以GLP-1受體為靶點的藥物篩選模型的建立及功能鑒定

黎思彤，鄭雪萍，楊學敏，聶 濤，陳健文，劉培慶，李 民

(1. 中山大學藥學院新藥篩選中心，新藥成藥性評估與評價國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣東 廣州 510006；2. 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，深圳 518057)

以GLP-1受體為靶點的藥物篩選模型的建立及功能鑒定

黎思彤1，鄭雪萍1，楊學敏2，聶 濤2，陳健文1，劉培慶1，李 民1

(1. 中山大學藥學院新藥篩選中心，新藥成藥性評估與評價國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣東 廣州 510006；2. 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，深圳 518057)

目的 以GLP-1受體為靶點，建立GLP-1類似物活性檢測的細胞模型，為GLP-1類似物以及GLP-1受體激動劑的藥物篩選提供一種簡單可靠的評價方法。方法 首先將人源GLP-1受體基因插入pEGFP-N3，構建真核表達載體pEGFP-GLP-1R，并轉(zhuǎn)染至HEK293A細胞中，經(jīng)G418壓力篩選后獲得穩(wěn)定表達GLP-1R-GFP的293A細胞株，然后通過GFP熒光信號和Western blot檢測GLP-1R-GFP融合蛋白在該細胞中的表達與分布；最后利用GLP-1類似物利拉魯肽刺激細胞，均相時間分辨熒光法檢測細胞內(nèi)cAMP含量變化。結果 成功構建了GLP-1R-GFP-293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，GLP-1R-GFP蛋白主要分布在細胞膜表面，該細胞對GLP-1類似物利拉魯肽具有高靈敏度和產(chǎn)生cAMP的特異性反應。結論 利用所構建的細胞模型，可對小分子和GLP-1類似物進行體外活性分析，為篩選GLP-1受體激動劑奠定了模型基礎。

cAMP；GLP-1受體；細胞模型；融合蛋白；均相時間分辨熒光法；糖尿病

目前關于2型糖尿病(T2DM)的治療新靶點有二肽基肽酶-4、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2、胰高血糖素樣肽1受體(glucagon-like peptide 1 receptor,GLP-1R)等[1]。其中GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)家族中的胰高血糖素受體亞家族，主要在胰島β細胞表達，被認為是一個治療T2DM的關鍵靶受體[2]。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是腸道內(nèi)L細胞分泌的一種肽類激素，是內(nèi)源性GLP-1R激動劑，通過與GLP-1R結合，激活腺苷酸環(huán)化酶，促進細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP)水平升高，正性調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平，從而刺激胰島素的合成。GLP-1具有促進胰島素釋放、增加肝糖原儲存量、延緩胃排空、降低食欲、抑制β細胞凋亡、抑制餐后胰高血糖素的分泌、緩解低血糖、減輕體重等優(yōu)點[3-4]，故GLP-1 類降糖藥物的應用是2型糖尿病治療中的一個重要發(fā)展。由于GLP-1的T1/2不足5 min，在體內(nèi)很快被二肽基肽酶-4降解和腎臟清除而失效，限制了其臨床應用[5]，開發(fā)治療效果更好、副作用更小的GLP-1類似物以及小分子GLP-1R激動劑成為研究重點，開發(fā)過程需要建立可靠、靈敏的細胞篩選模型。

根據(jù)GPCRs的信號通路特性, 其篩選模型大致可以分為3類：第1類是基于受、配體結合檢測的分析方法；第2類是基于第二信使檢測的分析方法；第3類是基于受體功能反應的報告基因檢測方法[6]。而cAMP作為主要第二信使，直接檢測其含量的變化可直觀反映GLP-1及其類似物的活性[7-8]，目前常用檢測方法有均相時間分辨熒光法(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)、放射性免疫分析法、ELISA法等。放射性免疫分析法存在放射性物質(zhì)，不適合作為大量篩選藥物的常規(guī)手段。與ELISA法比，HTRF法不需洗滌，易于自動化，能夠微量且快速操作，結果穩(wěn)定，對cAMP具有高特異性。因此，HTRF法以操作簡單、靈敏度高、通量大、實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠、假陽性率低等明顯優(yōu)勢被更廣泛應用[9]。本實驗試圖建立穩(wěn)定表達GLP-1R的細胞株，為篩選GLP-1R激動劑藥物奠定模型基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 分子克隆所需的胰蛋白胨、酵母提取物及瓊脂糖均購自英國Oxoid公司；PCR酶購自日本東洋紡生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等工具酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PCR產(chǎn)物回收試劑、凝膠回收試劑和質(zhì)粒小提試劑均購自中國美基生物有限公司；cAMP檢測試劑購自法國Cisbio公司；細胞培養(yǎng)所用DMEM培養(yǎng)基和類胎牛血清購自美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；G418購自美國Tocris Bioscience公司；商業(yè)化制劑利拉魯肽(Liraglutide)購自丹麥Novo Nordisk公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自美國MP Biomedicals公司；GFP抗體(sc-9996)購自Santa Cruz公司；GAPDH抗體(AB-P-R 001)購自GOOD HERE公司；大腸桿菌DH5α、真核表達載體pEGFP-N3和HEK293A細胞株由本實驗室保存；質(zhì)粒pENTER-GLP-1R購自山東維真公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 表達質(zhì)粒的構建[10]以含有人源GLP-1R基因的質(zhì)粒pENTER-GLP-1R為模板，PCR擴增GLP-1R基因，上、下游引物分別引入XhoI和EcoRI酶切位點及保護堿基，編碼基因不含終止密碼子。上游引物：5′-CCGCTCGAGCTATGGCCGGCGCCC-3′(XhoI)，下游引物：5′-CCGGAATTCGAACTGCAGGAGGCCTGGCAA-3′(EcoRI)。PCR產(chǎn)物插入pEGFP-N3表達質(zhì)粒，具體操作如下： PCR產(chǎn)物和pEGFP-N3質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶過夜連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，卡那霉素(50 mg·L-1)篩選培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆擴增后，提取質(zhì)粒進行雙酶切和DNA測序鑒定。最終獲得重組質(zhì)粒命名為pEGFP-GLP-1R。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察 HEK293A細胞接種6孔板中，于含10%(V/V)類胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至60%為最佳轉(zhuǎn)染狀態(tài)。按照Lipofectamine 2000 試劑操作說明分別進行空白質(zhì)粒pEGFP-N3和重組質(zhì)粒pEGFP-GLP-1R的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 h后，更換為含5%(V/V)類胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至24 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號在細胞的表達與分布。1.4 篩選穩(wěn)定表達GLP-1R-GFP的293A細胞[11]Lipofectamine 2000介導pEGFP-GLP-1R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，以1 ∶10稀釋細胞接種于含G418(1 g·L-1)的DMEM培養(yǎng)液中，在10 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，篩選至d 14，熒光顯微鏡下可觀察到帶GFP熒光細胞集落，板底畫圈標記，操作臺內(nèi)仔細刮掉圈外非熒光細胞團，加0.25%胰酶消化細胞克隆集落轉(zhuǎn)至小皿，獲得穩(wěn)定表達GLP-1R-GFP的細胞，用含低濃度G418(500 mg·L-1)DMEM培養(yǎng)液維持培養(yǎng)細胞1周后，更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 Western blot檢測GLP-1R-GFP蛋白表達水平 野生型HEK293A細胞為空白對照組，瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N3空質(zhì)粒的HEK293A細胞為陽性對照組，穩(wěn)轉(zhuǎn)GLP-1R-GFP-293A的細胞為實驗組，收集細胞，加入預冷PBS洗滌2遍，加入細胞裂解液后置于冰上30 min，13 000 r·min-1，4°C離心15 min，取上清。取25 μg處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%脫脂奶的TBST室溫封閉1 h，分別與GFP一抗(1 ∶1 000)、GAPDH一抗(1 ∶1 000)于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，與標記有HRP的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后顯影曝光，對目的蛋白的分子量及表達量進行分析，GAPDH表達作為內(nèi)參。

1.6 GLP-1R-GFP-293A細胞株的活性分析及cAMP檢測試劑使用條件的優(yōu)化 利用Cisbio公司生產(chǎn)的cAMP檢測試劑，給予已上市藥制劑利拉魯肽刺激細胞產(chǎn)生cAMP，通過HTRF法檢測cAMP含量的變化，檢測上述獲得的GLP-1R-GFP-293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株活性。具體操作如下：胰酶消化細胞，離心1 000 r·min-1，5 min，收集細胞沉淀，用緩沖液(含0.5 mmol·L-1IBMX 和0.1% BSA的PBS)重懸細胞，用快速移液器(Multidrop Combi)將5μL含有細胞的分析緩沖液加入到384孔標準白板中，再加入5 μL的利拉魯肽，濃度范圍為0.33×10-6～6.4×10-3μmol·L-1，用透明封板膜密封，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育30 min。用Multidrop Combi先后將5 μL cAMP-d2工作液和Anti-cAMP antibody-cryptate工作液加入到反應板相應孔中，室溫避光孵育1 h。利用多功能酶標儀檢測665 nm與615 nm的吸光值，并用兩者的比值代表cAMP含量，或利用標準曲線(Fig 3A)將比值換算成cAMP濃度[12]。參照cAMP檢測試劑說明書建議，以2 000個細胞為檢測體系，在100 nmol·L-1的利拉魯肽刺激下，比較穩(wěn)轉(zhuǎn)GLP-1R-GFP-293A細胞與野生型HEK293A細胞的665 nm/615 nm的吸光值比值，分析GLP-1R-GFP-293A細胞的活性。100 nmol·L-1的利拉魯肽刺激GLP-1R-GFP-293A細胞的不同檢測數(shù)目：400、800、1 600、3 000個細胞，比較665 nm/615 nm的吸光值比值，確定最佳檢測體系的細胞個數(shù)。

利用梯度濃度稀釋的利拉魯肽刺激GLP-1R-GFP-293A細胞，在最佳細胞檢測數(shù)目時，檢測利拉魯肽的EC50值，進一步驗證GLP-1R-GFP-293A細胞篩選模型的可行性。

2 結果

2.1 pEGFP-GLP-1R質(zhì)粒構建與鑒定 目的基因片段經(jīng)PCR獲得，連接入載體后經(jīng)菌落PCR鑒定，獲得大小約1.3 kb條帶(Fig 1A、1B)。挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒進行XhoI和EcoRI雙酶切鑒定，獲得大小約6 kb、4.7 kb、1.3 kb的條帶(Fig 1C)，所獲目的條帶的大小正確。質(zhì)粒經(jīng)雙向測序鑒定，堿基序列與插入方向完全正確，最終獲得重組質(zhì)粒命名為pEGFP-GLP-1R。

Fig 1 Construction and identification of plasmids pEGFP-GLP-1R

A: The fragments of GLP-1R were amplified by PCR from the template of pENTER-GLP-1R; B: The positive plasmids with GLP-1R were identified using colony-PCR; C: The target plasmids were digested with XhoI and EcoRI.M: Marker; X: XhoI; E: EcoRI

2.2 細胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察 Lipofectamine 2000介導pEGFP-GLP-1R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察瞬時轉(zhuǎn)染后綠色熒光信號分布。pEGFP-N3空質(zhì)粒組，綠色熒光均勻分布在細胞質(zhì)內(nèi)，而pEGFP-GLP-1R重組質(zhì)粒組，綠色熒光主要分布在細胞膜上，符合GLP-1R膜受體分布[13]。結果表明，構建的重組質(zhì)?？捎行П磉_pEGFP-GLP-1R融合蛋白(Fig 2A)。

2.3 穩(wěn)定表達GLP-1R-GFP細胞株的建立與鑒定 轉(zhuǎn)染24 h后，在含有G418(1 g·L-1)的選擇培養(yǎng)基中篩選4周，獲得穩(wěn)定表達GLP-1R的細胞，命名為GLP-1R-GFP-293A細胞株，細胞融合至80%時GFP熒光陽性率高達100%。進一步Western blot驗證，結果表明GLP-1R-GFP融合蛋白在穩(wěn)轉(zhuǎn)GLP-1R-GFP-293A細胞株高表達，且分子量大小正確，約82 ku(Fig 2B)。

2.4 GLP-1R-GFP-293A細胞株的活性功能鑒定 如Fig 3B所示，檢測體系初始為2 000個細胞，100 nmol·L-1的利拉魯肽刺激后，與質(zhì)粒對照組比，穩(wěn)轉(zhuǎn)GLP-1R-GFP-293A細胞株的cAMP含量明顯升高(cAMP含量與665 nm/615 nm的吸光值比值呈反比，Delta F%表示665 nm/615 nm的吸光值比值，P<0.05)，而野生型HEK293A細胞的組間差異則無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。結果顯示，檢測體系為800個細胞時，空白對照組與利拉魯肽實驗組的cAMP含量差異具有顯著性意義(P<0.01)，且符合標準曲線的有效范圍，故該細胞模型的最佳檢測體系為800個細胞(Fig 3C)，同時優(yōu)化了cAMP檢測試劑的檢測條件。

Fig 2 Detection of distribution and expression of GLP-1R-GFP in HEK293A cells by fluorescence microscopy and Western blot A:Detection of the distribution of GFP by fluorescence microscopy;B:Detection of the expression level of GLP-1R-GFP protein by Western blot.1:HEK293A transfected with lipofectamine 2000 only;2:HEK293A transfected with pEGFP-N3 vector;3:HEK293A transfected with pEGFP-GLP-1R plasmid

Fig 3 Assay optimization and validation of GLP-1R-GFP-293A cell model

A: The standard curve of cAMP, the effective range of cAMP is between A and B respectively; B: Activity comparison of the GLP-1R-GFP-293A stable cell line using 2 000 cells; C: Optimization of cell number for cAMP measurement treated with 100 nmol·L-1of Liraglutide; D: Detection of the EC50of Liraglutide using prepared cell model with optimum cell number.*P<0.05，**P<0.01vscontrol

為了進一步驗證GLP-1R-GFP-293A細胞篩選模型的可行性，給予梯度濃度稀釋的利拉魯肽刺激GLP-1R-GFP-293A細胞的最佳檢測體系，檢測結果表明利拉魯肽的EC50值為5.24 nmol·L-1(Fig 3D)，與文獻已報道范圍一致[14]，結果表明該細胞模型可用于GLP-1R激動劑體外活性評價。

3 討論

GLP-1 及其類似物具有葡萄糖濃度依賴性地降低血糖的作用及對胰島β細胞的促生長作用，是治療糖尿病最有潛力的藥物之一。本研究成功構建了真核表達載體pEGP-GLP-1R，轉(zhuǎn)染至HEK293A細胞，經(jīng)G418篩選獲得了高效表達GLP-1R的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，為GLP-1類似物的活性檢測提供了穩(wěn)定細胞篩選模型。

本文所采用的HTRF技術結合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移和時間分辨熒光兩種技術，是基于銪穴狀化合物的供體與受體(第二熒光標記物)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，其特點有：熒光持續(xù)時間更久、讀取測量時間延遲、低背景、降低干擾因素、均質(zhì)式檢測、抵御金屬離子對信號的影響[15]。本工作利用HTRF法檢測細胞內(nèi)cAMP含量變化，對細胞進行了活性分析，在100 nmol·L-1的利拉魯肽刺激下，穩(wěn)轉(zhuǎn)GLP-1R-GFP-293A細胞株的cAMP含量明顯升高，而野生型HEK293A細胞則無變化，表明構建的GLP-1R-GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株具有響應GLP-1類似物的功能。在非藥物刺激條件下細胞自然產(chǎn)生cAMP的含量應極低，給予GLP-1受體激動劑刺激后則明顯升高cAMP的產(chǎn)生量，據(jù)此評價GLP-1類似物的活性高低，故本細胞模型對GLP-1類似物進行活性檢測的關鍵在于細胞數(shù)，而最佳反應時間和溫度均依據(jù)檢測試劑的應用條件而定，分別為30 min、37 ℃。通過探索不同檢測體系對100 nmol·L-1的利拉魯肽的響應值，最后確定了cAMP檢測試劑的最佳細胞數(shù)量為800個，在此最佳檢測條件下，梯度稀釋的GLP-1類似物利拉魯肽刺激細胞產(chǎn)生cAMP的EC50值為5.24 nmol·L-1，與相關文獻報道范圍一致。表明本細胞模型靈敏、可靠、穩(wěn)定，利用該模型優(yōu)化現(xiàn)有的cAMP檢測試劑的使用條件，為篩選GLP-1類似物以及GLP-1R小分子激動劑奠定了模型基礎。

[1] 張慧敏，林 琳，陳媛媛，等．基于胰高血糖素類肽-1受體的2型糖尿病治療藥物研究進展[J]．中國臨床藥理學與治療學，2015，20(6): 699-706．

[1] Zhang H M，Lin L，Chen Y Y，et al．Recent progress in research of antidiabetic agents for T2DM based on GLP-1 receptor[J]．ChinJClinPharmacolTher，2015，20(6): 699-706.

[2] Pabreja K，Mohd M A，Koole C，et al．Molecular mechanisms underlying physiological and receptor pleiotropic effects mediated by GLP-1R activation[J]．BrJPharmacol，2014，171(5): 1114-28．

[3] Pratley R E，Gilbert M．Targeting incretins in type 2 diabetes:role of GLP-1 receptor agonists and DPP-4 inhibitors[J]．RevDiabetStud，2008，5(2): 73-94．

[4] Leech C A，Dzhura I，Chepurny O G，et al．Molecular physiology of glucagon-like peptide-1 insulin secretagogue action in pancreatic beta cells[J]．ProgBiophysMolBiol，2011，107(2): 236-47．

[5] Meier J J，Nauck M A，Kranz D，et al．Secretion，degradation，and elimination of glucagon-like peptide 1 and gastric inhibitory polypeptide in patients with chronic renal insufficiency and healthy control subjects[J]．Diabetes，2004，53(3): 654-62．

[6] 范益軍，歐陽克清，王貴學，等．胰升血糖素樣肽-1受體激動劑高通量篩選細胞模型研究[J]．中山大學學報(自然科學版)，2007，46(5): 83-7．

[6] Fan Y J，OuYang K Q，Wang G X，et al．Study on cell model for high throughput screening the agonist of glucagon-like petide-1 receptor[J]．ActaSciNatUnivSunyatseni，2007，46(5): 83-7．

[7] Trehan A，Rotgers E，Coffey E，et al．CANDLES，an assay for monitoring GPCR induced cAMP generation in cell cultures[J]．CellCommunSignal，2014，12(1): 3015-20．

[8] Gabriel D，Vernier M，Pfeifer M J，et al．High throughput screening technologies for direct cyclic AMP measurement[J]．AssayDrugDevTechnol，2003，1(2): 291-303．

[9] 李 靜，謝 欣．靶向G蛋白偶聯(lián)受體的高通量藥物篩選方法[J]．國際藥學研究雜志，2012，39(5): 353-7．

[9] Li J，Xie X．High-throughput screening assays for G-protein-coupled receptors-targeted drug discovery[J]．JIntPharmRes，2012，39(5):353-7．

[10] 苑玉和，孫建棟，張 威，等．糖原合成酶激酶3β轉(zhuǎn)基因細胞模型的建立[J]．中國藥理學通報，2009，25(2): 264-7．

[10] Yuan Y H，Sun J D，Zhang W，et al．Construction of glycogen synthase kinase 3β transgenic cell model[J]．ChinPharmacolBull，2009，25(2): 264-7．

[11] 葛治娟，于金梅，馬曉蕓，等．穩(wěn)定表達CRFR1的HEK293細胞株的建立與功能鑒定[J]．中國藥理學通報，2014，30(8): 1113-6．

[11] Ge Z J，Yu J M，Ma X Y，et al．Development and evaluation of HEK293 cells stably expressing CRFR1[J]．ChinPharmacolBull，2014，30(8): 1113-6．

[12] Ayoub M A，Landomiel F，Gallay N，et al．Assessing gonadotropin receptor function by resonance energy transfer-based assays[J]．FrontEndocrinol(Lausanne)，2015，6:130．

[13] Aiysha T，Stephens J W，Bain S C，et al．Molecular characterisation of small molecule agonists effect on the human glucagon like peptide-1 receptor internalisatio[J]．PLoSOne，2016，11(4):e0154229．

[14] Gault V A，Kerr B D，Harriott P，et al．Administration of an acylated GLP-I and GIP preparation provides added beneficial glucose-lowering and insulinotropic actions over single incretins in mice with type 2 diabetes and obesity[J]．ClinSci(Lond)，2011，121(3): 107-17．

[15] Degorce F，Card A，Soh S，et al．HTRF: a technology tailored for drug discovery-a review of theoretical aspects and recent applications[J]．CurrChemGenomics，2008，3(1): 22-32.

Development and evaluation of a cell model targeted on GLP-1 receptor

LI Si-tong1, ZHENG Xue-ping1, YANG Xue-min2, NIE Tao2, CHEN Jian-wen1, LIU Pei-qing1, LI Min1

(1.CenterforDrugScreening,SchoolofPharmaceuticalSciences,NationalandLocalUnitedEngineeringLabofDruggabilityandNewDrugEvaluation,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510006,China; 2.HybioPharmaceuticalCo,LTD,Shenzhen518057,China)

Aim To establish a cell model targeting on GLP-1R, and evaluate its function by the cAMP assay, for screening the new class of GLP-1 analogues as anti-diabetic candidates. Methods An eukaryotic expression vector pEGFP-GLP-1R was constructed and transfected into HEK293A cells. After selecting with G418, a cell line stably expressing GLP-1R-GFP was established. The expression and the cellular distribution of GLP-1R-GFP fusion protein were investigated by Western blot and fluorescence microscopy. Then, the activity of GLP-1 analogue Liraglutide was evaluated by monitoring the content of cAMP via HTRF using this cell model. Results GLP-1R-GFP-293A cell line was successfully established. GLP-1R-GFP fusion proteins were mainly distributed in the cell membrane. The dose-responsive relationship experiments revealed that cAMP could be effectively stimulated by Liraglutide using this cell model. Conclusion This cell model could be used to detect the bioactivity of GLP-1 analoguesinvitro, which lays a foundation for the screening of GLP-1 analogues and small GLP-1R agonists.

cAMP; GLP-1R; cell model; fusion protein; HTRF; diabetes

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.052.html

2016-10-11，

2016-11-12

廣東省自然科學基金資助項目(No 2016A030313335)

黎思彤(1992 - )，女，碩士生，研究方向：藥物評價，E-mail:470032156@qq.com; 劉培慶(1964- )，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail: liupq@mail.sysu.edu.cn; 李 民(1976- )，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：藥物篩選，通訊作者，E-mail:limin65@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.026

A

1001-1978(2017)02-0285-05

R392.11；R587.1；R965.1；R977.6