HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲補(bǔ)天素片中6種成分的含量Δ

李云靜，何忠梅（1.吉林工程職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林四平 136001；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲補(bǔ)天素片中6種成分的含量Δ

李云靜1＊，何忠梅2#（1.吉林工程職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林四平 136001；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

目的：建立同時(shí)測(cè)定杜仲補(bǔ)天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm（麥角甾苷和吉奧諾苷B1）、210 nm（去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸），柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為～74.20 μg/mL（r＝0.999 9）、4.35～87.00 μg/mL（r＝0.999 5）、3.86～77.20 μg/mL（r＝0.999 9）、5.05～101.00 μg/mL（r＝0.999 1）、4.20～84.00 μg/mL（r＝0.999 7）、4.73～87.40 μg/mL（r＝0.999 6）；定量限分別為0.322、0.187、0.105、0.381、0.214、0.452 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.108、0.059、0.032、0.131、0.072、0.149 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.20%～99.53%（RSD＝1.23%，n＝6）、96.99%～100.67%（RSD＝1.47%，n＝6）、96.64%～100.08%（RSD＝1.28%，n＝6）、97.47%～100.59%（RSD＝1.18%，n＝6）、97.97%～100.83%（RSD＝1.25%，n＝6）、96.81%～99.61%（RSD＝1.09%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于杜仲補(bǔ)天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；杜仲補(bǔ)天素片；麥角甾苷；吉奧諾苷B1；去氫土莫酸；豬苓酸C；去氫茯苓酸；茯苓酸；含量測(cè)定

杜仲補(bǔ)天素片由熟地黃、茯苓、杜仲（鹽水炒）、菟絲子（制）、肉蓯蓉等25味中藥材組成，具有補(bǔ)氣益血、溫腎養(yǎng)心、壯腰安神的功效，主要用于腰膝酸軟、夜多小便、神經(jīng)衰弱等癥的治療。該制劑收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第12冊(cè)）[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀鑒別及制劑通則的檢查項(xiàng)[1-2]，未對(duì)該制劑處方中的任何藥物所含成分進(jìn)行定量測(cè)定；現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]也僅對(duì)其單一藥材及含該藥材的其他制劑的含量進(jìn)行測(cè)定。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，筆者以熟地黃[4]中所含麥角甾苷和吉奧諾苷B1與茯苓[4]中所含去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法（HPLC），以梯度洗脫的方式同時(shí)測(cè)定上述6種成分的含量，以期為完善杜仲補(bǔ)天素片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower Pro色譜工作站、G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Tu-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BT25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

杜仲補(bǔ)天素片（貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1502114、1503108、1504123，規(guī)格：0.27 g/片）；麥角甾苷對(duì)照品（批號(hào)：22323-52-0，純度：98.0%）、茯苓酸對(duì)照品（批號(hào)：29070-92-6，純度：98.0%）均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；吉奧諾苷B1對(duì)照品（批號(hào)：120406-37-3，純度：98.0%）、去氫土莫酸對(duì)照品（批號(hào)：6754-16-1，純度：99.0%）均購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；豬苓酸C對(duì)照品（批號(hào)：465-18-9，純度：98.0%）、去氫茯苓酸對(duì)照品（批號(hào)：77012-31-8，純度：98.0%）均購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

熟地黃、茯苓、杜仲、菟絲子、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、當(dāng)歸、蓮子、澤瀉、牡丹皮、白芍、淫羊藿、黃芪、山藥、白術(shù)、陳皮、砂仁、女貞子、金櫻子、山茱萸、巴戟天、柏子仁、黨參、枸杞子、甘草等藥材均購(gòu)于吉林省北藥藥材加工有限公司，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院何忠梅副教授鑒定為真品，同時(shí)按照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]檢驗(yàn)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～11 min，21.0%A；11～27 min，21.0%→34.0%A；27～48 min，34.0%→65.0%A；48～56 min，65.0→21.0%A）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm[3，5]（0～27 min，麥角甾苷和吉奧諾苷B1）、210 nm[6]（27～56 min，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取麥角甾苷對(duì)照品7.42 mg、吉奧諾苷B1對(duì)照品8.70 mg、去氫土莫酸對(duì)照品7.72 mg、豬苓酸C對(duì)照品10.10 mg、去氫茯苓酸對(duì)照品8.40 mg和茯苓酸對(duì)照品8.74 mg，分別置于不同的10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得各待測(cè)成分的單一對(duì)照品貯備液。再分別取麥角甾苷對(duì)照品貯備液5.0 mL、吉奧諾苷B1對(duì)照品貯備液2.0 mL、去氫土莫酸對(duì)照品貯備液2.5 mL、豬苓酸C對(duì)照品貯備液1.0 mL、去氫茯苓酸對(duì)照品貯備液1.5 mL和茯苓酸對(duì)照品貯備液5.0 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，除去包衣層，研成細(xì)粉，精密稱(chēng)取4.0 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理60 min，放冷；再次稱(chēng)定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺熟地黃和茯苓的單一陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備單一陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度＞2.0；理論板數(shù)分別以麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸、茯苓酸峰計(jì)均≥3 000，保留時(shí)間分別為16.6、21.5、32.6、34.8、37.6、43.1 min。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程與線(xiàn)性范圍，詳見(jiàn)表1。

表1 回歸方程與線(xiàn)性范圍Tab 1 Regression equation and linear ranges

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸的LOQ分別為0.322、0.187、0.105、0.381、0.214、0.452μg/mL；LOD分別為0.108、0.059、0.032、0.131、0.072、0.149μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為1.02%、0.99%、1.10%、1.17%、0.93%、0.86%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1502114）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為0.83%、0.95%、1.02%、1.07%、0.99%、0.88%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：1502114）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸平均含量分別為0.483、0.211、0.227、0.116、0.160、0.571 mg/g，RSD分別為1.08%、1.06%、0.96%、1.01%、1.12%、0.97%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：1502114）適量，共6份，每份約2.0 g，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，再加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（s，n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（s，n＝3，mg/g）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（s，n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（s，n＝3，mg/g）

樣品批號(hào)1502114 1503108 1504123麥角甾苷0.482±0.005 0.475±0.002 0.488±0.004吉奧諾苷B10.211±0.002 0.205±0.001 0.216±0.003去氫土莫酸0.224±0.003 0.229±0.002 0.218±0.002豬苓酸C 0.117±0.002 0.121±0.001 0.111±0.002去氫茯苓酸0.159±0.001 0.164±0.002 0.153±0.001茯苓酸0.571±0.004 0.587±0.007 0.565±0.005

3 討論

3.1 提取時(shí)間的選擇

以待測(cè)成分的提取率為指標(biāo)，對(duì)不同超聲提取時(shí)間（30、60、90 min）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果超聲提取60 min和90 min，所測(cè)各成分提取效果差異不大，但都明顯高于超聲提取30 min所測(cè)各成分含量，為了節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，故本試驗(yàn)選取60 min作為超聲提取的最佳時(shí)間。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品貯備液各適量，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，麥角甾苷和吉奧諾苷B1在330 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸在210 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故麥角甾苷和吉奧諾苷B1檢測(cè)波長(zhǎng)定為330 nm，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸檢測(cè)波長(zhǎng)定為210 nm。

3.3 流動(dòng)相的選擇

筆者在試驗(yàn)過(guò)程中分別采取乙腈-0.05%磷酸溶液[7-8]、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液[9]、乙腈-0.2%磷酸溶液[10]以不同比例進(jìn)行梯度洗脫，以待測(cè)成分的出峰時(shí)間、峰形和分離度效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，優(yōu)選最佳的檢測(cè)流動(dòng)相體系。結(jié)果，乙腈-0.05%磷酸溶液按不同比例進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，麥角甾苷和吉奧諾苷B1分離效果較好，但去氫土莫酸和豬苓酸C達(dá)不到有效分離；乙腈-0.1%乙酸溶液按不同比例進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸能有效分離，但麥角甾苷峰形較差，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；以乙腈-0.2%甲酸溶液按不同比例進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸分離度均能達(dá)到要求，但吉奧諾苷B1與其他雜質(zhì)峰達(dá)不到有效分離；乙腈-0.2%磷酸溶液按照“2.1”項(xiàng)下比例進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各待測(cè)成分色譜峰的出峰時(shí)間、峰形和分離度效果較好，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.4 耐用性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1502114）適量，分別采用 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）和 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果，采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，所測(cè)成分吉奧諾苷B1與其他峰分離效果較差；采用Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，所測(cè)成分去氫土莫酸和豬苓酸C達(dá)不到有效分離；采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，所測(cè)成分均能達(dá)到有效分離，故最終采用kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行試驗(yàn)。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于杜仲補(bǔ)天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第12冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：64-65.

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Simultaneous Determination of 6 Components in Duzhong Butiansu Tablet by HPLC

LI Yunjing1，HE Zhongmei2（1.College of Bioengineering，Jilin Engineering Vocational College，Jilin Siping 136001，China；2.College of Traditional Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of acteoside，jionoside B1，dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid in Duzhong butiansu tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Kromasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%phosphate acid（gradient elution）at a flow rate of 0.8 mL/min，the detection wavelength was 330 nm for acteoside and jionoside B1，210 nm for dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid，the column temperature was 35℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 3.71-74.20 μg/mL for acteoside（r＝0.999 9），4.35-87.00 μg/mL for jionoside B1（r＝0.999 5），3.86-77.20 μg/mL for dehydrotumulosic acid（r＝0.999 9），5.05-101.00 μg/mL for polyporenic acid C（r＝0.999 1）and 4.20-84.00 μg/ mL for dehydropachymic acid（r＝0.999 7）and 4.73-87.40 μg/mL for pachymic acid（r＝0.999 6）；the limits of qu-antification were 0.322，0.187，0.105，0.381，0.214，0.452 μg/mL，and the limits of detection were 0.108，0.059，0.032，0.131，0.072，0.149 μg/mL；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.20%-99.53%（RSD＝1.23%，n＝6），96.99%-100.67%（RSD＝1.47%，n＝6），96.64%-100.08%（RSD＝1.28%，n＝6），97.47%-100.59%（RSD＝1.18%，n＝6），97.97%-100.83%（RSD＝1.25%，n＝6）and 96.81%-99.61%（RSD＝1.09%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，accurate，and can be used for the simultaneous determination of acteoside，jionoside B1，dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid in Duzhong butiansu tablet.

HPLC；Duzhong butiansu tablet；Acteoside；Jionoside B1；Dehydrotumulosic acid；Polyporenic acid C；Dehydropachymic acid；Pachymic acid；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）03-0401-04

2016-01-30

2016-10-09）

（編輯：劉 柳）

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20140311029YY）

＊副教授，碩士。研究方向：生物制藥、發(fā)酵技術(shù)、藥用酶生產(chǎn)與教學(xué)工作。E-mail：523882748@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方法：中藥有效成分作用機(jī)制及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail：hezhongmei1978@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.32