溴吡斯的明新型納米乳體外釋放和大鼠在體胃腸吸收

袁譽(yù)銘，陳學(xué)梁，陳 靜，李 娜，張景勍

(重慶醫(yī)科大學(xué)重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016)

溴吡斯的明新型納米乳體外釋放和大鼠在體胃腸吸收

袁譽(yù)銘，陳學(xué)梁，陳 靜，李 娜，張景勍

(重慶醫(yī)科大學(xué)重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016)

目的 制備油包水型溴吡斯的明新型納米乳(novel pyridostigmine bromide nanoemulsion, PPNE)，研究其體外釋放規(guī)律及各胃腸段吸收動(dòng)力學(xué)特征。方法 選用3種不同濃度pH 6.8、pH 7.4、pH 7.8的PBS以及pH 1.2的HCl作為釋藥介質(zhì)，測(cè)定并繪制其體外釋藥曲線；并采用在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停容^溴吡斯的明(pyridostigmine bromide，PB)和PPNE在胃腸道的吸收行為。結(jié)果 在4種釋放介質(zhì)中，PB釋放速率較快，而PPNE釋放速率相對(duì)減緩；PPNE的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)較PB在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸段中均增加。經(jīng)t檢驗(yàn)，PB和PPNE在4個(gè)腸段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 PPNE可提高藥物的生物利用度，明顯提高其藥物在體腸段的吸收；體外釋放中有良好的緩釋效果。

溴吡斯的明；納米乳；體外釋放；透析法；單向腸灌流模型；胃腸吸收

溴吡斯的明(pyridostigmine bromide，PB)是季銨類化合物，具有可逆性抑制突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿酶的作用。主要用于治療重癥肌無(wú)力，也可聯(lián)合其他藥物用于宮頸癌術(shù)后尿潴留、室上性心動(dòng)過(guò)速綜合癥以及糖尿病神經(jīng)源性膀胱的治療[1-4]。在其他方面，PB也可用于治療梭曼毒氣中毒所導(dǎo)致的呼吸困難。目前上市的片劑，口服后吸收差，生物利用度低，半衰期T1/2短，給藥頻繁[5]。磷脂是兩性分子，一端為含氮或磷的親水基團(tuán)，另一端則為具有疏水性的長(zhǎng)烴基鏈。因此，可與藥物形成復(fù)合物，增大藥物的脂溶性，促進(jìn)其吸收[6]。本實(shí)驗(yàn)將PB先與磷脂復(fù)合，再進(jìn)一步制備成油包水型納米乳，最終形成溴吡斯的明新型納米乳(novel pyridostigmine bromide nanoemulsion, PPNE)，以期提高生物利用度[7]等。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ♂ SD大鼠，體質(zhì)量230 g～250 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(渝)2013-0001。實(shí)驗(yàn)前未給予其他藥物。

1.2 藥品、試劑與儀器 溴吡斯的明(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，純度99.6%，批號(hào)20080302)；聚氧乙烯蓖麻油EL-35(德國(guó)BASF公司)；蛋黃卵磷脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；油酸乙酯(成都科龍?jiān)噭┗ぴ噭S)；PEG-400(成都科龍?jiān)噭┗ぴ噭S)；無(wú)水乙醇(成都科龍?jiān)噭┗ぴ噭S)；甲醇、乙腈為色譜級(jí)；其他試劑均為分析純。Agilent 1200液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

2 方法

2.1 PPNE的制備 取PB與磷脂適量，加入一定量無(wú)水乙醇使其溶解，恒溫水浴中磁力攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無(wú)水乙醇，即得到溴吡斯的明磷脂復(fù)合物。油酸乙酯為油相，復(fù)合乳化劑(吐溫80 ∶司盤80=2 ∶1)，PEG400為助乳化劑，20% PEG400為水相。按處方精密稱取上述輔料以及干燥至恒重的磷脂復(fù)合物，再將輔料與磷脂復(fù)合物混合于40 ℃恒溫水浴攪拌，使磷脂復(fù)合物(PLC)完全溶解，滴加處方量的水相，攪拌均勻即得油包水型PPNE。

2.2 體外釋放動(dòng)力學(xué) 選用正向動(dòng)態(tài)透析法[8]比較PB與PPNE在不同釋放介質(zhì)中的釋放特征。精密量取等濃度、等體積的PB和PPNE，把含藥透析袋分別投入不同的釋放介質(zhì)中，溶出介質(zhì)體積為500 mL，滿足漏槽條件。平行操作3份，水浴恒溫振蕩(37 ℃，100 r·min-1)，分別于12個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加等量同溫的釋放介質(zhì)。測(cè)定透析外液PB和PPNE的含量，計(jì)算累積釋放百分率，并繪制釋藥曲線。

2.3 在體胃腸吸收實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前[9-10]，將大鼠禁食18 h(可飲水)，腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉，固定。沿腹中線打開腹腔，暴露胃，在賁門和幽門口處各切一個(gè)小口，結(jié)扎賁門。用人工胃液清除胃內(nèi)容物，之后注入藥液，結(jié)扎幽門。2 h后排出藥液，沖洗剩余藥液并定容。沿腸道部位分別找到十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段，在4個(gè)腸段的上端和下端各剪開一個(gè)小口，插管結(jié)扎，用37 ℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，排出生理鹽水后，用37 ℃恒溫的空白K-R循環(huán)液先以0.5 mL·min-1流速，循環(huán)10 min。排盡K-R液，換用含藥循環(huán)液，并調(diào)節(jié)流速至0.2 mL·min-1，灌流1 h，收集灌流液，并用K-R液沖洗腸段，合并灌流液并定容，于-4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)后處死大鼠，剪下腸段，測(cè)得各腸段的長(zhǎng)度(l)和內(nèi)徑(r)，計(jì)算藥物的吸收速率常數(shù)(Ka)和有效滲透率(Papp)。分別按以下公式[11]：Ka=(X0-Xt)/C0t；Papp=Q·ln(Xin/Xout)/2πrl，得到藥物吸收的速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)。公式中，X0和Xt分別為藥物的初始量和灌流液中剩余藥物量，Xin和Xout分別代表流入和流出的藥物量，Q為灌流速度(mL·min-1)，t為灌流時(shí)間(min)，l和r分別為待測(cè)灌流腸段的長(zhǎng)度(cm)和內(nèi)徑(cm)，V為待測(cè)腸段的腸管體積。

2.4 樣品的分析

2.4.1 樣品的處理 精密量取100 μL樣品，加入甲醇，渦旋混勻，離心10 min，取上層液進(jìn)行測(cè)定。

2.4.2 色譜條件的建立 色譜柱：大連伊利特Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈 ∶水相(0.01mol·L-1磷酸二氫鈉，0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉，0.5%三乙胺，磷酸調(diào)pH至3.0)=21 ∶79，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：269 nm，流速：1 mL·min-1，進(jìn)樣體積100 μL。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的PB 10.0 mg，溶于適量的純水中，定容至10 mL，作為母液。再分別精密移取60、200、340、480、620、760、900 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到濃度分別為6、20、34、48、62、76、90 mg·L-1的PB甲醇溶液。按“2.4.2”項(xiàng)進(jìn)樣，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制高、中、低(90、48、6 mg·L-1)濃度的PPNE樣品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)進(jìn)樣，平行操作，于同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，重復(fù)測(cè)定5 d，分別計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。

3 結(jié)果

3.1 體外釋放曲線 在體外釋放中，縱坐標(biāo)為累積釋放率，橫坐標(biāo)為取樣時(shí)間，繪制體外釋放曲線。由Fig 1曲線得知，PPNE與PB在相同的釋放介質(zhì)中相比較，明顯改善藥物的釋放行為，達(dá)到緩釋作用。在不同的釋放介質(zhì)(pH 1.2的HCl,pH 6.8、pH 7.4、pH 7.8的PBS)中，PB前30 min的累積釋放率達(dá)到(82.92±4.61)%、(84.43±4.82)%、(83.68±4.34)%、(86.43±2.85)%，而PPNE的累積釋放率分別為(27.30±3.01)%、(30.91±1.30)%、(31.62±2.92)%、(33.46±3.26)%。

3.2 PB和PPNE在胃腸段的吸收 藥物峰面積(A)與質(zhì)量濃度(mg·L-1)做線性回歸，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=66.02 C+70.01(r=0.999 5)，藥物濃度在6～90 mg·L-1線性范圍良好。日內(nèi)精密度RSD分別為0.97%、1.13%、1.27%，日間精密度RSD分別為1.78%、1.53%、1.93%。

如Fig 2、3所示，PPNE在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段的Ka及Papp相對(duì)于PB均有提高。PB的Ka值由十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段依次遞減，而PPNE在4個(gè)腸段中的Ka分別為PB的1.40、1.45、3.97、1.36倍。PPNE的Papp在4個(gè)腸段中均增加，分別為PB的1.37、1.53、3.17、1.27倍。分別計(jì)算PB和PPNE在各腸段的表觀滲透系數(shù)(Papp)，見Fig 3。經(jīng)t檢驗(yàn)，4個(gè)腸段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PB在十二指腸段的吸收最好，結(jié)腸段次之，空腸和回腸段較差。將其制備成PPNE后，回腸段反而最好，十二指腸段次之，結(jié)腸段和空腸段較差。而PB和PPNE在胃的Ka值很小，這說(shuō)明PB的主要吸收部位是小腸，胃部吸收較小。

4 討論

溴吡斯的明屬于BSC Ⅲ類藥物[12]，即高溶解性、低滲透性。但口服生物利用度低，胃腸道吸收差，所用劑量較大，毒副作用加強(qiáng)。本文采取水滴定法將其制備成新型納米乳，可改善藥物的脂溶性，增加其在胃腸道上皮細(xì)胞的滲透性，提高藥物的生物利用度。

測(cè)定藥物體外釋放的方法，如中國(guó)藥典中記載的方法(籃法、槳法、小杯法)、透析法、室擴(kuò)散法等[13-14]，其中透析法是最為常用的方法。本文采取正向動(dòng)態(tài)透析法，可避免藥物在處理過(guò)程中的丟失和釋放介質(zhì)中由于藥物分解等原因?qū)е箩尫沤橘|(zhì)中pH值的變化。將PB制備成PPNE后，由體外釋放曲線可得知，在不同的釋放介質(zhì)中，PB的釋放曲線基本類似。而在同一種的釋放介質(zhì)中，PPNE的釋放速率比PB慢，具有良好的緩釋效果。其原因可能是PPNE處于內(nèi)水相和油水界面之間，體外釋放時(shí)需要穿過(guò)油相，而減緩其釋放速率。

選用在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂疾焖幬锏哪c道吸收特征，能在保證大鼠完整的血液循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)以及代謝功能的情況下，獲得較為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使其更接近生理狀態(tài)。眾所周知，藥物的腸道吸收是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，而藥物的滲透性是決定這一過(guò)程的主要影響因素。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所知，PPNE較PB在這4個(gè)腸段的Ka和Papp均增加，且經(jīng)t檢驗(yàn)，PPNE在4個(gè)腸段的Papp值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這都表明PPNE的滲透性增大，生物利用度提高。該原因是將PB與磷脂先制備成磷脂復(fù)合物，之后再形成油包水型納米乳，提高藥物的脂溶性，并且PPNE的磷脂成分可能與腸道上皮細(xì)胞膜成分的交換[15]，促進(jìn)其吸收。

Fig 1 PPNE and PB release profile in four dissolution media

Fig 2 Absorption rate constantKaof PB and PPNE in different segments of rat intestines and stomach

*P<0.05vsPB

Fig 3 Apparent permeability coefficientPappof PB and PPNE in different segments of rat intestines*P<0.05vsPB

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Invitrorelease and gastrointestinal absorption of novel pyridostigmine bromide nanoemulsion

YUAN Yu-ming, CHEN Xue-liang, CHEN Jing, LI Na, ZHANG Jing-qing

(ChongqingResearchCenterforPharmaceuticalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To prepare the novel pyridostigmine bromide nanoemusion(PPNE) and study its releaseinvitro, and to investigate the intestinal absorption.Methods Pyridostigmine bromide(PB) and PPNE were tested by HPLC in pH 1.2 HCl, pH 6.8, pH 7.4, pH 7.8 PBS. Rat single pass intestinal perfusion method was employed to investigate the absorption mechanism of PB and PPNE.Results PB release rate was faster than PB in the four release media; the intestinal absorption rate constant(Ka) and apparent permeability coefficient(Papp) of PPNE were increased in the duodenum, jejunum, ileum and colon segments. PB and PPNE had significant difference in the duodenum, jejunum, ileum and colon segments byttest(P<0.05).Conclusions PPNE can improve the bioavailability of drugs, increase the drugs permeability, significantly improve the absorption of the drugs in the intestinal segments. PPNE has obviously sustained effects.

pyridostigmine bromide; novel pyridostigmine bromide nanoemulsion; drug releaseinvitro; dialysis method; single-pass intestinal perfusion model; gastrointestinal absorption

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.048.html

2016-10-31,

2016-11-28

重慶市科委資助項(xiàng)目(No cstc2015jcyjBX2007)

袁譽(yù)銘(1992-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù),E-mail：469859028@qq.com; 張景勍(1973-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù),通訊作者,E-mail：zjqrae01@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.024

A

1001-1978(2017)02-0276-04

R-332；R322.44；R322.45；R943.4；R971.91；R977.3