HPLC法同時測定虎杖膏中4種成分的含量Δ

趙 萍，王 森，歐水平，任 麗，王玉和#（.遵義醫(yī)學院藥學院，貴州遵義 563006；.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003）

HPLC法同時測定虎杖膏中4種成分的含量Δ

趙 萍1＊，王 森1，歐水平2，任 麗1，王玉和2#（1.遵義醫(yī)學院藥學院，貴州遵義 563006；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003）

目的：建立同時測定虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Xtimate C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為10～60 μg/mL（r＝0.999 4）、2.5～15 μg/mL（r＝0.999 7）、5～30 μg/mL（r＝0.999 8）、2～12 μg/mL（r＝0.999 6）；定量限分別為0.87、0.44、0.45、0.15 μg/mL，檢測限分別為0.46、0.15、0.17、0.07 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.00%～102.00%（RSD＝2.25%，n＝9）、95.00%～103.00%（RSD＝2.97%，n＝9）、95.00%～99.56%（RSD＝2.05%，n＝9）、97.50%～102.50%（RSD＝1.59%，n＝9）。結(jié)論：該方法準確可靠、操作簡便，可用于虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的同時測定。

高效液相色譜法；虎杖膏；虎杖苷；白藜蘆醇；大黃素；大黃素甲醚；含量測定

虎杖膏是由遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院協(xié)定處方，由虎杖粉、冰片等組成，具有清熱解毒、消腫定痛之功效，主要用于紅腫而未潰爛的瘡、癰、疔、癤及無名腫毒等癥的治療，療效明顯[1]。現(xiàn)有虎杖膏的臨床研究較多[2]，尚未有同時測定該制劑中多個成分的報道，鑒于此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）[3]建立了同時測定虎杖膏中君藥虎杖的主要成分虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量，以期為虎杖膏的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括1260型紫外檢測器（美國Agilent公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士Mettl-er-Toledo公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；HH-S6型二列方孔水?。ㄠ嵵蓍L城科工貿(mào)有限公司）；Exceed-Cd-20型實驗室超純水機（成都艾科水處理設備有限公司）；TGL-16c型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

虎杖膏（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院自制，批號：20151125、20151126、20151127，規(guī)格：25 g/盒）；虎杖苷對照品（批號：111575-200502）、大黃素對照品（批號：110756-201512）、白藜蘆醇對照品（批號：111535-200502）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-201415）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈為色譜純，磷酸、乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30℃，進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取虎杖苷對照品20.0 mg、白藜蘆醇對照品5.0 mg、大黃素對照品10.0 mg、大黃素甲醚對照品4.0 mg，分別置于不同的100 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為單一對照品貯備液。精密吸取上述各對照品貯備液各2.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加95%乙醇定容，制成每1 mL分別含虎杖苷50 μg、白藜蘆醇12.5 μg、大黃素25 μg、大黃素甲醚10 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約0.5 g，精密稱定，加95%乙醇30 mL，于50℃水浴加熱2 h，以半徑為5 cm、2 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)慮液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝，取除虎杖外的其他輔料制備陰性對照品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，理論板數(shù)以虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚計均≥3 000，分離度均＞2；各成分基線分離良好，且陰性對照無干擾。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，分別置于10 mL量瓶中，加乙醇定容，制得系列線性溶液。取上述溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的回歸方程分別為y＝87.964x+ 146.03（r＝0.999 4）、y＝47.841x—6.273 3（r＝0.999 7）、y＝45.651x—2.36（r＝0.999 8）、y＝12.474x—0.12（r＝0.999 6）。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為10～60、2.5～15、5～30、2～12 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD）。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的LOQ分別為0.87、0.44、0.45、0.15 μg/mL，LOD分別為0.46、0.15、0.17、0.07 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.35%、0.59%、0.39%、0.89%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20151125）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.59%、0.89%、0.94%、1.27%（n＝8），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20151125）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為2.098、0.445、1.402、0.155 mg/g，RSD分別為1.20%、0.96%、1.69%、1.54%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20151125）適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對照品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 測定指標的選擇

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

虎杖作為虎杖膏中的君藥，其主要化學成分為二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等，其中二苯乙烯類主要有白藜蘆醇和虎杖苷（白藜蘆醇苷）等化合物，蒽醌類主要有大黃素、大黃素甲醚、大黃素苷等化合物[4]。近年來，有關研究發(fā)現(xiàn)虎杖有確切的抗菌、抗病毒、抗炎作用，其抗菌、抗病毒、抗炎作用的主要物質(zhì)基礎可能與其所含二苯乙烯類以及蒽醌類成分有關[5]。因此，本試驗選擇虎杖中二苯乙烯類（虎杖苷和白藜蘆醇）和蒽醌類（大黃素、大黃素甲醚）化學成分為測定指標。

3.2 檢測波長的選擇

本試驗參考了相關文獻中對虎杖相關成分的測定波長[6]（230、280、285、290、303 nm），其中280、285、290 nm 3個波長較接近，因此本課題組選取“2.2.1”項下各單一對照品溶液在250～300 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚在286 nm處均有較強的吸收，因此選擇230、286、303 nm進行預試驗。結(jié)果，在230 nm波長處各成分基線不穩(wěn)，在286、303 nm波長處各成分基線穩(wěn)定，檢測限均能滿足含量測定要求，且各峰的峰形較好，理論板數(shù)較高，但大黃素甲醚在303 nm波長處的紫外吸收較低，因此本試驗選擇286 nm作為檢測波長。

綜上所述，本方法準確可靠、操作簡便，可用于虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的同時測定。

[1] 易學東，楊建文，吳曾賢.虎杖膏微生物限度檢查方法的驗證[J].遵義醫(yī)學院學報，2011（3）：250-251.

[2] 周矜宏，譚先群，代群燕，等.虎杖膏外敷用于Ⅰ期壓瘡的效果觀察[J].吉林醫(yī)學，2012，33（28）：6121-6122.

[3] 易學東，張倩茹，張小英.高效液相色譜法測定虎杖膏中大黃素的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（17）：1483-1484.

[4] 劉莉，季金茍，唐南南，等.虎杖中大黃素的分離純化工藝研究[J].中成藥，2013，35（9）：2034-2037.

[5] 賈玉梅，王君明，崔瑛.基于二苯乙烯類為主要活性成分的虎杖藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（9）：263-269.

[6] 陳華國，趙宏賓，趙超，等.虎杖提取物HPLC指紋圖譜歸屬分析及譜效關系初探[J].中國藥房，2010，21（19）：1775-1776.

Simultaneous Determination of 4 Components in Reynoutria japonica Cream by HPLC

ZHAO Ping1，WANG Sen1，OU Shuiping2，REN Li1，WANG Yuhe2（1.College of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563006，China；2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of polydatin，resveratrol，emodin and physcion in Reynoutria japonica Cream.METHODS：HPLC was performed on the column of Xtimate C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 286 nm，column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 10-60 μg/mL for polydatin（r＝0.999 4），2.5-15 μg/mL for resveratrol（r＝0.999 7），5-30 μg/mL for emodin（r＝0.999 8）and 2-12 μg/mL for physcion（r＝0.999 6）；limit of quantitation was 0.87，0.44，0.45，0.15 μg/mL，limit of detection was 0.46，0.15，0.17，0.07 μg/mL；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 95.00%-102.00%（RSD＝2.25%，n＝9），95.00%-103.00%（RSD＝2.97%，n＝9），95.00%-99.56%（RSD＝2.05%，n＝9）and 97.50%-102.50%（RSD＝1.59%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is reliable，simple，and can be used for the simultaneous determination of polydatin，resveratrol，emodin and physcion in R.japonica Cream.

HPLC；Reynoutria japonica Cream；Polydatin；Resveratrol；Emodin；Physcion；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）03-0405-03

2016-06-15

2016-11-11）

（編輯：劉 柳）

貴州省科技廳聯(lián)合基金（黔科合字〔2015〕7481號、黔科合LH字〔2015〕7548號）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術研究課題（No.QZYY-2015-077）；貴州省藥劑學研究生卓越人才培養(yǎng)計劃（黔教研合ZYRC〔2014〕019）；遵義市科技計劃課題（遵市科合社字〔2014〕96號）；遵義醫(yī)學院自然科學招標課題（遵醫(yī)院辦發(fā)〔2014〕10號）

＊碩士研究生。研究方向：醫(yī)院藥學、藥物經(jīng)濟學。E-mail：865593634@qq.com

#通信作者：主任藥師，教授，碩士生導師。研究方向：醫(yī)院藥學。電話：0851-28609699。E-mail：1149076068@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.33