家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜分析

侯勇，田莎，郭超，周霞，陳世達(dá)，楊歡，趙萍，夏慶友

西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜分析

侯勇，田莎，郭超，周霞，陳世達(dá)，楊歡，趙萍，夏慶友

西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

蛻皮液是存在于新舊表皮之間的一層液體，在昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育的過程中發(fā)揮了重要的作用。為進(jìn)一步探究家蠶蛻皮液的功能，利用雙向電泳技術(shù)對(duì)家蠶預(yù)蛹期及羽化前期的蛻皮液的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，預(yù)蛹期及羽化前期的蛻皮液中分別可以檢測(cè)出超過200個(gè)蛋白點(diǎn)，它們主要分布在等電點(diǎn)4-9、分子量10-180 kDa之間。利用MALDI TOF/TOF對(duì)羽化前期蛻皮液的42個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表明34個(gè)蛋白點(diǎn)成功得到了鑒定，它們主要包括載脂蛋白類、蛋白酶與蛋白酶抑制劑、免疫相關(guān)蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白等，部分蛋白在預(yù)蛹期的蛻皮液和羽化前的蛻皮液之間存在明顯的差異表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果，對(duì)其中1個(gè)差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)Apolipoprotein D進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，Q-PCR的結(jié)果表明，該蛋白主要在化蛹第 1–4天存在高表達(dá)，其在羽化前蛻皮液中的高度累積暗示了它可能參與了家蠶羽化變態(tài)的過程。以上研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了人們對(duì)蛻皮液蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)，為深入研究蛻皮液蛋白質(zhì)的功能提供了一些參考。

家蠶，蛻皮液，雙向電泳，變態(tài)發(fā)育，載脂蛋白

蛻皮和變態(tài)是自然界一種奇妙的生物學(xué)現(xiàn)象，舊的表皮褪去，新的表皮形成，伴隨著生物體不斷生長(zhǎng)和發(fā)育，代表著生物體組織器官的新生。以家蠶為例，大部分家蠶品種在幼蟲階段會(huì)經(jīng)歷 4次蛻皮，每次蛻皮前，家蠶都停止進(jìn)食桑葉，進(jìn)入到“眠”狀態(tài)[1]。在家蠶眠過程中，舊表皮漸漸變薄變軟，新的表皮逐漸形成，并且在新舊表皮之間出現(xiàn)了一種液體，人們稱之為“蛻皮液”[2]。蛻皮液可以將新舊表皮進(jìn)行隔離，并負(fù)責(zé)將表皮之間的組織進(jìn)行降解和融化，從而幫助家蠶完成蛻皮過程[3]。

1993年，有研究者從煙草天蛾 Manduca sexta的蛻皮液純化出一種幾丁質(zhì)酶，它可以在體外降解昆蟲幾丁質(zhì)外表皮，因而被推測(cè)在蛻皮過程中發(fā)揮了重要的作用[4]。20世紀(jì)90年代，陳長(zhǎng)琨曾用電鏡以及組織化學(xué)方法對(duì)小地老虎幼蟲蛻皮腺的形態(tài)與結(jié)構(gòu)進(jìn)行過分析，結(jié)果表明，蛻皮液是粘多糖或糖蛋白性質(zhì)的，它由導(dǎo)管分泌到新舊表皮之間發(fā)揮作用[5]；2000年，有學(xué)者從煙草天蛾Manduca sexta的蛻皮液中分離得到了一種蛋白酶抑制劑，它對(duì)真菌的蛋白酶具有很強(qiáng)的抑制活性[6]。雖然人們知道蛻皮液的存在，但是蛻皮液僅在眠期或變態(tài)發(fā)育前由蛻皮腺分泌，存在于昆蟲的新舊表皮的縫隙之間，量微少且很快就會(huì)消失，因此，大部分昆蟲之前很少有對(duì)蛻皮液?jiǎn)为?dú)的研究報(bào)道。

家蠶是一種可以人工飼養(yǎng)的鱗翅目昆蟲，在末齡期的家蠶個(gè)體較大，取材方便。在過去的幾十年中，家蠶在生理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)等方面積累了豐富的研究數(shù)據(jù)[7-8]。2014年，有研究學(xué)者利用HPLC-MS的方法對(duì)家蠶的蛻皮液進(jìn)行了研究，重點(diǎn)對(duì)其中與幾丁質(zhì)酶相關(guān)的蛋白進(jìn)行了分析，為蛻皮液的研究提供了良好的借鑒[9]；同年，Zhang等利用LC-MS/MS的方法對(duì)家蠶眠期蛻皮液、預(yù)蛹期蛻皮液和羽化前蛻皮液進(jìn)行了分析，對(duì)三者的成分進(jìn)行了比較研究，并利用RNAi的方法對(duì)其中20余個(gè)基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證[10]。為了獲得更加豐富的信息，本研究采用另外一種蛋白質(zhì)組的研究方法——雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)家蠶的蛻皮液進(jìn)行了分析，獲得了高精度的蛻皮液雙向電泳圖譜，并利用 MALDI TOF/TOF的方法對(duì)其中部分蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，本結(jié)果將進(jìn)一步豐富家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)的研究信息，為闡明其功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器設(shè)備

雙向電泳所用等電聚焦膠條、IPG緩沖液、低熔點(diǎn)瓊脂糖等均購自GE Healthcare公司。緩沖溶液試劑，包括尿素、DTT、CHAPS均購自Sigma公司。SDS-PAGE電泳凝膠及緩沖溶液配制試劑均購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。質(zhì)譜所用試劑，包括 a-氰基-4羥基肉桂酸、三氟乙酸、乙腈等購置于Sigma公司。RNA提取試劑盒 TRIZOL Reagent購自Invitrogen公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。引物合成在上海英駿公司完成。雙向電泳儀器Ettan IPGPhor 3，SE600 垂直型電泳設(shè)備、Image scanner掃描儀及軟件 Image master 購自 GE Healthcare 公司。質(zhì)譜分析設(shè)備 MALDI TOF-TOF (AB Sciex 5800) 購自 AB Sciex 公司。雙向電泳和質(zhì)譜分析均在家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 材料

家蠶大造品種由家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (西南大學(xué)) 提供，12 h光照、12 h黑暗交替，25 ℃培養(yǎng)箱恒溫內(nèi)飼養(yǎng)，以桑葉喂食直到羽化。蛻皮液取材參照文獻(xiàn)[9]，預(yù)蛹期蛻皮液取材：取化蛹前6 h家蠶，用鑷子小心地剝開頭部，用微量注射器小心吸取新舊表皮間蛻皮液，取15頭蠶蛻皮液作為1個(gè)樣本；羽化前蛻皮液取材：取化蛹后第 9天材料，用解剖針在蛹的尾部輕輕扎小洞，然后將蛹放入1.5 mL離心管中，300 r/min離心1 min，以15頭蛹蛻皮液為一個(gè)樣本，獲得的無色透明液體即為羽化前蛻皮液。每種蛻皮液準(zhǔn)備 3個(gè)樣本，采用Bradford法對(duì)蛻皮液蛋白質(zhì)進(jìn)行定量[11]，加入苯基硫脲和蛋白酶抑制劑防止黑化和蛋白降解，–80 ℃冰箱進(jìn)行保存。為進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR (Q-PCR) 實(shí)驗(yàn)，取5齡起蠶到蛹第9天的材料，去除幼蟲家蠶中腸內(nèi)的桑葉，液氮冷凍后，研磨成粉，置于TRIZOL中保存。

1.3 SDS-PAGE電泳和雙向電泳分析

每個(gè)樣品取 15 μg 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)分析，凝膠濃度為12.5%，100 V恒壓進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。雙向電泳實(shí)驗(yàn)采用Ettan IPGPhor 3進(jìn)行等電聚焦分析，采用13 cm膠條，pH 3-10，總蛋白質(zhì)上樣量為 150 μg，采用梯度升壓的方式進(jìn)行聚焦電泳：50 V水化12 h，100 V 1 h，500 V 2 h，1 000 V 1 h，5 000 V 1 h，8 000 V，40 000 Vh。聚焦結(jié)束后進(jìn)行第一步平衡，平衡液配方為 6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，0.07% SDS，30% 甘油，1% DTT；之后進(jìn)行第二步平衡，平衡液配方為 6 mol/L 尿素，

50 mmol/L Tris-HCl，0.07% SDS，30% 甘油，1.25%碘乙酰胺，每次平衡需15 min。平衡結(jié)束后，將膠條轉(zhuǎn)移至已制好的SDS-PAGE膠面上，凝膠濃度為12.5%，用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行密封。采用 SE600 垂直型電泳設(shè)備進(jìn)行電泳，

20 mA/min，電泳大約進(jìn)行4-5 h，待溴酚藍(lán)電泳至距玻璃板底部0.5 cm處時(shí)，停止電泳，按照標(biāo)準(zhǔn)雙向電泳銀染染色的方法進(jìn)行銀染分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用Image scanner掃描儀對(duì)雙向電泳圖譜進(jìn)行掃描，利用 Image master軟件對(duì)圖譜中的蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.4 MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析

在羽化前蛻皮液的雙向電泳凝膠中，選取42個(gè)表達(dá)量較高的蛋白點(diǎn)進(jìn)行挖取，參考之前的方法對(duì)銀染的樣品進(jìn)行處理[12]，采用胰蛋白酶Trypsin進(jìn)行膠內(nèi)消化20 h，處理結(jié)束后將樣品按照1∶1比例與基質(zhì)液CHCA (a-氰基-4羥基肉桂酸) 進(jìn)行混合，取1 μL點(diǎn)樣，空氣中晾干后采用MALDI TOF-TOF (AB Sciex 5800) 進(jìn)行質(zhì)譜分析。在質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)中，首先采用反射模式收集信號(hào)，激光電壓為3 300 V，收集信號(hào)強(qiáng)度較好的5-10個(gè)母離子肽段進(jìn)行碎裂，產(chǎn)生二級(jí)碎片信息，采用外標(biāo)的方式對(duì)母離子峰圖和二級(jí)碎片峰圖進(jìn)行校正。

1.5 利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定分析

下載家蠶基因組蛋白數(shù)據(jù)庫 (ftp://ftp. genomics.org.cn/pub/Silkdb/Gene_Annotation/Pro tein/SW_ge2k_BGF.pep)[13]，利用Mascot軟件構(gòu)建本地質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫，酶切方式設(shè)置為Trypsin，母離子最大誤差設(shè)為100 ppm，離子類型選擇為 Monoisotopic mass，最大 missed cleavages 值 設(shè)置 為 2， 固 定 修 飾 設(shè) 為Carbamidomethyl (C)， 可 變 修 飾 設(shè) 置 為Oxidation (M) 和Deamidated (NQ)，按照Mascot軟件標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行檢索鑒定分析，陰影區(qū)域以外的鑒定結(jié)果視為可信的結(jié)果。

1.6 Apolipoprotein D 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

按照 TRIZOL說明書提取不同發(fā)育時(shí)期的整蠶材料總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以 5齡起蠶到化蛹后第 9天發(fā)育時(shí)期的cDNA為模板，并將其稀釋至100 ng/μL后，通過Q-PCR對(duì)Apolipoprotein D基因的時(shí)期表達(dá)情況進(jìn)行分析。Q-PCR反應(yīng)體系如下：ddH2O 6 μL，正向引物0.8 μL，反向引物 0.8 μL，SYBR 10 μL，Reference DyeⅡ 0.4 μL ，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性30 s，循環(huán)反應(yīng)進(jìn)行40次，條件為95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，以家蠶的探針號(hào)sw22934為內(nèi)參基因，定量的結(jié)果用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行比較分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.7 Apolipoprotein D蛋白同源序列比對(duì)分析

下載家蠶Apolipoprotein D序列 (GenBank Accession No. NP_001140192.1) 和美國(guó)白蛾序列hyphantrin (GenBank Accession No. AAM18117.2)，采用Bioedit 軟件將家蠶Apolipoprotein D蛋白序列與美國(guó)白蛾同源序列 hyphantrin進(jìn)行比對(duì)分析。保守結(jié)構(gòu)域利用NCBI在線的CCD軟件進(jìn)行分析，脂蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域用粗實(shí)線標(biāo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)電泳分析

利用 SDS-PAGE對(duì)家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)進(jìn)行了電泳分析，考馬斯亮藍(lán)的染色結(jié)果表明，蛻皮液蛋白質(zhì)在 SDS-PAGE凝膠中條帶分布清晰，并且兩個(gè)時(shí)期的蛻皮液在不同的分子量處存在明顯的差異條帶 (圖 1)。為了獲得更加詳細(xì)的研究信息，用雙向電泳技術(shù)對(duì)兩個(gè)時(shí)期的蛻皮液進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在銀染的條件下，兩種蛻皮液蛋白質(zhì)都呈現(xiàn)了清晰的二維電泳圖譜，在每種蛻皮液樣品中都能檢測(cè)到超過200個(gè)蛋白點(diǎn)，它們主要分布在中性等電點(diǎn)區(qū)域4-9之間，分子量主要分布在10-180 kDa之間(圖2)。重復(fù)電泳的結(jié)果表明，不同批次實(shí)驗(yàn)所獲得的電泳圖譜重復(fù)性好，蛋白的重復(fù)度在95%以上，高精度的雙向電泳圖譜的獲得為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 家蠶蛻皮液蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of silkworm molting fluid. M: protein marker; 1: molting fluid of prepupa; 2: molting fluid before eclosion.

2.2 不同時(shí)期蛻皮液蛋白質(zhì)雙向圖譜比較分析

對(duì)比不同時(shí)期的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)主要差異蛋白發(fā)生在分子量 30-60 kDa之間的區(qū)域(圖2)。預(yù)蛹期的蛻皮液在此范圍的蛋白點(diǎn)數(shù)量多，表達(dá)量高，甚至出現(xiàn)了蛋白融合的現(xiàn)象，而羽化前蛻皮液相對(duì)來講蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量少，分布更加清晰、均勻。此外，低分子量的蛋白在不同樣品之間也有一些明顯的差異。為了進(jìn)一步了解蛻皮液的功能，在羽化前的雙向電泳圖譜中選取了42個(gè)表達(dá)量較高的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了挖取 (圖3)，在進(jìn)行膠內(nèi)酶解等一系列實(shí)驗(yàn)之后，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)它們進(jìn)行鑒定和分析。

圖 2 家蠶化蛹前 (A) 和羽化前 (B) 蛻皮液雙向電泳分析Fig. 2 Two-dimensional electrophoresis map of molting fluid extracted from prepupa (A) and late pupa before eclosion (B).

圖3 家蠶羽化前蛻皮液蛋白點(diǎn)的挖取與鑒定Fig. 3 Excision and identification of spots from the map of silkworm molting fluid before eclosion.

2.3 羽化前期蛻皮液蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

采用一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)碎片相結(jié)合的鑒定方法，大部分蛋白點(diǎn)都可以獲得良好的肽質(zhì)量指紋圖譜峰圖，所選的母離子肽段經(jīng)碰撞碎裂獲得了比較豐富的碎片信息，為蛋白的鑒定提供了有利的幫助。經(jīng)過Mascot 軟件的分析，最終確定了34個(gè)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，它們得分較高，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量與預(yù)期都相符，二級(jí)碎片信息有效支持了肽質(zhì)量指紋圖譜的鑒定結(jié)果。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)這其中包括了觸角結(jié)合蛋白(Antennal binding protein)、營(yíng)養(yǎng)貯藏蛋白 (30 kDa proteins)、載脂蛋白 (Apolipoprotein)、蛋白酶(Peptidase)、蛋白酶抑制劑 (CI-8) 等。進(jìn)一步的分析表明，有部分蛋白出現(xiàn)在不同的蛋白點(diǎn)中，如編碼為BGIBMGA003660的蛋白出現(xiàn)在3、8、9、12號(hào)蛋白點(diǎn)，編碼為BGIBMGA004397的蛋白出現(xiàn)在28、29號(hào)蛋白點(diǎn)中 (表2)。

為了進(jìn)一步分析兩個(gè)時(shí)期蛻皮液的差異蛋白質(zhì)，我們將低分子量處部分蛋白點(diǎn)進(jìn)行了比較，從圖中可以看出 (圖 2和圖 3)，有些蛋白質(zhì)在預(yù)蛹前的蛻皮液中表達(dá)量較高，如蛋白點(diǎn)1，被鑒定為觸角結(jié)合蛋白；另外一些蛋白質(zhì)在羽化期的蛻皮液中的含量相對(duì)較高，如蛋白點(diǎn)9和12，被鑒定為C型凝集素蛋白 (C-type lectin protein)。對(duì)于蛋白點(diǎn)15，它在羽化前的蛻皮液中的蛋白含量較高，而在預(yù)蛹期的蛻皮液中幾乎不存在。Mascot的結(jié)果顯示，該蛋白被鑒定為32 kDa載脂蛋白前體 (32 kDa apolipoprotein precursor)，SilkDB 數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)編號(hào)BGIBMGA002703。分析表明，該蛋白具有Lipocalin結(jié)構(gòu)域，與其他物種的Apolipoprotein D具有較高的相似度。為驗(yàn)證該蛋白的鑒定結(jié)果，對(duì)其一級(jí)質(zhì)譜峰圖及二級(jí)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，其肽質(zhì)量指紋圖譜中產(chǎn)生了超過20個(gè)肽段峰，信噪比高，二級(jí)碎片圖譜中碎裂效果好，質(zhì)荷比為1 142的母離子產(chǎn)生的碎片信息可以被良好解析，證實(shí)了該蛋白鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性 (圖4)。

2.4 Apolipoprotein D發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)Apolipoprotein蛋白 (蛋白點(diǎn) 15) 隨著家蠶發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，對(duì)該蛋白進(jìn)行了信息學(xué)的調(diào)查，并采用Q-PCR的方法對(duì)其編碼基因在發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該蛋白屬于載脂蛋白家族成員，目前沒有明確的功能報(bào)道，但是其與美國(guó)白蛾的 hyphantrin基因具有較高的相似性 (圖 5)。Q-PCR的結(jié)果顯示，該蛋白在化蛹第1天到第4天存在高量的表達(dá) (圖6)，暗示了該蛋白隨著蛹的發(fā)育逐漸轉(zhuǎn)運(yùn)到蛻皮液中，并在蛻皮液中進(jìn)行高度富集。

表2 蛻皮液蛋白質(zhì)鑒定列表Table 2 List of identified proteins from molting fluid of silkworm

圖4 蛋白點(diǎn)15肽質(zhì)量指紋圖譜及二級(jí)碎片峰圖Fig. 4 Identification of spot 15 from map of molting fluid by peptide mass fingerprint and MS/MS. (A) Peptide mass fingerprint of spot 15 under the positive ion reflection mode after digestion by trypsin. (B) Fragment ion segments from the precursor ions of 1 142.55.

圖5 家蠶和美國(guó)白蛾Apoliprotein D同源蛋白比對(duì)分析Fig. 5 Sequence alignment of Apoliprotein D from Bombyx mori and Hyphantria cunea. The accession numbers for the sequences were as following: Bombyx mori (NP_001140192.1), Hyphantria cunea (AAM18117.2). The conserved domain were marked by the solid lines under the sequences.

圖6 Apoliprotein D基因在發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析Fig. 6 Expression patterns of Apoliprotein D during the developmental stages. 5Q: new silkworm of the 5th instar; 5-1 to 5-7: the 1st day of the 5th instar to the 7th day of the 5th instar; W1, W2: the 1st day of wandering stage and the 2nd day of wandering stage; P1 to P9: the 1st day of pupa to the 9th day of pupa.

3 討論

隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和精度越來越高，液相色譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)在現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛[14]。但是，雙向電泳技術(shù)由于其分辨率高、成本相對(duì)較低的特點(diǎn)仍然在目前蛋白質(zhì)組研究中占有重要地位[15]。雙向電泳所獲得圖譜清晰、直觀，容易給研究者留下深刻的印象，并且在圖譜中可發(fā)現(xiàn)潛在的蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化等蛋白質(zhì)修飾作用，為下一步研究提供重要的參考信息。

之前，本課題組利用雙向電泳等技術(shù)對(duì)家蠶的血液、絲腺、生殖腺和馬氏管等組織進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為家蠶蛋白質(zhì)組的研究提供了豐富的信息[16-17]。2010年，我們利用雙向電泳技術(shù)對(duì)家蠶不同發(fā)育時(shí)期的血液樣品進(jìn)行過調(diào)查，鑒定了一些重要的蛋白質(zhì)，為后期的研究提供了重要的參考[18]。本文利用了雙向電泳結(jié)合飛行質(zhì)譜的研究方法對(duì)家蠶的蛻皮液進(jìn)行分析，每個(gè)時(shí)期的圖譜中都可以分離出超過 200個(gè)蛋白點(diǎn)。整體來看，不同時(shí)期蛻皮液蛋白質(zhì)在中分子量處差異較大，而低分子量處的分布更為清晰，蛻皮液雙向電泳圖譜的獲得可以為今后蛻皮液蛋白質(zhì)的研究提供參考。

在蛋白質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)中，采用了一級(jí)質(zhì)譜結(jié)合二級(jí)碎片共同鑒定的方法，在42個(gè)蛋白中，有34個(gè)蛋白質(zhì)獲得了可信的鑒定結(jié)果。分析結(jié)果顯示，營(yíng)養(yǎng)蛋白30 kDa仍然集中分布于蛻皮液中，成功鑒定到了Bmlp1-3、Bmlp6-7、Bmlp15等蛋白質(zhì)，由于30 kDa蛋白質(zhì)豐度的差異，我們相信還有更多種類的30 kDa蛋白質(zhì)存在于蛻皮液中[19-20]。從圖譜中可以看出，預(yù)蛹期的蛻皮液的30 kDa蛋白分布和羽化前期的30 kDa蛋白的分布模式明顯不同，暗示了不同30 kDa蛋白在不同發(fā)育時(shí)期的作用。蛻皮液中有很多蛋白質(zhì)與免疫活動(dòng)有關(guān)系，如C型凝集素蛋白 (C-typelectin protein)、抑血細(xì)胞聚集素 (Hemolin)、抑凝乳蛋白酶抑制劑 (Antichymotrypsin)、絲氨酸蛋白酶抑制劑 (Serpin) 等，它們?cè)谕懫ひ旱谋磉_(dá)量都比較高，有些蛋白，如C-type lectin，出現(xiàn)在不同的分子量和等電點(diǎn)處，推測(cè)這類蛋白存在著潛在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，這也與之前人們對(duì)蛻皮液蛋白質(zhì)多為糖蛋白的推論相符[5]。家蠶在蛻皮變態(tài)的過程中，容易受到外界環(huán)境的影響，蛻皮液中的免疫蛋白對(duì)于新組織的形成會(huì)起到保護(hù)作用。有研究者將不同時(shí)期提取的蛻皮液與病原微生物進(jìn)行了混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期的蛻皮液均可以有效抑制病原微生物的生長(zhǎng)[10]。

家蠶蛻皮過程中，大量的舊組織被溶解，組織蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在其中扮演了重要角色。Qu等從蛻皮液中鑒定出 4個(gè)幾丁質(zhì)酶、3個(gè)幾丁質(zhì)去乙酰化酶、4個(gè) β-乙酰氨基己糖苷酶，它們變態(tài)發(fā)育階段呈現(xiàn)了較為活躍的表達(dá)特征[9]。當(dāng)這些基因被干涉時(shí)，昆蟲出現(xiàn)了蛻皮異常的現(xiàn)象[21-23]。蛋白質(zhì)組定量分析的結(jié)果表明，這些蛋白在化蛹前蛻皮液中的峰度要比羽化前蛻皮液峰度高[9]。從本研究獲得的蛻皮液的雙向電泳圖譜可以看出，化蛹前蛻皮液圖譜中40-80 kDa處有大量的蛋白點(diǎn)存在，幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)去乙?；?、β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶等蛋白質(zhì)的分子量大多在此范圍，我們推測(cè)這些蛋白點(diǎn)可能包含了與幾丁質(zhì)相關(guān)的蛋白酶類。翅原基生長(zhǎng)因子 (Imaginal disk growth factor，蛋白點(diǎn) 30) 是本研究鑒定出來的一種具有幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它沒有幾丁質(zhì)酶的活性，可能是在長(zhǎng)期的分子進(jìn)化過程中喪失了幾丁質(zhì)降解功能[9]。本次實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白質(zhì)來源于羽化前期的雙向電泳凝膠中，鑒于蛋白點(diǎn)選擇和鑒定數(shù)量的原因，我們沒有鑒定到其他的幾丁質(zhì)相關(guān)的蛋白酶。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 (Chitin binding protein，蛋白點(diǎn) 10,11) 是具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，它們雖然可以與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，但是其缺乏酶催化功能性結(jié)構(gòu)域[24]，果蠅中研究表明，該類蛋白質(zhì)可與Knk等蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，可能參與到了新表皮免于被蛻皮液降解的功能[25]，在后續(xù)的研究中我們將對(duì)其組織定位和功能進(jìn)行進(jìn)一步分析。本實(shí)驗(yàn)中我們還鑒定到了組織蛋白酶 (Peptidase) 和蛋白酶抑制劑(Serpin 10) 等，有研究報(bào)道，組織蛋白酶參與昆蟲的變態(tài)發(fā)育，RNAi干涉組織蛋白酶基因可導(dǎo)致昆蟲無法正常蛻皮[26]；絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)于許多酶來講具有調(diào)節(jié)活性的功能[27]，蛋白酶抑制劑 (Serpin 10) 在蛹的后期蛻皮液中有高水平的表達(dá)，推測(cè)該蛋白可能在羽化變態(tài)的發(fā)育過程中扮演了重要的角色。

從蛋白質(zhì)組的結(jié)果來看，Apoliprotein D (蛋白點(diǎn) 15) 在羽化前的蛻皮液中表達(dá)量很高，然而在預(yù)蛹期的蛻皮液中幾乎不存在。Apoliprotein D是一類載脂蛋白，它在昆蟲中研究報(bào)道較少，但是在脊柱動(dòng)物中卻是一種重要的生物標(biāo)志物，如在阿爾茨海默病的病人腦組織中，隨著病癥的加重，Apoliprotein D的表達(dá)量持續(xù)上升[28]。在不同發(fā)育時(shí)期的血液的蛋白質(zhì)組分析中，我們?cè)谟己笃诘难褐需b定到了另外一種 Apoliprotein D 蛋白，編號(hào)為BGIBMGA002704，它在蛹后期的血液中有特異表達(dá)[18]。我們認(rèn)為這類蛋白可能跟蛹后期羽化變態(tài)的過程有關(guān)系，其具體的功能有待進(jìn)一步研究分析。除此之外，蛋白點(diǎn)2和39同樣被鑒定為Apoliprotein D，這一結(jié)果暗示了該蛋白可能與其他蛋白具有結(jié)合作用，以復(fù)合物的形式執(zhí)行其生理功能。

綜上所述，本研究利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜的方法成功地對(duì)家蠶預(yù)蛹階段和羽化前的蛻皮液進(jìn)行了分析，獲得了分辨率比較好的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，并對(duì)其中表達(dá)量較高的蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。在后續(xù)的研究中，我們將選取其中靶標(biāo)蛋白進(jìn)行深入研究，為揭示蛻皮液蛋白質(zhì)在家蠶蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程中的作用提供幫助。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Analysis of molting fluid in silkworm (Bombyx mori) by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry

Yong Hou, Sha Tian, Chao Guo, Xia Zhou, Shida Chen, Huan Yang, Ping Zhao, and Qingyou Xia

State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Molting fluid, a liquid between the old epidermis and new epidermis, plays an important role in the process of ecdysis and metamorphosis for insect. In order to explore the function of molting fluid, we used two-dimensional electrophoresis to study the molting fluid during the prepupal stage and pre-eclosion stage. More than 200 protein spots were found in the molting fluid of the 2 stages, which distributed in the 4-9 of pI and 10-180 kDa of molecular weight. We selected 42 spots to be analyzed by the matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI TOF/TOF) from the molting fluid of pre-eclosion stage, of which 34 proteins were identified successfully, including apolipoprotein, protease and protease inhibitors, chitin-binding protein and protein involved in immunity. Some of the proteins demonstrated differential expression between the two stages of metamorphosis. In order to validate the result from proteomics analysis, we studied expression of the apolipoprotein D by Q-PCR from the developmental stages. The results showed that the gene encoding apolipoprotein D had the high expression from the 1st day to the 4th day of the pupa stage, which indicated they could be involved in eclosion due to the abundant accumulation in the late pupa. Our results offered more clues for understanding the mechanism of ecdysis and metamorphosis in insect and could give reference for further study of molting fluid.

silkworm, molting fluid, two-dimensional electrophoresis, metamorphosis, apolipoprotein

Ping Zhao. Tel: +86-23-68250885; Fax: +86-23-68251128; E-mail: zhaop@swu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160219

Received: June 2, 2016; Accepted: August 4, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31530071), Frontier and Basic Project of Chongqing (No. ctsc2015jcyjA80024).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31530071)，重慶市前沿與基礎(chǔ)項(xiàng)目 (No. ctsc2015jcyjA80024) 資助。

時(shí)間：2016-09-12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160912.1114.002.html

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