降脂寧提取物對血管鈣化的影響及其機制

陳慧敏　劉思齊　左風云　楊英

[摘要] 目的 研究降脂寧提取物對血管鈣化的影響及其可能的機制。 方法 將三月齡雄性Wistar大鼠40只依據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、高脂鈣化組、降脂寧組、阿托伐他汀組和復藥組（降脂寧+阿托伐他?。?，每組8只。15周后取血檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；取胸和腹主動脈分別測定血管鈣、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量及堿性磷酸酶（ALP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性；同時，各組大鼠取胸主動脈用TUNEL法測定細胞凋亡率，用Western blot檢測caspase-3蛋白表達水平。 結(jié)果 與對照組比較，高脂鈣化組血清TG和TC含量均明顯升高（P < 0.01）；阿托伐他汀組及復藥組血清TG、TC和LDL，降脂寧組血清TC均明顯低于高脂鈣化組（P < 0.01）；復藥組血清LDL明顯低于對照組、高脂鈣化組和降脂寧組（P < 0.01）。與對照組比較，高脂鈣化組血管鈣含量和ALP活性明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）；與高脂鈣化組比較，降脂寧組血管鈣含量和ALP活性明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），復藥組血管ALP活性明顯降低（P < 0.01）。與對照組比較，高脂鈣化組血管MDA含量明顯升高（P < 0.01），而復藥組明顯低于其他四組（P < 0.01）；與對照組比較，高脂鈣化組血管NO含量明顯降低（P < 0.01）。與對照組比較，高脂鈣化組血管平滑肌細胞凋亡率明顯升高（P < 0.01）；各給藥組血管平滑肌細胞凋亡率均明顯低于高脂鈣化組（P < 0.01）。與對照組比較，高脂鈣化組血管caspase-3灰度比明顯升高（P < 0.01）；各給藥組血管caspase-3灰度比明顯低于高脂鈣化組（P < 0.01）。 結(jié)論 降脂寧提取物和阿托伐他汀均有明確的降脂療效，而兩藥結(jié)合降低LDL的效果尤為明顯，其作用可能與抗氧化作用有關；降脂寧組和復藥組均能降低血管鈣含量和ALP活性，具有一定的抑制血管鈣化作用，其作用可能與其抑制血管平滑肌細胞凋亡和下調(diào)caspase-3的表達水平有關。

[關鍵詞] 降脂寧提取物；阿托伐他??；血管鈣化；凋亡；抗氧化

[中圖分類號] R331 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0025-04

Effects and mechanism of Jiangzhining extract on vascular calcification

CHEN Huimin LIU Siqi ZUO Fengyun YANG Ying

Department of Physiology， Basic School of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010110， China

[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of Jiangzhining extract on vascular calcification. Methods Three months old male Wistar rats （n=40） were divided into control group， high-fat calcification group， Jiangzhining group， Atorvastatin group and mixture group （Jiangzhining plus Atorvastatin） by using random number table method， each group was 8 rats . After 15 weeks， the levels of serum total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， high-density lipoprotein （HDL） and low density lipoprotein （LDL） were detected， the contents of vascular calcium， malondialdehyde （MDA） and nitric oxide （NO） were observed and activity of alkaline phosphatase （ALP） and superoxide dismutase （SOD） were measured on the chest and abdomen aorta. The apoptosis rates of the vascular smoothmuscle cells were observed via in situ apoptosis detection （TUNEL） and the protein expression level of caspase-3 was detected by Western blot. Results Compared with control group， the levels of TG and TC in high-fat calcification group were significantly increased （P < 0.01）. The levels of serum TG， TC and LDL in Atorvastatin group and mixture group were significantly lower than those in high-fat calcification group， level of serum TC in Jiangzhining group was significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. The level of serum LDL in mixture group was significantly lower than those in control group， high-fat calcification group and Jiangzhining group （P < 0.01）. Compared with control group， vascular calcium content and ALP activity in high-fat calcification group were increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with high-fat calcification group， vascular calcium content and ALP activity in Jiangzhining group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， ALP activity in mixture group was decreased significantly （P < 0.01）. Compared with control group， MDA level in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）， MDA content in mixture group was obviously lower than those in other four groups （P < 0.01）. Compared with control group， NO content in high-fat calcification group was decreased significantly （P < 0.01）. Compared with control group， the apoptosis rate of thoracic aorta cell in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）. The apoptosis rates of thoracic aorta cells in all drug-treated groups were significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. Compared with control group， gamma ratio of vascular caspase-3 in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）. Gamma ratios of vascular caspase-3 in all drug-treated groups were significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. Conclusion Jiangzhining extract and Atorvastatin can decrease lipid level， and the effect is increased， particular in level LDL， after two drugs alliance treatment， the effect may be related with the antioxidant function. Jiangzhining group and mixture group can inhibit vascular calcification， which may be related to decline vascular calcium content and ALP activity， the effect may be related to its inhibition of vascular smooth muscle cell apoptosis and down regulation of caspase-3 expression.

[Key words] Jiangzhining extract； Atorvastatin； Vascular calcification； Apoptosis； Anti-oxidation

血管鈣化常發(fā)生于動脈粥樣硬化性血管病變，也存在于糖尿病、慢性腎病、高血壓等疾病的病理過程中，是導致心腦血管疾病高死亡率的重要因素[1]。以往認為，血管鈣化是鈣鹽在血管壁的被動沉積，然而近年來許多研究結(jié)果顯示，血管鈣化是一個主動的、可調(diào)節(jié)的過程，與骨形成過程有相似之處[2]。因此，如何主動對血管鈣化進行干預，降低其風險，成為亟待解決的問題。由于血管鈣化的發(fā)生與骨形成過程有相似之處，因此用于治療骨質(zhì)疏松的藥物可能會干擾血管壁的鈣磷代謝；而用于治療心血管疾病的藥物又有可能對骨組織代謝產(chǎn)生影響，這在很大程度上使血管鈣化的治療處于兩難境地，難以找到有效防治途徑[3-4]。降脂寧提取物由何首烏、山楂、荷葉、決明子四味中藥組方提取，具有調(diào)脂及抗動脈粥樣硬化作用，阿托伐他汀具有明確的降脂作用和心血管保護作用。本研究在高脂血癥合并血管鈣化的大鼠模型上，利用降脂寧提取物結(jié)合阿托伐他汀共同干預，研究其對血管鈣化的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡雄性Wistar大鼠40只，體重（180±20）g，清潔級，由內(nèi)蒙古大學實驗動物中心提供。實驗前，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%。

1.2 實驗藥品與試劑

制首烏、山楂、荷葉、決明子購自北京同仁堂醫(yī)藥集團北城批發(fā)部。參照《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》（中藥）第十三冊收載降脂寧生產(chǎn)工藝制備降脂寧提取物。阿托伐他汀鈣膠囊由河南天方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（20 mg/粒）。高脂飼料配方：1.2%膽固醇、10%豬油、5%蔗糖、0.2%膽酸鈉、83.6%基礎飼料，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司加工。堿性磷酸酶（ALP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物制品有限公司，尼古丁購自Sigma公司。TUNEL法凋亡試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展公司（批號：KGA702），caspase抗體購自Cell Signaling公司（批號：9664）。

1.3 實驗分組及動物模型制備

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將其分為5組，每組8只。對照組：普通飼料喂養(yǎng)；高脂鈣化組：大鼠上午8：00給予維生素D3（300 kU/kg）肌內(nèi)注射，尼古丁溶于花生油（濃度25 mg/kg）按5 mL/kg灌胃，晚上20：00給予尼古丁重復灌胃一次制備鈣化模型，給予高脂飼料喂養(yǎng)；降脂寧組：降脂寧提取物灌胃[5 g/（kg·d）]，分兩次給藥；阿托伐他汀組：阿托伐他汀鈣[10 mg/（kg·d）]灌胃，1次/d；復藥組：降脂寧提取物+阿托伐他汀鈣灌胃；各給藥組造模同高脂鈣化組，高脂飼料喂養(yǎng)6周后開始給藥，用藥共8周。

1.4 取材及標本制備

各組大鼠共同喂養(yǎng)15周后，禁食12 h，注射過量戊巴比妥鈉麻醉，股動脈取血5 mL，分離血清（-20℃貯存?zhèn)溆?，待測各項生化指標）；開胸腹取胸腹主動脈全長，分為兩部分：上胸段（約1 cm）置于中性甲醛溶液固定24 h，制成石蠟包埋塊；其余部分于-80℃冰箱保存待測各項指標。

1.5 血脂檢測

取血清送生化實驗室檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL），采用全自動生化分析儀測定。

1.6 血管鈣含量及ALP活性檢測

取胸主動脈1 cm，烤干稱重后進行消化，去離子水復溶，用原子吸收分光光度計在422.7 nm波長處讀取吸光度，測定組織的鈣含量，并換算成μmol/（mg·dw）。取腹主動脈約1 cm制備組織勻漿，吸取上清液測定血管組織ALP活性。結(jié)果用考馬斯亮藍法測定的總蛋白含量進行標準化。

1.7 血管MDA、NO含量及SOD活性檢測

取腹主動脈約1 cm制備組織勻漿，3000 r/min離心15 min，吸取上清液分別測定血管組織MDA、NO含量及SOD活性。結(jié)果用考馬斯亮藍法測定的總蛋白含量進行標準化。

1.8 胸主動脈原位凋亡檢測

按TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒說明書對胸主動脈石蠟切片進行細胞凋亡檢測。

1.9 Western blot檢測caspase-3蛋白表達

取出-80℃冰箱貯存的動脈，按試劑盒要求提取蛋白，行總蛋白定量后，取等量蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳分離后，進行轉(zhuǎn)膜，封閉。免疫反應：用TBST洗膜10 min/次，3次，室溫，搖動。加入合適稀釋度的caspase-3一抗4℃過夜，15 mL TBST洗3次，15 mL TBS洗1次。加二抗溫孵育2 h，洗滌后加入顯色液孵育1 min，放入顯色儀器設置參數(shù)顯色5 min，凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察，掃描膠片，進行灰度值掃描分析，灰度比=測得的caspase-3平均密度×面積/內(nèi)參蛋白β-actin平均密度×面積。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂水平比較

高脂鈣化組大鼠血清TG和TC顯著高于對照組（P < 0.01）；阿托伐他汀組和復藥組大鼠血清TG和TC顯著低于高脂鈣化組（P < 0.01）；降脂寧組大鼠血清TC顯著低于高脂鈣化組（P < 0.01）；與對照組比較，其余四組大鼠HDL均明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）；阿托伐他汀組和復藥組大鼠LDL顯著低于對照組、高脂鈣化組和降脂寧組（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 各組大鼠血管鈣含量及ALP活性比較

與對照組比較，高脂鈣化組大鼠血管鈣含量和ALP活性明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）；與高脂鈣化組比較，降脂寧組大鼠血管鈣含量明顯降低（P < 0.05），降脂寧組和復藥組大鼠血管ALP活性均明顯降低（P < 0.01）。

2.3 各組大鼠血管MDA含量、SOD活性及NO含量比較

高脂鈣化組大鼠血管MDA含量明顯高于對照組（P < 0.01）；復藥組大鼠血管MDA含量明顯低于其他四組（P < 0.01）；高脂鈣化組、阿托伐他汀組和復藥組大鼠血管SOD活性明顯低于對照組（P < 0.05或P < 0.01）；高脂鈣化組大鼠血管NO含量明顯低于對照組（P < 0.01）。

2.4 各組大鼠血管平滑肌細胞凋亡率比較

應用TUNEL法檢測主動脈平滑肌細胞凋亡情況，細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色沉淀物為陽性染色。對照組大鼠血管未見陽性染色；高脂鈣化組大鼠血管平滑肌見大量棕黃色沉淀物，陽性染色表達率高，細胞凋亡形態(tài)學特征明顯，細胞核存在固縮和凋亡小體；降脂寧組、阿托伐汀組和復藥組大鼠細胞核陽性表達弱，存在少量的凋亡小體和核固縮現(xiàn)象。與對照組比較，高脂鈣化組大鼠血管平滑肌細胞凋亡率明顯升高（P < 0.01），其余三組則明顯降低（P < 0.01）；與高脂鈣化組比較，降脂寧組、阿托伐汀組和復藥組大鼠血管平滑肌細胞凋亡率明顯降低（P < 0.01）。

2.5 各組大鼠血管caspase-3灰度比比較

與對照組比較，高脂鈣化組caspase-3灰度比明顯增高（P < 0.01）；與高脂鈣化組比較，降脂寧組、阿托伐汀組和復藥組大鼠caspase-3灰度比明顯降低（P < 0.01）。

3 討論

血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，常涉及多種因素，目前關于血管鈣化的預防及治療尚無明確的藥物，尤其是中藥干預以及中西藥物結(jié)合干預的研究很少見[5-6]。

高脂血癥是多種疾病的危險因素，尤其是對血管相關的病變，如動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病及高血壓等，會進一步加重原發(fā)病的血管損害[7]。本研究在經(jīng)典的維生素D3加尼古丁建立的血管鈣化模型上結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)大鼠[8]，制備了高脂鈣化模型，在該模型上給予降脂寧提取物、阿托伐他汀及兩者結(jié)合的復藥組進行干預，旨在觀察中藥降脂效果及中西藥物結(jié)合治療對高脂鈣化大鼠的血脂及血管鈣化的影響。

本實驗研究中的降脂寧提取物由制首烏、山楂、荷葉、決明子四味中藥組方提取，有研究表明，降脂寧提取物及其有效部位具有調(diào)脂及抗氧化作用[9]，而阿托伐他汀是具有明確降脂作用和心血管保護作用的他汀類藥物[10]。本研究顯示，降脂寧提取物和阿托伐他汀能明顯降低血清TG、TC和LDL含量，而兩者結(jié)合的作用比單獨降脂寧提取物和阿托伐他汀更明顯，尤其是降低LDL的作用，可使LDL水平降低到低于正常水平的范圍。因此，中西藥物結(jié)合的降脂作用明顯增強。

氧化應激不僅是高脂血癥血管損害的重要因素，也可以作為一個獨立因素促進血管鈣化的發(fā)生，氧化應激損傷通過一些細胞機制引發(fā)細胞凋亡，可能加重其心血管損害的發(fā)生[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高脂鈣化組MDA含量升高，SOD活性降低，NO含量降低，說明高脂飲食及鈣化造模對血管具有明顯的脂質(zhì)過氧化損傷和血管內(nèi)皮功能損害，而復藥組能夠明顯地降低血管MDA含量，效果優(yōu)于單獨中藥和西藥組；各用藥組也能提高血管NO含量，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；而對SOD活性的影響則顯示降脂寧組效果優(yōu)于其他兩個用藥組。

中藥對血管鈣化干預作用的研究并不多見[13]，大多以單味藥為主[14-17]，亦未見與西藥結(jié)合進行干預。他汀類藥物能夠明顯降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率，對血管和心臟有明顯的保護功能，有研究報道其具有抑制血管鈣化的作用[18]。本研究顯示，降脂寧組可降低血管鈣含量，效果優(yōu)于其他兩個用藥組；降脂寧組和復藥組均明顯降低血管ALP活性，而阿托伐他汀組效果弱于其他兩組。通過檢測各組血管細胞凋亡率和caspase-3表達水平，顯示各藥物組的細胞凋亡率和凋亡相關基因表達水平均明顯降低。因此，本研究結(jié)果提示，降脂寧提取物和阿托伐他汀對血管鈣化均有一定的抑制作用，其對血管鈣化的干預作用可能與抑制血管平滑肌凋亡和下調(diào)caspase-3的表達水平有關[19-20]。

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（收稿日期：2016-08-08 本文編輯：李亞聰）