高血壓大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)與端粒長度的相關性研究

付浩++孫圣凱++陳孝儲++閆海洋+王志宏

[摘要] 目的 探討高血壓大鼠外周血液白細胞線粒體DNA拷貝數(shù)和端粒長度的變化，以及二者之間的相關性。 方法 SD大鼠40只，隨機分為3組：高血壓組（15只）、假手術組（15只）和空白對照組（10只）。高血壓組采用雙側(cè)腎動脈后支結(jié)扎，術后予以8% NaCl飼料的方法構(gòu)建高血壓大鼠模型。選取術后4個月為觀察終點，利用鼠尾血壓計測量血壓，隨后行眶下靜脈叢取血，提取血液基因組DNA，Real-time PCR法測量相對線粒體DNA拷貝數(shù)和端粒長度。 結(jié)果 術后4個月時與假手術組比較，高血壓組大鼠血壓顯著升高[（178.36±10.21）比（128.47±8.74）mmHg，P < 0.01]，線粒體DNA拷貝數(shù)顯著增加[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒長度顯著縮短[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。高血壓組大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)與端粒長度變化呈負相關（r= -0.589，P < 0.05）。 結(jié)論 高血壓大鼠模型可出現(xiàn)外周血白細胞線粒體DNA拷貝數(shù)升高和端粒長度縮短，且二者呈負相關。

[關鍵詞] 高血壓；mtDNA拷貝數(shù)；端粒；大鼠

[中圖分類號] R544.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0033-04

高血壓是心血管疾病的主要危險因素之一，在我國成人中，高血壓發(fā)病率可高達29.6%，已成為我國一個嚴重的公眾健康負擔[1]，其主要危害在于隨患病時間的延長，可引起動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等多種年齡相關疾病[2-3]。近期有研究顯示，線粒體功能障礙和端?？s短不僅是細胞老化過程中的兩個關鍵進程，二者之間還可能存在著相互作用[4]，但是目前尚無研究涉及高血壓疾病中線粒體和端粒功能之間的可能聯(lián)系。因此，本研究旨在通過利用線粒體拷貝數(shù)和端粒長度的變化，來探索高血壓大鼠模型中線粒體和端粒功能之間的聯(lián)系，或可為高血壓繼發(fā)疾病的發(fā)病機制探索及早期治療提供更多的基礎研究支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠40只，7～8周齡，體重220～250 g（軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心，合格證號0033432）。血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），UltraSYBR Mixture With ROXⅡ（北京康為世紀生物科技有限公司），Real-time PCR引物（安徽通用生物系統(tǒng)有限公司），Real-time PCR儀（Step One Plus，美國ABI公司），鼠尾血壓計（美國IITC公司），NanoDrop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）。實驗方案經(jīng)武警后勤學院附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 高血壓模型建立

將40只大鼠隨機分為高血壓組（15只）、假手術組（15只）和空白對照組（10只）。高血壓組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，按Eldawoody等[5]的方法，結(jié)扎雙側(cè)腎動脈后支，術后1周給予含8% NaCl飼料，正常飲水。假手術組麻醉后僅暴露雙側(cè)腎動脈15 min，術后正常飲食?？瞻讓φ战M不進行任何操作。

1.3 高血壓模型評估

采用標準尾部測壓法，術后1個月時進行血壓測量以判斷高血壓組是否出現(xiàn)血壓升高，術后4個月取材前再次測量血壓予以確認，兩次測量均表現(xiàn)為血壓升高則說明該高血壓模型穩(wěn)定可靠。

1.4 血液標本采集

于模型建成后，利用直徑0.9 mm毛細玻璃管進行眶下靜脈叢取血1.5 mL。

1.5 端粒長度及mtDNA拷貝數(shù)測定

按照說明書提取血液基因組DNA。參考文獻[6-7]設計端粒（Tel）、線粒體單拷貝基因COXⅠ和內(nèi)參基因36B4的引物，引物序列及終濃度見表1。PCR反應體系為25 μL，包括2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL，基因組DNA25 ng，以及相應體積的引物和滅菌雙蒸水，每個樣品設3個重復孔。目的基因與內(nèi)參基因的PCR反應條件一致，采用兩步法：95℃ 10 min預變性后，進行95℃ 15 s、60℃ 1 min共40個循環(huán)，95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s行融解曲線分析。應用相對定量法計算端粒長度和線粒體的相對拷貝數(shù)，即得出各樣本不同基因的CT值后，首先計算出目的基因與單拷貝基因CT值的比值（T/S）：[2Ct（tel）/2Ct（36B4）]-1=2-ΔCt，再用各樣本的T/S值除以對照組T/S的平均值，得到相對T/S值：2-ΔCt/2-ΔCt（對照平均值）=2-ΔΔCt。當相對T/S=1時，代表實驗組的目的基因表達與對照組完全相同，當相對T/S>1時，說明實驗組目的基因表達更多，反之說明目的基因表達更少。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析采用Pearson相關 性檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況

高血壓組1只大鼠因術后局部感染導致粘連性腸梗阻，于術后10 d死亡，其余均存活至觀察終點。

2.2 各組大鼠血壓比較

術前三組血壓差異無統(tǒng)計學意義（F=1.340，P=0.275）。術后1個月和術后4個月時，高血壓組血壓均顯著升高（均P < 0.01），假手術組與空白對照組比較，血壓差異均無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05）。

2.3 兩組端粒長度及mtDNA拷貝數(shù)比較

術后4個月時，高血壓組與假手術組比較，mtDNA拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計學意義[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒長度差異有統(tǒng)計學意義[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。

3 討論

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是線粒體內(nèi)相對獨立的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組中的個數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)。線粒體DNA由于缺少組蛋白的保護，極易受到炎癥、氧化應激、激素水平變化等因素的損傷，造成線粒體基因突變，從而出現(xiàn)功能障礙，但線粒體內(nèi)DNA的修復系統(tǒng)效率很低，機體維持線粒體基因及功能完整性的主要機制是誘導mtDNA拷貝數(shù)的增加[8]。此前已有眾多研究顯示，白細胞mtDNA拷貝數(shù)不僅可以反映線粒體的功能與生物合成，還可以作為一種替代性標志物，提示與線粒體功能障礙相關的多種代謝性疾病，例如胰島素抵抗和糖調(diào)節(jié)異常[9]、非酒精性脂肪肝病[10]和高同型半胱氨酸血癥[11]，但其在高血壓等血管疾病中的變化尚存在爭議。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)，在高血壓大鼠心肌細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，可能是因為氧化應激可通過氧化線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）上的二硫鍵部位和吡啶核苷酸部位，使MPTP持續(xù)開放，并降低線粒體膜電位，從而激活線粒體凋亡通路[13]，使線粒體拷貝數(shù)發(fā)生了代償性增加。但也有學者得出了相反的結(jié)論，Kim等[4]發(fā)現(xiàn)，在老年女性中，高血壓組患者表現(xiàn)出減少的外周血白細胞mtDNA拷貝數(shù)，可能是由于該研究中受訪者患病時間較短，mtDNA拷貝數(shù)尚未發(fā)生明顯的代償性增加。本實驗發(fā)現(xiàn)，高血壓4個月后，線粒體拷貝數(shù)顯著升高，提示高血壓造成了線粒體功能障礙并使拷貝數(shù)發(fā)生了代償性增高。這表明線粒體功能的損傷與高血壓的發(fā)展密切相關，可能是由于長期高血壓造成的慢性氧化應激刺激觸發(fā)了呼吸核因子與線粒體轉(zhuǎn)錄因子的表達，促進線粒體增殖從而降低損傷mtDNA所占比例，以代償呼吸功能的下降，故mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生了代償性升高[14]。

端粒是真核細胞染色體末端的一段非編碼重復序列，細胞每次分裂端粒都會縮短30～150堿基，當縮短到一定程度時，細胞則會進入衰老階段并發(fā)生凋亡[15]。端粒縮短程度代表了衰老的水平，且與多種心血管疾病的發(fā)生有關，但其在高血壓疾病中的變化目前尚有爭議。Bhupatiraju等[16]研究發(fā)現(xiàn)，印度人群中高血壓患者端粒長度與健康人群相比明顯縮短，且端粒長度與年齡、舒張壓、收縮壓均呈負相關。Farrag等[17]也發(fā)現(xiàn)，高血壓患者外周血液白細胞端粒長度與健康人群相比顯著縮短，而且與BMI指數(shù)無關。這可能是由于高血壓時血管表面切應力改變，可誘導血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，引起一氧化氮合成受損，加重氧化應激反應[18]，造成了端粒DNA單鏈斷裂，從而在DNA復制時引發(fā)錯配與重排，使端?？s短[19]。然而Morgan等[20]提出，高血壓的發(fā)生發(fā)展與端粒長度的縮短無關，這可能由于高血壓作為一種慢性疾病，其對機體的影響是漫長而緩慢的，該研究進行時納入標準中沒有包括患病年限，且研究樣本例數(shù)（55例患者）較少，導致了高血壓與端粒縮短的相關性尚未顯現(xiàn)出來。本實驗中，高血壓模型大鼠端粒顯著縮短，表明端?？s短與高血壓密切相關。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)與端粒長度呈負相關，表明線粒體和端粒不僅與高血壓的發(fā)展相關，兩者之間還會發(fā)生相互影響。這與Tyrka等[21]在研究童年經(jīng)歷過逆境或曾患有精神疾病的人群時發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致?？赡茉蛉缦拢壕€粒體的環(huán)狀DNA共編碼37個基因，包括呼吸復合物亞基和一些線粒體tRNA和rRNA[4]，調(diào)節(jié)線粒體生物基因組和包括細胞呼吸在內(nèi)的多種功能時，核基因編碼的核蛋白表達發(fā)揮著重要作用。這些核蛋白包括核轉(zhuǎn)錄共激活劑（PGC-1α和PGC-1β）、AMP活化蛋白激酶、哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）等[22]。當對核基因起保護作用的端粒受到氧自由基、炎癥因子等攻擊時，一方面受損的端?？烧T導p53表達，抑制轉(zhuǎn)錄共激活劑PGC的功能，從而造成線粒體功能障礙；另一方面端粒損傷還可直接影響線粒體氧化呼吸鏈相關蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達，導致線粒體功能障礙[23]。該結(jié)果不僅進一步解釋了線粒體和端粒與高血壓的密切關系，還提示了若以端?；蚓€粒體為靶點對高血壓進行干預時，應同時兼顧二者，或許能發(fā)揮更好的效果。

綜上所述，本實驗通過手術構(gòu)建的高血壓大鼠模型發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，端粒顯著縮短，并認為mtDNA拷貝數(shù)增加所代表的線粒體功能障礙與端?？s短密切相關。這為進一步解釋高血壓疾病引起年齡相關心腦血管病的發(fā)生機制提供了幫助，并為預防高血壓引起繼發(fā)臟器損害提供了潛在治療靶點。

[參考文獻]

[1] Wang J，Zhang L，Wang F，et al. Prevalence，awareness，treatment，and control of hypertension in China：results from a national survey [J]. Am J Hypertens，2014，27（11）：1355-1361.

[2] 李靜，張梅，張偉麗.外周血白細胞端粒長度與心腦血管疾病風險的研究進展[J].中國卒中雜志，2016，11（1）：82-86.

[3] 黃畢，楊艷敏.端粒長度與心血管疾病關系的研究進展[J].中國循環(huán)雜志，2013，28（7）：555-557.

[4] Kim JH，Kim HK，Ko JH，et al. The relationship between leukocyte mitochondrial DNA copy number and telomere length in community-dwelling elderly women [J]. PLoS One，2013，8（6）：e67227.

[5] Eldawoody H，Shimizu H，Kimura N，et al. Simplified experimental cerebral aneurysm model in rats：comprehensive evaluation of induced aneurysms and arterial changes in the circle of Willis [J]. Brain Res，2009，1300：159-168.

[6] Snowdin JW，Hsiung CH，Kesterson DG，et al. Effects of Zidovudine Treatment on Heart mRNA Expression and Mitochondrial DNA Copy Number Associated with Alterations in Deoxynucleoside Triphosphate Composition in a Neonatal Rat Model [J]. Antimicrob Agents Chemother，2015， 59（10）：6328-6336.

[7] 仲韻.單色多重熒光實時定量PCR測定端粒長度[J].中國醫(yī)藥導報，2016，13（19）：14-17.

[8] Malakhova L，Bezlepkin VG，Antipova V，et al. The increase in mitochondrial DNA copy number in the tissues of gamma-irradiated mice [J]. Cell Mol Biol Lett，2005，10（4）：721-732.

[9] Xu FX，Zhou X，Shen F，et al. Decreased peripheral blood mitochondrial DNA content is related to HbA1c，fasting plasma glucose level and age of onset in type 2 diabetes mellitus [J]. Diabet Med，2012，29（7）：e47-54.

[10] Kawahara H，Takase S. Mutation of mitochondrial DNA in patients with non-alcoholic steatohepatitis [J]. Nihon Rinsho，2006，64（6）：1095-1099.

[11] Lim S，Kim MS，Park KS，et al. Correlation of plasma homocysteine and mitochondrial DNA content in peripheral blood in healthy women [J]. Atherosclerosis，2001，158（2）：399-405.

[12] Chen L，Tian X，Song L. Biochemical and biophysical characteristics of mitochondria in the hypertrophic hearts from hypertensive rats [J]. Chin Med J（Engl），1995，108（5）：361-366.

[13] 李強，翟宇，張婷，等.腦缺血再灌注后線粒體氧化應激損傷的動態(tài)變化[J].中國臨床神經(jīng)科學，2014，22（3）：241-247.

[14] Luna B，Bhatia S，Yoo C，et al. Bayesian network and mechanistic hierarchical structure modeling of increased likelihood of developing intractable childhood epilepsy from the combined effect of mtDNA variants，oxidative damage，and copy number [J]. J MolNeurosci，2014，54（4）：752-766.

[15] 于嬌嬌，孫婉玲.鐵過載與端粒長度研究進展[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12（8）：33-36，41.

[16] Bhupatiraju C，Saini D，Patkar S，et al. Association of shorter telomere length with essential hypertension in Indian population [J]. Am J Hum Biol，2012，24（4）：573-578.

[17] Farrag W，Eid M，El-Shazly S，et al. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism and telomere shortening in essential hypertension [J]. Mol Cell Biochem，2011，351（1-2）：13-18.

[18] Banday AA，Muhammad AB，F(xiàn)azili FR，et al. Mechanisms of oxidative stress-induced increase in salt sensitivity and development of hypertension in Sprague-Dawleyrats [J]. Hypertension，2007，49（3）：664-671.

[19] 胡夢瑤，隋宜倫，謝飛舟，等.端粒-端粒酶系統(tǒng)與氧化還原微環(huán)境[J].生物物理學報，2012，28（5）：411-421.

[20] Morgan RG，Ives SJ，Walker AE，et al. Role of arterial telomere dysfunction in hypertension：relative contributions of telomere shortening and telomere uncapping [J]. J Hypertens，2014，32（6）：1293-1299.

[21] Tyrka AR，Parade SH，Price LH，et al. Alterations of Mitochondrial DNA Copy Number and Telomere Length With Early Adversity and Psychopathology [J]. Biol Psychiatry，2016，79（2）：78-86.

[22] Lombard DB，Tishkoff DX，Bao J. Mitochondrial sirtuins in the regulation of mitochondrial activity and metabolic adaptation [J]. HandbExpPharmacol，2011，206：163-188.

[23] 顏婧，李力力，陳代興，等.調(diào)控端粒酶線粒體轉(zhuǎn)位對人肝癌細胞耐藥性的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7（24）：11541-11548.

（收稿日期：2016-08-02 本文編輯：程 銘）