驗室保存[18]；感受態(tài)細(xì)胞 BL21(DE3)、pEASY?-Blunt Zero克隆載體、BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金公司；M.R.S肉湯培養(yǎng)基購自 Oxoid公司；三氯乙酸 (TCA) 為國藥集團(tuán)產(chǎn)品；小鼠源 GFP單抗及辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗均為中杉金橋公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光底物試劑為Engreen公司產(chǎn)品；IPTG誘導(dǎo)劑為Sigma公司產(chǎn)品；鎳離子親和柱為默克公司產(chǎn)品；SYBR-Green熒光染料與ROX為Kapa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 GEM顆粒的制備及電鏡觀察

接種LGG到400 mL新鮮的M.R.S肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。收集菌液，用無菌磷酸緩沖液 (PBS) 溶液洗滌并重懸混勻，用活菌計數(shù)法測定菌液濃度。然后加入1/5體積的10% TCA溶液，將細(xì)菌煮沸處理30 min得到GEM顆粒，并用PBS溶液洗滌3次。最后稀釋至10 U/mL (1 U=2.5×109個)，置–20 ℃保存。

離心收集保存的GEM顆粒，加入3%戊二醛 (0.075 mol/L PBS，pH 7.4) 溶液4 ℃固定2 h，然后依次進(jìn)行漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片和染色，制作電鏡切片，使用透射電鏡 (HITACHI H-7650) 觀察 GEM顆粒的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.2 GEM顆粒核酸和蛋白的殘留分析

GEM顆粒樣品中的DNA殘留使用熒光定量PCR的方法進(jìn)行。具體而言，首先根據(jù)LGG基因組的16S rRNA編碼序列設(shè)計引物 (上游引物: 5′-GTGCTTGCATCTTGATTTAATTTT-3′；下游引物：5′-TGCGGTTTTTGGATTTATGCG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的DNA片段純化回收后克隆至載體pEASY?-Blunt Zero，最后鑒定正確的質(zhì)粒作為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時取1 μL的 GEM 顆粒樣品 (經(jīng)計算約為 3.8×106個) 進(jìn)行熒光定量PCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計算GEM樣品中殘留核酸的拷貝數(shù)。同時取LGG活菌基因組DNA作為陽性對照。此外，取GEM顆粒超聲破碎，制樣后進(jìn)行 SDS-PAGE檢測，分析GEM顆粒中的蛋白殘留情況，同時取LGG活菌的超聲裂解物作為陰性對照。

1.2.3 錨定蛋白的表達(dá)及純化

經(jīng)NCBI網(wǎng)站查詢獲得AcmA和P60的編碼基因序列 (GI: 124491961和GI: 985140)，分別取AcmA(224-437)(PA3)和P60(28–245)對應(yīng)序列由金維智基因公司合成，并克隆至原核表達(dá)載體pET28a-EGFP中EGFP編碼序列下游。然后將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-EGFP、pET28a-EGFPPA3和pET28a-EGFP-P60分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3) 中。挑選陽性克隆接入含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)4 h，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)。離心收集新鮮菌體，超聲破碎后經(jīng)SDS-PAGE檢測分析目的蛋白的表達(dá)情況。使用鎳離子親和層析柱純化蛋白，SDS-PAGE電泳分析純化效果，BCA法測定蛋白濃度。

1.2.4 錨定蛋白與GEM顆粒的結(jié)合

取保存的 GEM 顆粒分別與錨定蛋白PA3-EGFP與P60-EGFP結(jié)合，1 U的GEM顆粒中加入200 μg錨定蛋白，然后用PBS溶液重懸并定容至1 mL，室溫振蕩孵育30 min，用PBS離心洗滌 3次，除去未結(jié)合的蛋白，最后用適量的PBS重懸。同時用EGFP蛋白與GEM顆粒結(jié)合作為對照。

1.2.5 免疫印跡鑒定

取GEM顆粒與PA3-EGFP、P60-EGFP和EGFP蛋白結(jié)合后的樣品，經(jīng) SDS-PAGE電泳后，使用快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至NC膜上，將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h。然后加入小鼠源GFP單抗 (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h。取出NC膜用PBST洗3次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠二抗 (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，最后使用凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光顯影。

1.2.6 結(jié)合后GEM顆粒透射電鏡觀察

取GEM顆粒與PA3-EGFP、P60-EGFP和EGFP蛋白結(jié)合后的樣品，制作透射電鏡樣品，方法同“1.2.1”部分，通過透射電鏡觀察結(jié)合后GEM顆粒的超微結(jié)構(gòu)變化。1.2.7 結(jié)合后GEM顆粒熒光顯微鏡觀察

取適量的融合蛋白結(jié)合GEM顆粒樣品，均勻涂布在潔凈的載玻片上，室溫晾干固定，使用熒光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE Ti-S)，在油鏡下觀察GEM顆粒表面綠色熒光發(fā)光情況。

1.2.8 結(jié)合后熒光強度檢測

取GEM顆粒與PA3-EGFP、P60-EGFP蛋白結(jié)合后的樣品，使用適量的PBS溶液均勻重懸，并定容至 600 μL，加至 96孔黑色酶標(biāo)板，每孔200 μL，各設(shè)置3個復(fù)孔。熒光分光光度計檢測每孔的熒光值及OD600，則結(jié)合物的熒光強度計算方式如下：熒光強度=熒光值 (RFU)/OD600。共進(jìn)行3次重復(fù)試驗，兩組數(shù)據(jù)結(jié)果比較使用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GEM顆粒制備后透射電鏡觀察

透射電鏡觀察結(jié)果如圖1所示，與LGG細(xì)菌相比，經(jīng)熱酸處理得到的GEM顆粒中，胞膜結(jié)構(gòu)已完全被破壞溶解，僅保留了革蘭氏陽性菌的肽聚糖骨架，并維持了細(xì)菌的基本形態(tài)和大小。并且可以看出，GEM顆粒的表面較平滑，胞內(nèi)呈均一的灰色。

圖1 LGG-GEM顆粒透射電鏡觀察 (60 000×)Fig. 1 The observation of LGG-GEM particles by transmission electron microscopy (60 000×). The scale bar represents 200 nm. (A) LGG bacteria. (B) LGG-GEM particles.

2.2 SDS-PAGE檢測GEM顆粒蛋白殘留

GEM顆粒超聲破碎后經(jīng)SDS-PAGE檢測的結(jié)果如圖2所示，GEM樣品泳道中僅有少量蛋白條帶出現(xiàn)。該結(jié)果表明熱酸處理LGG較徹底，絕大部分除去了細(xì)菌中蛋白質(zhì)，用此方法制備GEM顆?？尚小?/p>

2.3 定量PCR檢測GEM顆粒中核酸殘留

建立的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖3所示，其標(biāo)準(zhǔn)方程為Ct值=–3.402×濃度 (對數(shù)值)+35.589，(相對系數(shù)R2=0.998，擴(kuò)增效率E(%)=96.756)，其中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的起始拷貝數(shù)為1.77×109。樣品檢測結(jié)果如表1所示，3次重復(fù) GEM顆粒樣品的 Ct平均值為34.813，則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到 3.8×106個GEM顆粒樣品中的DNA拷貝數(shù)僅為32個。

圖2 GEM顆粒的SDS-PAGE檢測Fig. 2 SDS-PAGE analysis of GEM particles. M: protein marker; 1: LGG-GEM particles; 2: LGG bacterium.

圖3 10倍梯度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve for serial 10-fold dilutions of the standard plasmid.

表1 LGG-GEM顆粒核酸含量檢測結(jié)果Table 1 Results of real time PCR of DNA from LGG-GEM particles

2.4 原核表達(dá)融合蛋白SDS-PAGE鑒定

經(jīng) SDS-PAGE檢測，融合蛋白 PA3-EGFP和P60-EGFP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況良好，在超聲裂解物的上清和沉淀中均有表達(dá) (圖4A)。另外，純化超聲裂解物上清中的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，蛋白的大小基本正確，純化后的目的蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP大小分別約為51.4 kDa和52.0 kDa (圖4B)。

圖4 融合蛋白的表達(dá)純化分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of hybrid proteins. (A) SDS-PAGE analysis of hybrid proteins. M: protein marker; 1: BL21; 2: EGFP in the supernatant of lysate; 3: EGFP in the sediment of lysate; 4: PA3-EGFP in the supernatant of lysate; 5: PA3-EGFP in the sediment of lysate; 6: P60-EGFP in the supernatant of lysate; 7: P60-EGFP in the sediment of lysate. (B) SDS-PAGE analysis of purified hybrid proteins. M: protein marker; 1: purified PA3-EGFP; 2: purified P60-EGFP.

2.5 GEM 顆粒與融合蛋白結(jié)合后免疫印跡的鑒定

融合蛋白 PA3-EGFP、P60-EGFP分別與GEM顆粒結(jié)合后，利用融合蛋白N端的EGFP蛋白，通過免疫印跡法對融合蛋白與GEM的結(jié)合情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明錨定蛋白P60-EGFP、PA3-EGFP與GEM顆粒結(jié)合的效率良好 (泳道2，3)。作為陰性對照EGFP與GEM顆粒結(jié)合組 (泳道1) 只有微弱的條帶，分析可能是試驗過程中EGFP有少量的殘留 (圖5)。

2.6 結(jié)合后GEM顆粒透射電鏡觀察結(jié)果

GEM顆粒分別與PA3-EGFP、P60-EGFP和EGFP結(jié)合后，通過透射電鏡觀察GEM顆粒表面的結(jié)構(gòu)變化。如圖6所示，與 2種錨定蛋白結(jié)合后 GEM 顆粒的表面均可見大量的細(xì)小絮狀結(jié)合物。

2.7 結(jié)合后GEM顆粒熒光顯微鏡觀察

圖5 錨定蛋白與GEM結(jié)合后的免疫印跡鑒定Fig. 5 Western blotting analysis of GEM particles anchored with hybrid proteins. M: protein marker; 1: sample of GEM and EGFP; 2: sample of GEM and P60-EGFP; 3: sample of GEM and PA3-EGFP.

在熒光顯微鏡下使用油鏡觀察GEM顆粒，結(jié)果如圖 7所示，PA3-EGFP、P60-EGFP兩種融合蛋白與GEM顆粒結(jié)合后，均出現(xiàn)綠色熒光的短桿菌狀顆粒，表明融合蛋白 PA3-EGFP、 P60-EGFP與GEM顆粒的結(jié)合效率良好。EGFP與GEM顆粒處理組為陰性對照，視野中未發(fā)現(xiàn)熒光顆粒，說明單獨的熒光蛋白 EGFP不能與GEM顆粒結(jié)合，錨定蛋白是結(jié)合GEM顆粒的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。

2.8 熒光分光光度計的檢測

融合熒光蛋白的PA3-EGFP、P60-EGFP分別與制備的 LGG-GEM顆粒孵育結(jié)合后，使用熒光分光光度計測定并計算 GEM 顆粒表層熒光強度，經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析，兩種GEM顆粒的熒光強度差異不顯著 (P=0.68)。說明兩種錨定蛋白均能較好地與GEM結(jié)合，且二者結(jié)合效率基本相當(dāng) (圖8)。

圖6 透射電鏡觀察錨定蛋白與GEM顆粒的結(jié)合情況 (80 000×)Fig. 6 Transmission electron microscopy of binding anchor proteins (80 000×). The scale bar represents 200 nm. (A) Sample of GEM and PA3-EGFP. (B) Sample of GEM and P60-EGFP. (C) Sample of GEM and EGFP.

圖7 熒光顯微鏡下觀察錨定蛋白與GEM顆粒的結(jié)合Fig. 7 Fluorescence microscopy of binding anchor proteins. The scale bar represents 5 μm. (A) Sample of GEM and PA3-EGFP. (B) Sample of GEM and P60-EGFP. (C) Sample of GEM and EGFP.

圖8 結(jié)合錨定蛋白的GEM顆粒熒光強度檢測Fig. 8 Spectrofluorometry of GEM particles binding with the anchor proteins.

3 討論

本研究構(gòu)建的GEM-PA系統(tǒng)通過展示外源蛋白，建立了非基因修飾的顆粒疫苗平臺。其中，選用了鼠李糖乳桿菌LGG作為GEM-PA展示系統(tǒng)的載體顆粒的制備原料，大量研究認(rèn)為該菌的安全性極高且能有效維持消化系統(tǒng)健康和免疫功能[19]。在類似的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在熱酸處理下，能夠快速地釋放胞內(nèi)胞外的有機物質(zhì)，只剩下保持原細(xì)菌形態(tài)的肽聚糖空殼[20–21]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面的磷脂酸和磷壁酸類酯等物質(zhì)會阻礙LysM (細(xì)胞溶解酶基序) 與肽聚糖的識別，造成結(jié)合減少[22–23]，因此LGG菌外殼的處理應(yīng)徹底，且顆粒分散應(yīng)均勻，從而使錨定蛋白與GEM高效結(jié)合。本研究從蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留和超微結(jié)構(gòu)變化 3個方面對制備的GEM顆粒進(jìn)行了全方面鑒定，結(jié)果顯示使用 10%的 TCA加熱處理制備的GEM顆粒中蛋白質(zhì)與核酸殘留極少，并且顆粒的形態(tài)完整，大小均一，可以提示說明細(xì)菌的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)基本上已去除，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果基本一致[9]，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

本實驗中 2種融合蛋白 PA3-EGFP和P60-EGFP的錨定結(jié)構(gòu)區(qū)均能與GEM很好地結(jié)合，PA3為乳酸乳球菌主要自溶素AcmA的C端結(jié)構(gòu)域，是研究較多且使用最廣泛的蛋白錨定基序，因此本研究也選用了該蛋白作為一種候選的錨定基序。另外也有研究顯示，單核細(xì)胞增多性李斯特菌的P60蛋白N末端28–245位的蛋白片段包含2個LysM基序和1個位于二者之間的SH3結(jié)構(gòu)域，并且當(dāng)2個LysM和該SH3結(jié)構(gòu)域都同時存在時，P60蛋白具有錨定活性和結(jié)合細(xì)胞壁肽聚糖的能力[24]。更為重要的一點是，P60蛋白的這一部分片段具有活化宿主自然殺傷細(xì)胞 (NK cells) 的能力，而NK細(xì)胞活化后分泌的 IFN-γ在宿主對抗某些細(xì)菌和病毒感染過程中發(fā)揮著重要的作用[25–26]。可以提示，利用這一蛋白基序功能，錨定蛋白進(jìn)行疫苗抗原的融合表達(dá)有可能提高相應(yīng)疫苗的效果。因此，P60蛋白在疫苗應(yīng)用中具有潛在優(yōu)勢。在本研究中，我們在錨定蛋白PA3的C端和P60(28–245)的N端融合EGFP蛋白，從而對研究的錨定蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，在不影響錨定蛋白正常錨定功能的情況下，有利于對錨定蛋白進(jìn)行定位觀察和定量檢測。通過多角度的檢測分析，我們進(jìn)一步證實了 PA3對于鼠李糖乳桿菌制備的GEM 顆粒具有良好的錨定活性，同時發(fā)現(xiàn)P60(28–245)蛋白也具有較好的錨定活性，并且與PA3的水平基本相當(dāng)，因此我們認(rèn)為 P60(28–245)也可作為GEM-PA系統(tǒng)的候選錨定蛋白進(jìn)行深入研究。

本研究從鼠李糖乳桿菌出發(fā)，構(gòu)建了基于該菌株的革蘭氏陽性增強基質(zhì)-蛋白錨鉤表面展示系統(tǒng)，并且篩選了一種新的GEM顆粒錨定蛋白，初步探索了一種新的細(xì)菌顆粒樣表面展示系統(tǒng)，為后續(xù)細(xì)菌顆粒樣疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Hojsak I, Snovak N, Abdovic S, et al. Lactobacillus GG in the prevention of gastrointestinal and respiratory tract infections in children who attend day care centers: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Clin Nutr, 2010, 29(3): 312-316.

[2] Landete JM. A review of food-grade vectors in lactic acid bacteria: from the laboratory to their application. Crit Rev Biotechnol, 2016, 26: 1-13. [3] Wyszyńska A, Kobierecka P, Bardowski J, et al. Lactic acid bacteria—20 years exploring their potential as live vectors for mucosal vaccination. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(7): 2967-2977.

[4] van Braeckel-Budimir N, Haijema BJ, Leenhouts K. Bacterium-like particles for efficient immune stimulation of existing vaccines and new subunit vaccines in mucosal applications. Front Immunol, 2013, 4: 282.

[5] Qiao XW. GEM particle vaccines for Porcine circovirus type 2 [D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2013 (in Chinese).喬緒穩(wěn). 豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究 [D]. 揚州: 揚州大學(xué), 2013.

[6] Tarahomjoo S. Exploring surface display technology for enhancement of delivering viable lactic acid bacteria to gastrointestinal tract. Rijeka: InTech Open Access Publisher, 2013: 427-454.

[7] Zadravec P, ?trukelj B, Berlec A. Improvement of LysM-mediated surface display of designed ankyrin repeat proteins (DARPins) in recombinant and nonrecombinant strains of Lactococcus lactis and Lactobacillus species. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(6): 2098-2106.

[8] Xu W, Huang M, Zhang Y, et al. Novel surface display system for heterogonous proteins on Lactobacillus plantarum. Lett Appl Microbiol, 2011, 53(6): 641-648.

[9] Bosma T, Kanninga R, Neef J, et al. Novel surface display system for proteins on non-genetically modified gram-positive bacteria. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(1): 880-889.

[10] Zadravec P, ?trukelj B, Berlec A. Heterologous surface display on lactic acid bacteria: non-GMO alternative? Bioengineered, 2015, 6(3): 179-183. [11] Visweswaran GRR, Leenhouts K, van Roosmalen M, et al. Exploiting the peptidoglycan-binding motif, LysM, for medical and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(10): 4331-4345.

[12] Gu H. Dissection of Listeria monocytogenes p60 protein structural domains [D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2014 (in Chinese).顧浩. 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌P60蛋白結(jié)構(gòu)域的剖析 [D]. 揚州: 揚州大學(xué), 2014.

[13] Nganou-Makamdop K, van Roosmalen ML, Audouy SAL, et al. Bacterium-like particles as multi-epitope delivery platform for Plasmodium berghei circumsporozoite protein induce complete protection against malaria in mice. Malar J, 2012, 11: 50.

[14] Rigter A, Widjaja I, Versantvoort H, et al. A protective and safe intranasal RSV vaccine based on a recombinant prefusion-like form of the F protein bound to bacterium-like particles. PLoS ONE, 2013, 8(8): e71072.

[15] Audouy S A L, van Selm S, van Roosmalen M L, et al. Development of lactococcal GEM-based pneumococcal vaccines. Vaccine, 2007, 25(13): 2497-2506.

[16] Berlec A, Ravnikar M, Strukelj B. Lactic acid bacteria as oral delivery systems for biomolecules. Pharmazie, 2012, 67(11): 891-898.

[17] Ramirez K, Ditamo Y, Rodriguez L, et al. Neonatal mucosal immunization with a non-living, non-genetically modified Lactococcus lactis vaccine carrier induces systemic and local Th1-type immunity and protects against lethal bacterial infection. Mucosal Immunol, 2010, 3(2): 159-171.

[18] Ma K. Functional study on BslA adhesion of Bacillus anthracis [D]. Hefei: Anhui University, 2012 (in Chinese).馬坤. 炭疽芽孢桿菌 BslA 蛋白粘附功能研究 [D]. 合肥: 安徽大學(xué), 2012.

[19] Chen RC, Xu LM, Du SJ, et al. Lactobacillus rhamnosus GG supernatant promotes intestinal barrier function, balances Tregand TH17 cells and ameliorates hepatic injury in a mouse model of chronic-binge alcohol feeding. Toxicol Lett, 2016, 241: 103-110.

[20] Hu SM, Kong J, Sun ZL, et al. Heterologous protein display on the cell surface of lactic acid bacteria mediated by the s-layer protein. Microb Cell Fact, 2011, 10: 86.

[21] Kobierecka P, Wyszyńska A, Maruszewska M, et al. Lactic acid bacteria as a surface display platform for Campylobacter jejuni antigens. J Mol Microbiol Biotechnol, 2015, 25(1): 1-10.

[22] Heine SJ, Franco-Mahecha OL, Chen XT, et al. Shigella IpaB and IpaD displayed on L. Lactis bacterium-like particles induce protective immunity in adult and infant mice. Immunol Cell Biol, 2015, 93(7): 641-652.

[23] Steen A, Buist G, Leenhouts KJ, et al. Cell wall attachment of a widely distributed peptidoglycan binding domain is hindered by cell wall constituents. J Biol Chem, 2003, 278(26): 23874-23881.

[24] Yu MF, Zuo JR, Gu H, et al. Domain function dissection and catalytic properties of Listeria monocytogenes p60 protein with bacteriolytic activity. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(24): 10527-10537.

[25] Yebra MJ, Monedero V, Pérez-Martínez G, et al. Genetically engineered Lactobacilli for technological and functional food applications. Rigeka: InTech Open Access Publisher, 2012: 143-168.

[26] Schmidt RL, Filak HC, Lemon JD, et al. A LysM and SH3-domain containing region of the Listeria monocytogenes p60 protein stimulates accessory cells to promote activation of host NK cells. PLoS Pathog, 2011, 7(11): e1002368.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction of Lactobacillus rhamnosus GG particles surface display system

Runyu Su1, Boyao Nie1, Shengling Yuan2, Haoxia Tao2, Chunjie Liu2, Bailiang Yang1, and Yanchun Wang2

1 Animal Science and Animal Medicine College, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
2 Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China

To describe a novel particles surface display system which is consisted of gram-positive enhancer matrix (GEM) particles and anchor proteins for bacteria-like particles vaccines, we treated Lactobacillus rhamnosus GG bacteria with 10% heated-TCA for preparing GEM particles, and then identified the harvested GEM particles by electron microscopy, RT-PCR and SDS-PAGE. Meanwhile, Escherichia coli was induced to express hybrid proteins PA3-EGFP and P60-EGFP, and GEM particles were incubated with them. Then binding of anchor proteins were determined by Western blotting, transmission electron microscopy, fluorescence microscopy and spectrofluorometry. GEM particles preserved original size and shape, and proteins and DNA contents of GEM particles were released substantially. The two anchor proteins both had efficiently immobilized on the surface of GEM. GEM particles that were bounded by anchor proteins were brushy. The fluorescence of GEM particles anchoring PA3 was slightly brighter than P60, but the difference was not significant (P>0.05). GEM particles prepared from L. rhamnosus GG have a good binding efficiency with anchor proteins PA3-EGFP and P60-EGFP. Therefore, this novel foreign protein surface display system could be used for bacteria-like particle vaccines.

Lactobacillus rhamnosus GG, GEM particles, anchor protein, surface display, identify

s: Bailiang Yang. E-mail: bailiangyang@163.com Yanchun Wang. Tel: +86-10-66948837; E-mail: springwyc@163.com

10.13345/j.cjb.160195

蘇潤雨，聶伯堯，袁盛凌, 等. 鼠李糖乳桿菌顆粒表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(1): 132–140.

Su RY, Nie BY, Yuan SL, et al. Construction of Lactobacillus rhamnosus GG particles surface display system. Chin J Biotech, 2017, 33(1): 132–140.

Received: May 10, 2016; Accepted: August 15, 2016