HPLC法同時(shí)測(cè)定注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素的含量

陳汝紅，竇永海，靳英會(huì)（1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011；.天津市永久醫(yī)院，天津 00450；.石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，石家莊 050051）

HPLC法同時(shí)測(cè)定注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素的含量

陳汝紅1＊，竇永海2，靳英會(huì)3（1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011；2.天津市永久醫(yī)院，天津 300450；3.石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，石家莊 050051）

目的：建立同時(shí)測(cè)定注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SinoChrom C18，流動(dòng)相為0.21 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含0.16%的三乙胺，氫氧化鉀溶液調(diào)pH至5.6）-乙腈（81∶19，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為215 nm，柱溫為25 ，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.011～0.64 mg/mL（r＝0.999 9）、0.013～0.80 mg/mL（r＝0.999 9）、0.075～4.50 mg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜0.70%；加樣回收率分別為98.42%～101.51%（RSD＝0.90%，n＝9）、98.28%～101.50%（RSD＝0.90%，n＝9）、99.03%～101.11%（RSD＝0.66%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素含量的同時(shí)測(cè)定。

注射用三重霉素；普魯卡因；二芐基乙二胺；青霉素；含量測(cè)定；高效液相色譜法

注射用三重霉素，又名強(qiáng)化芐星青霉素，為芐星青霉素、普魯卡因青霉素、青霉素鈉按國際單位比6∶3∶3混合的注射用無菌粉末。芐星青霉素為青霉素的二芐基乙二胺鹽，普魯卡因青霉素為青霉素的普魯卡因鹽，二者抗菌活性成分均為青霉素，肌肉注射后青霉素緩慢釋放并被吸收[1]。芐星青霉素、普魯卡因青霉素、青霉素鈉血藥濃度達(dá)峰時(shí)間分別為24 h、1～4 h、15～30 min[2]，三者混合使其具有長期、中期和即時(shí)起效的優(yōu)勢(shì)，可以維持1～4周血液中的有效濃度?！睹绹幍洹穂3]分別采用碘量法和分光光度法測(cè)定芐星青霉素和普魯卡因青霉素注射混懸液中芐星青霉素和普魯卡因青霉素的含量，操作煩瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且國內(nèi)未見測(cè)定該復(fù)方制劑的報(bào)道。鑒于此，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了同時(shí)測(cè)定注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2487型檢測(cè)器、Alliance自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用三重霉素（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：SP090810、H091005，規(guī)格：芐星青霉素600 000 IU，普魯卡因青霉素300 000 IU，青霉素鈉300 000 IU）；青霉素鈉對(duì)照品（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：101118-1，純度：93.5%）；二芐基乙二胺二乙酸鹽對(duì)照品（重慶市春瑞醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20110110，純度：66.3%）；鹽酸普魯卡因?qū)φ掌罚ㄖ貞c市春瑞醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20110416，純度：86.3%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.21 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含0.16%的三乙胺，用氫氧化鉀溶液調(diào)pH至5.6）-乙腈（81∶19，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：215 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取鹽酸普魯卡因?qū)φ掌芳s12 mg、二芐基乙二胺二乙酸鹽對(duì)照品約20 mg、青霉素鈉對(duì)照品約80 mg，精密稱定，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈20 mL振搖使均勻分散后，加甲醇20 mL充分振搖使溶解，立即用磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀6.8 g和磷酸氫二鉀1.14 g，置于1 000 mL量瓶中，加水定容，搖勻）定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品約50 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加乙腈10 mL振搖使均勻分散后，加甲醇10 mL充分振搖使溶解，立即用磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取甲醇、乙腈各10 mL，置于50 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素峰的保留時(shí)間分別為4.982、12.837、20.334 min；理論板數(shù)以普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素峰計(jì)分別為12 020、10 802、12 034；相鄰兩個(gè)主峰之間的分離度分別為21.6和14.2。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 破壞性試驗(yàn)

按如下方法制備各破壞樣品溶液——（1）熱破壞樣品溶液：取樣品50 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈、甲醇各10 mL使溶解，再加磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，置于100℃水浴中加熱60 min，放冷，即得。（2）酸破壞樣品溶液：取樣品50 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈、甲醇各10 mL使溶解，再加0.1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL，放置10 min，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL進(jìn)行中和，加磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，即得。（3）堿破壞樣品溶液：取樣品50 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈、甲醇各10 mL使溶解，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，放置10 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL進(jìn)行中和，加磷酸鹽緩沖液定容，搖勻。（4）光破壞樣品溶液：取樣品50 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈、甲醇各10 mL使溶解，加磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，置于4 000 lx光照條件下照射48 h，即得。（5）氧化破壞樣品溶液：取樣品50 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈、甲醇各10 mL使溶解，加10%過氧化氫溶液2.0 mL，放置15 min，加磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，即得。

精密量取上述溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，各降解產(chǎn)物與主峰的分離情況良好。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取待測(cè)成分青霉素鈉對(duì)照品各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備普魯卡因質(zhì)量濃度分別為0.011、0.021、0.053、0.11、0.21、0.43、0.64 mg/mL，二芐基乙二胺質(zhì)量濃度分別為0.013、0.027、0.066、0.13、0.27、0.53、0.80 mg/mL，青霉素質(zhì)量濃度分別為0.075、0.15、0.38、0.75、1.5、3.0、4.5 mg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of destructive test

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear range

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：SP090810）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素峰面積的RSD分別為0.10%、0.22%、0.09%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：SP090810）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素峰面積的RSD分別為0.30%、0.25%、0.21%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：SP090810）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素的平均含量分別為11.88%、12.55%、68.52%，RSD分別為0.66%、0.58%、0.43%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：SP090810）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取兩批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中普魯卡因、二芐基乙二胺、青霉素的含量。結(jié)果，兩批樣品（批號(hào)：SP090810、H091005）中普魯卡因的含量為11.88%、12.19%，二芐基乙二胺的含量為12.55%、12.27%，青霉素的含量為68.58%、67.57%；按每1 mg的青霉素相當(dāng)于1 780青霉素單位計(jì)算樣品中普魯卡因青霉素、芐星青霉素、青霉素鈉的效價(jià)，兩批樣品（批號(hào)：SP090810、H091005）中普魯卡因青霉素的效價(jià)為299、307 IU/mg，芐星青霉素的效價(jià)為622、608 IU/mg，青霉素鈉的效價(jià)為300、288 IU/mg。

3 討論

3.1 色譜柱、檢測(cè)波長、溶劑的選擇

二芐基乙二胺易與色譜柱的殘留硅醇基產(chǎn)生次級(jí)保留作用，因此本試驗(yàn)選用封尾完全的C18[11-12]。三重霉素中二芐基乙二胺含量較小，吸收較弱，故選用二芐基乙二胺的最佳檢測(cè)波長215 nm作為本試驗(yàn)的測(cè)定波長。三重霉素中普魯卡因青霉素在甲醇中易溶，在水中微溶，而芐星青霉素在甲醇中微溶，在水中極微溶解，因此本試驗(yàn)選擇文獻(xiàn)[4]中的溶劑。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

普魯卡因和二芐基乙二胺為有機(jī)堿，青霉素為有機(jī)酸。流動(dòng)相pH增大，普魯卡因和二芐基乙二胺保留時(shí)間延長，青霉素則縮短。pH＞6時(shí)，二芐基乙二胺出峰晚，峰拖尾嚴(yán)重；pH＜5時(shí)，普魯卡因出峰太快，不易與溶劑峰或雜質(zhì)峰分離。為減小二芐基乙二胺的拖尾，加入適量的三乙胺。三乙胺濃度增大，普魯卡因和二芐基乙二胺保留時(shí)間縮短，青霉素則延長。二芐基乙二胺對(duì)pH、三乙胺濃度、鹽濃度均較敏感；鹽濃度增大，二芐基乙二胺保留時(shí)間縮短，而鹽濃度對(duì)另兩者影響較小。乙腈在17%～19%，pH為5～6，三乙胺濃度為0.3%的條件下調(diào)節(jié)，使普魯卡因和青霉素保留時(shí)間合適，并與相鄰峰能有效分離。通過調(diào)節(jié)鹽的濃度，使二芐基乙二胺處于合適的峰位，恰與青霉素降解物峰分離完全。最終，本試驗(yàn)的流動(dòng)相為0.21 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含0.16%的三乙胺，用氫氧化鉀溶液調(diào)pH至5.6）-乙腈（81∶19，V/V）。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于注射用三重霉素中普魯卡因、二芐基乙二胺和青霉素含量的同時(shí)測(cè)定。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Procaine，Benzathine and Penicillin in Triple Penicillin for Injection by HPLC

℃

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of procaine，benzathine and penicillin in Triple penicillin for injection.METHODS：HPLC was performed on the column of SinoChrom C18with mobile phase of 0.21 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution（containing 0.16%triethylamine，adjusted pH to 5.6 by potassium hydroxide）-acetonitril（81∶19，V/V）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 215 nm，column temperature was 25 ℃ ，and the injection volume was 10μL.RESULTS：The linear range was 0.011-0.64 mg/mL for procaine（r＝0.999 9），0.013-0.80 mg/mL for benzathine（r＝0.999 9）and 0.075-4.50 mg/mL for penicillin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 0.70%；recoveries were 98.42%-101.51%（RSD＝0.90%，n＝9），98.28%-101.50%（RSD＝0.90%，n＝9）and 99.03%-101.11%（RSD＝0.66%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，and can be used for the simultaneous determination of procaine，benzathine and penicillin in Triple penicillin for injection.

Triple penicillin for injection；Procaine；Benzathine；Penicillin；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）03-0421-04

2016-06-19

2016-10-26）

＊主任藥師，碩士。研究方向：藥品檢驗(yàn)。電話：0311-85212007。E-mail：crh030227@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.38

CHEN Ruhong1，DOU Yonghai2，JIN Yinghui3（1.Hebei Provincial Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China；2.Tianjin Permanent Hospital，Tianjin 300450，China；3.Zhongnuo Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shijiazhuang Pharmacy Group，Shijiazhuang 050051，China）