免疫磁微球在腫瘤細(xì)胞中的提取應(yīng)用

滕娟+路玉英

【摘要】 目的：免疫磁微球是現(xiàn)代新穎的收集體液瘤細(xì)胞方法，用以發(fā)現(xiàn)受檢患者體液中有無脫落腫瘤細(xì)胞。方法：分析比較免疫磁微球法與常規(guī)沉淀離心法收集腫瘤細(xì)胞。收集85例腫瘤患者和53例非腫瘤患者的體液，在同等體積的體液中，用免疫磁微球懸液與138例患者體液沉渣（尿液、腹水、腹腔積液、胸腔積液、乳頭溢液）相混合，將收集到的可疑細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)鏡檢；并將138例患者體液沉渣進(jìn)行沉淀離心鏡檢，比較兩種鏡檢結(jié)果。結(jié)果：非腫瘤患者免疫磁微球檢測方法陽性率為1.9%（1/53），沉淀離心檢測方法陽性率為0（0/53）。肝癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為91.6%（11/12），沉淀離心檢測方法陽性率為33.3%（4/12）；結(jié)腸癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為88.9%（24/27），沉淀離心檢測方法陽性率為37.0%（10/27）；肺癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為80.0%（12/15），沉淀離心檢測方法陽性率為40.0%（6/15）；乳腺癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為90.3%（28/31），沉淀離心檢測方法陽性率為45.2%（14/31）。在非腫瘤患者和腫瘤患者中，免疫磁微球檢測方法的腫瘤陽性檢出率均高于常規(guī)沉淀離心檢測方法（P<0.05）。結(jié)論：免疫磁微球檢測方法輕易排除了混雜在體液沉渣中的正常細(xì)胞、破碎細(xì)胞和非細(xì)胞成分，排除干擾鏡檢的諸多因素，加大了篩選濃聚陽性細(xì)胞的力度，提高檢測的陽性率，對腫瘤診斷有很大的效用，為臨床腫瘤細(xì)胞學(xué)病理確診提供更有效、便捷的方法。

【關(guān)鍵詞】 免疫磁微球； 惡性腫瘤； 體液中瘤細(xì)胞

【Abstract】 Objective：IMMS is a new method of collecting body fluid tumor cells，and it is used to find out whether there is no shedding of tumor cells in the body fluid of the patients.Method：The tumor cells were collected and compared with the conventional sedimentation centrifugation method.Body fluids were collected from 85 patients with tumor and 53 patients with non tumor，in the same volume of body fluids，immune magnetic microsphere suspension and 138 patients with body fluids （urine sediment，ascites，peritoneal effusion，pleural effusion，nipple discharge） mixture，the collected suspicious cells in conventional microscopy，and separated the microscopic examination of the 138 patients with body fluids sediment precipitation centrifugal，compared the two kinds of mirror inspection results.Result：The positive rate of immune magnetic microsphere detection method in non tumor patients was 1.9%（1/53），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 0（0/53）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with hepatocellular carcinoma was 91.6%（11/12），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 33.3%（4/12）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with colon cancer was 88.9%（24/27），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 37.0%（10/27）.The positive rate of the detection method of the immune magnetic microsphere in patients with lung cancer was 80.0%（12/15），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 40.0%（6/15）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with breast cancer was 90.3%（28/31），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 45.2%（14/31）.In patients with non tumor and tumor patients，the positive detection rate of the immune magnetic microsphere detection method were higher than those in precipitation centrifugation test method（P<0.05）.Conclusion：Immune magnetic microsphere detection method easily ruled out normal cells mixed in body fluids in the sediment，broken cells and non cellular components，excluding factors interference microscopy，increase the screening concentration of positive cells in efforts to improve the positive detection rate，has a great effect on tumor diagnosis，pathological diagnosis，clinical tumor cytology more effective and convenient method.endprint

【Key words】 IMMS； Malignant tumor； Body fluids tumor cells

First-authors address：Beijing Geriatric Hospital，Beijing 100029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.038

磁性微球（Magnetic Microspheres，MMS）是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1]。因其具有諸多的優(yōu)良特性，如粒徑小、具有超順磁性、表面可修飾等，而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)方向。其中，被應(yīng)用于免疫學(xué)中的磁性微球，又被稱為免疫磁性微球（Immunomagnetic Microspheres，IMMS）[2-4]，它是通過表面修飾賦予微球表面特殊的功能基，如-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH等，這些功能基團(tuán)可以與特異性免疫配基相結(jié)合[4]，使抗體或抗原固定于IMMS表面，利用抗原-抗體的高度特異性識別作用，形成“抗原（抗體）-抗體（抗原）-磁性微球”結(jié)構(gòu)，從而應(yīng)用于細(xì)胞分離、疾病診斷、食品和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。當(dāng)前MMS的制備方法，主要有生物來源法、共混包埋法、單體共聚法、活化溶脹法、界面沉積法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法及共沉淀法等[3]。

當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)惡性腫瘤后，經(jīng)常有瘤細(xì)胞從腫瘤組織表面脫離、播散，侵入到血液、淋巴液中，或進(jìn)入體（胸、腹、心包）腔、空腔臟器、外分泌管道中。這些脫落細(xì)胞在遠(yuǎn)隔部位可能形成轉(zhuǎn)移灶，臨床上如果檢測到腫瘤脫落細(xì)胞，將提供至關(guān)重要的病理診斷依據(jù)[5-6]。因此，根據(jù)病情采集患者胸水、腹水、胃液、尿液、胰液、膽汁、唾液、痰液、乳頭溢液、關(guān)節(jié)腔液、腦脊液等，搜尋體液中的腫瘤細(xì)胞，已成為臨床診斷不可或缺的手段[7]。目前，為了收集患者體液中脫落瘤細(xì)胞，在采集待檢體液后，通常經(jīng)過自行沉淀和/或離心等步驟，吸取體液沉渣再進(jìn)行顯微鏡檢。少數(shù)大醫(yī)院也采用流式細(xì)胞儀等手段分析體液，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞或腫瘤標(biāo)志物等，當(dāng)然，最終還需用顯微鏡進(jìn)行病理細(xì)胞形態(tài)學(xué)判斷。由于體液沉渣中常混雜多量正常細(xì)胞、破碎細(xì)胞和非細(xì)胞成分，不僅加大鏡檢工作量，而且降低了檢出陽性率。為此，引用免疫磁微球材料，在顯微鏡檢前，首先對體液沉渣進(jìn)行陽性篩選。

免疫磁微球以聚苯乙烯為基質(zhì)，表面包被選定的單克隆抗體，制成免疫磁微球懸液備用。腫瘤細(xì)胞免疫學(xué)研究資料表明：不同類型的惡性腫瘤細(xì)胞膜表面存在各自相對特異的抗原決定簇，有別于正常細(xì)胞，如CA125、CA153、CEA、AFP、PSA、Cyfra21-1、Ferritin等蛋白質(zhì)類的膜抗原物質(zhì)，就是識別瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。針對不同抗原可以制備出相應(yīng)的靶向單克隆抗體，包被在微球表面，形成免疫磁微球。如將選定的免疫磁微球懸液與體液沉渣混合、保溫，微球表面單克隆抗體則自動導(dǎo)向識別惡性腫瘤細(xì)胞膜對應(yīng)的抗原決定簇，并與之結(jié)合，最終形成免疫磁微球—腫瘤細(xì)胞復(fù)合體[8-9]。隨后借助磁力將復(fù)合體吸出，達(dá)到陽性篩選瘤細(xì)胞目的[10]。如此，輕易排除了混雜在體液沉渣中的正常細(xì)胞、破碎細(xì)胞和非細(xì)胞成分，排除干擾鏡檢的諸多因素。理論上講，附著在腫瘤細(xì)胞上的免疫磁微球數(shù)量越多，吸附瘤細(xì)胞的磁性引力越大。為此，一方面要探求兩者數(shù)量最佳比值，依據(jù)經(jīng)驗，加入微球量：估計細(xì)胞數(shù)=1∶10為妥；另一方面與各自體積有關(guān)。由于腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，表面抗原密度不均，體積大小不等，直徑多在15 μm左右，如果微球粒度保持在1～5 μm，可促使數(shù)個微球同時牽拉一個瘤細(xì)胞，提高篩選的陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機(jī)抽取2014年協(xié)和醫(yī)院體檢中心體檢者（年齡≥18歲的男性或女性）53例，取尿液53份，體檢者年齡42～70歲。同期協(xié)和醫(yī)院傳染科、消化科、內(nèi)科和外科住院且臨床已經(jīng)確診的腫瘤患者85例，其中肝癌患者腹水12例，年齡38～65歲；結(jié)腸癌患者腹腔積液27例，年齡44～71歲；肺癌患者胸腔積液15例，年齡26～57歲；乳腺癌患者乳頭溢液31例，年齡38～59歲；患者均為經(jīng)病理組織學(xué)鏡檢證實的確診病例。

1.2 方法 將收集到體液，經(jīng)自行沉淀和/或離心等步驟，取得體液沉渣并置入提供的專用試管中。選定一種或數(shù)種與腫瘤相關(guān)的單克隆抗體，制備相應(yīng)的免疫磁微球懸液。（1）初步鏡檢估算體液沉渣中細(xì)胞總量=腫瘤細(xì)胞+非瘤細(xì)胞。（2）加入適量免疫磁微球懸液到體液沉渣中，相互混勻，在室溫下保溫，輕微震蕩2 h左右。（3）反應(yīng)終止后，在混合懸液中插入專用細(xì)胞提取棒，放置5 min，以充分吸附免疫磁微球—腫瘤細(xì)胞復(fù)合體。專用細(xì)胞提取棒由強(qiáng)磁體棒心和塑料套管兩部分組成。（4）將細(xì)胞提取棒從混合懸液里移至緩沖液中。一旦抽出強(qiáng)磁體棒心后，磁力消失，附著在塑料套管外的免疫磁微球—腫瘤細(xì)胞復(fù)合體會自動脫離塑料套管外表面，輕輕晃動落入緩沖液中。（5）離心后，收集到的可疑細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)病理細(xì)胞學(xué)檢測。見圖1、2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在同等體積的體液中，免疫磁微球檢測方法的腫瘤陽性檢出率均高于常規(guī)沉淀離心檢測方法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3 討論

當(dāng)前，我國每年癌癥發(fā)患者數(shù)約200萬，全國每年死于癌癥的人數(shù)己超過140萬[11-13]，腫瘤的早期診斷是患者獲得長期生存的最主要途徑[14-16]，但目前腫瘤診治主要以中晚期為主，如計算機(jī)斷層掃描、超聲診斷、乳房攝影等檢測的最小極限為l cm（109細(xì)胞）直徑的腫瘤[17-18]。并且缺點(diǎn)較多，靈敏度差，特異性差，操作復(fù)雜，給患者帶來不便。

從表1可以看出，在同等體積的體液中，與常規(guī)沉淀+離心方法比較，常規(guī)沉淀+離心方法由于體液沉渣中常混雜多量正常細(xì)胞、破碎細(xì)胞和非細(xì)胞成分，既加大了鏡檢工作量，也要求鏡檢工作人員的經(jīng)驗豐富，這些因素都可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞陽性檢出率的下降。而免疫磁微球收集法在顯微鏡檢前，先對體液沉渣進(jìn)行陽性篩選，就避免了這些不足，加大了篩選和濃聚陽性細(xì)胞的力度，明顯提高檢測的陽性率。endprint

免疫磁微球技術(shù)可用來分離人類各種細(xì)胞，如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞，造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞等[17，19-20]。免疫磁性分離方法不僅簡便快速，而且可以在接近細(xì)胞正常生活狀態(tài)的情況下進(jìn)行，對細(xì)胞活性無顯著影響，在生理、病理、藥理、微生物等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[21-22]。

免疫磁性微球用于細(xì)胞的清除也有一些缺點(diǎn)，主要是在方法學(xué)、靶細(xì)胞種類、檢測方法的靈敏度等方面變異性較大，但仍不失為一種安全、簡便、有效的方法，為臨床腫瘤細(xì)胞學(xué)病理診斷提供更有效、便捷的方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 岳巧艷，袁捷.免疫磁珠技術(shù)在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，29（1）：111-114.

[2] 康繼超，沙木屯布卡，謝蜀生.用免疫磁性微球從骨髓中分離癌細(xì)胞[J].藥學(xué)學(xué)報，1998，33（1）：52-56.

[3] 劉先橋，官月平，邢建民，等.磁性微球的制備及在細(xì)胞分離中的應(yīng)用[J].化學(xué)通報，2004，67（10）：723-728.

[4] 謝鋼，張秋禹，李鐵虎.磁性高分子微球[J].高分子通報，2001，25（6）：38-45.

[5] 李傳剛，李詠蘭，韓志剛.免疫磁珠的制備及其在捕獲乳腺癌患者白細(xì)胞中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)漢文版），2014，43（1）：60-65.

[6] 劉瑜，張秋禹，劉清，等.磁性復(fù)合微球的生物偶聯(lián)改性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工，2011，31（8）：13-17.

[7] 周小昀，李龍蕓，郝淮杰，等.外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞在晚期肺癌患者的預(yù)測及預(yù)后價值研究[J].癌癥進(jìn)展，2010，8（5）：484-490.

[8] 程道勝，李春嬌，黃黎明.外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞的免疫磁珠法檢測[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2011，11（2）：219，221.

[9] 范蓉，錢和年，馮捷，等.免疫磁珠技術(shù)在卵巢癌研究中的應(yīng)用[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，30（4）：367-368.

[10] Fung K F M，Senterman M，Eid P，et al.Comparison of Fourier-transform infrared spectroscopic screening of exfoliated cervical cells with standard Papanicolaou screening[J].Gynecologic Oncology，1997，66（1）：10-15.

[11] 陳媛媛，程勃然，王振盟，等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2014，8（9）：1758-1762.

[12] 韓鴻彬，李朝輝，劉帥鋒，等.胃癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及其臨床意義[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2015，22（7）：840-843.

[13] 俞雄斌，歐陽學(xué)農(nóng)，余宗陽.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測方法及其在肺癌臨床中的應(yīng)用[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18（2）：179-182.

[14] 韓曉芳，王曉成，王藹明.密度梯度離心聯(lián)合上皮細(xì)胞黏附分子免疫磁珠富集法檢測卵巢癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].中國藥物與臨床，2016，16（4）：460-462.

[15] 陸松梅，周琦，張娜，等.EPCAM、MUC16免疫磁珠制備及循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測[J].免疫學(xué)雜志，2015，31（6）：517-522.

[16] 黃毅，陳忠新，謝蜀生.應(yīng)用免疫磁珠·PCR技術(shù)分選及檢測尿中的膀胱癌細(xì)胞[J].腫瘤防治研究，1999，26（1）：18-20.

[17] 李蕾，江澤飛.循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在不同階段不同類型乳腺癌中的應(yīng)用[J].中國癌癥雜志，2013，23（8）：570-575.

[18] Fodstad O，F(xiàn)aye R，H?if?dt H K，et al.Immunobead-based detection and characterization of circulating tumor cells in melanoma patients[J].Recent Results in Cancer Research，2001，158（7）：40-50.

[19] 張健，馮曉燕，孫亭亭，等.乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離鑒定試劑盒的建立[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2015，30（10）：1011-1016.

[20] 曹君劍，李富榮，唐渝，等.納米免疫磁性微球的制備和性能研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2005，21（9）：694-696，700.

[21] 邱林，杜娟，王海燕，等.利用微流控免疫磁珠分選儀高效富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2016，38（6）：634-637.

[22] 邊莉，劉毅，江澤飛.循環(huán)腫瘤細(xì)胞動態(tài)變化對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者治療反應(yīng)及預(yù)后的預(yù)測價值[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（4）：265-268.

（收稿日期：2016-08-24） （本文編輯：張爽）endprint