腹腔注射5-HT2A受體拮抗劑MDL11939對小鼠急性及慢性疼痛的影響

黃思婷，姬寧寧，杜 雷，章功良，張詠梅

(1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

腹腔注射5-HT2A受體拮抗劑MDL11939對小鼠急性及慢性疼痛的影響

黃思婷1，姬寧寧1，杜 雷1，章功良2，張詠梅1

(1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

目的 探討5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)2A受體拮抗劑MDL11939在急性乙酸內(nèi)臟痛、急性切口痛和坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(chronic constrictive injury，CCI)模型中發(fā)揮的作用及意義。方法 選用♂昆明小鼠，建立急性乙酸內(nèi)臟痛、急性切口痛和CCI神經(jīng)病理性痛模型，通過腹腔注射給藥，觀察乙酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)變化、切口痛和CCI痛患側(cè)熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)變化。結(jié)果 在小鼠急性乙酸內(nèi)臟痛模型中，與溶劑對照組相比，MDL11939(0.25、0.5、1.0 mg·kg-1，i.p.)呈劑量依賴性地減輕乙酸內(nèi)臟痛，扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少。在急性切口痛和CCI模型中，與模型組和自身給藥前相比，MDL11939(0.5 mg·kg-1，i.p.)可以明顯提高小鼠患側(cè)的熱縮足閾值，減輕疼痛。結(jié)論 MDL11939通過腹腔系統(tǒng)性給藥可以有效地減輕急性乙酸內(nèi)臟痛、急性切口痛和CCI慢性神經(jīng)病理性痛。

5-HT2A受體；MDL11939；內(nèi)臟痛；坐骨神經(jīng)痛；切口痛；CCI

疼痛作為人類生活中最為常見的身心體驗，在2000年被世界衛(wèi)生組織定義為一類疾病。正常情況下，疼痛可以作為一種保護性機制使機體免于傷害，但在病理狀態(tài)下又可對人體造成無法估量的損害。疼痛的發(fā)病率較高，尤其是病理性疼痛，仍是當今困擾人類健康的一大難題。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為一種自體活性物質(zhì)，在腸嗜鉻細胞中的百分比約為0.90，在血小板中的百分比約為0.08～0.10，在外周作為炎癥調(diào)節(jié)因子與IL-6、TNF-α、緩激肽、前列腺素E2、組胺、去甲腎上腺素等共同發(fā)揮作用[1]。作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT以約0.01～0.02的百分比存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是中腦縫際核群，參與了體溫、睡眠、晝夜節(jié)律、運動、情緒等一系列病理生理活動[2]。

5-HT必須通過相應(yīng)受體的介導(dǎo)才能產(chǎn)生作用[3]。根據(jù)對特異性激動劑和拮抗劑選擇性的不同，可將5-HT受體(receptor，R)分為7類，目前認為與疼痛關(guān)系密切的受體主要有5-HT1R、5-HT2R、5-HT3R、5-HT4R、5-HT7R，其中5-HT2R又包括 5-HT2AR、5-HT2BR、5-HT2CR 3種亞型。以往研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR廣泛參與了精神類疾病的發(fā)生發(fā)展，包括焦慮、抑郁、精神分裂癥、藥物成癮等，也在記憶、認知方面發(fā)揮了重要的作用[4]。在疼痛模型如完全弗氏佐劑模型、角叉菜膠模型、坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎模型中，5-HT2AR均參與了疼痛調(diào)控[3]，但其在各類疼痛模型中致痛或抑痛的復(fù)雜作用至今尚未明了，有待進一步探究。

本實驗針對急性乙酸內(nèi)臟痛、急性切口痛和坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(chronic constrictive injury，CCI)慢性神經(jīng)病理性痛，通過腹腔注射給藥，探索5-HT2AR在外周被特異性抑制劑MDL11939阻斷時的疼痛行為學(xué)變化，為深入研究5-HT2AR在疼痛中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種♂小鼠72只，體質(zhì)量(28～32) g，由山東濟寧市任城區(qū)魯康動物飼料經(jīng)銷中心提供[許可證號：SCXK(魯)20140007]。小鼠置于晝夜(12 h/12 h)節(jié)律光照條件下，自由進食飲水，室溫(23±1)℃，所有小鼠實驗前靜養(yǎng)1周。

1.2 實驗分組 內(nèi)臟痛模型鼠隨機分為5組，每組7只。Vehicle組：0.9% NS+1% DMSO；MDL11939+Vehicle組：MDL11939(1.0 mg·kg-1)+0.9% NS；乙酸模型組：1% DMSO+0.6%乙酸(10 mL·kg-1)；MDL11939低、中、高劑量組：MDL11939(0.25、0.5、1.0 mg·kg-1)+0.6%乙酸(10 mL·kg-1)。切口痛模型鼠隨機分為2組，每組10只。切口痛組：小鼠進行右足底切口痛手術(shù)；MDL11939 給藥組：小鼠手術(shù)后指定時間內(nèi)測得基礎(chǔ)痛閾，然后給予MDL11939(0.5 mg·kg-1)，15 min后記錄1 h的熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)評分。CCI模型鼠隨機分為2組，每組8只。均進行CCI手術(shù)處理，術(shù)后d 3篩選造模成功的小鼠，于d 7上午8 ∶00開始進行痛閾檢測。CCI組：檢測小鼠基礎(chǔ)痛閾及其后1 h內(nèi)的TWL評分；MDL11939給藥組：小鼠首先測得基礎(chǔ)痛閾，然后給予MDL11939(0.5 mg·kg-1)，15 min后記錄1 h內(nèi)的TWL評分。以上各組動物平均體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異，給藥方式均為腹腔給藥，給藥體積均為0.1 mL·kg-1。

1.3 儀器與藥品 熱輻射刺激儀購自美國IITC 公司(IITCseries8)；MDL11939購自Tocris公司(Cat. No.0870)；DMSO購自Biosharp公司。

1.4 動物模型

1.4.1 小鼠急性乙酸內(nèi)臟痛模型制備 小鼠腹腔注射0.6%乙酸，10 mL·kg-1，建立急性內(nèi)臟痛模型[5]。造模成功的表現(xiàn)為小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起等動作。

1.4.2 小鼠急性切口痛模型制備 參照Brennan等[6]的方法，小鼠七氟醚吸入麻醉后，碘伏消毒右后爪跖部，用手術(shù)刀片從足底近端向足趾方向縱行切開5 mm的條形切口，切開足底皮膚后，用眼科鑷提起足底肌肉并進行縱向鈍性分離，并保持其起止附著點完整。切口處紗布壓迫止血，使用5-0絲線非吸收縫線行褥式縫合。

1.4.3 小鼠CCI模型制備 參照Bennett等[7]的方法建立坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型。小鼠稱重，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取側(cè)臥位，備皮，用碘伏消毒皮膚，切開右下肢股部皮膚后，順肌紋鈍性分離股二頭肌和臀肌，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)中上段，于坐骨神經(jīng)分成3支前的主干部位處，游離神經(jīng)7 mm左右。用4-0醫(yī)用鉻制腸線間隔1 mm松結(jié)扎3處，為了預(yù)防強度過大，結(jié)扎線的松緊以引起右后肢出現(xiàn)輕微的顫動為宜，從而保護神經(jīng)外膜的血運。結(jié)扎完畢后逐層縫合肌肉層和皮膚。

1.5 小鼠疼痛行為學(xué)測定

1.5.1 扭體反應(yīng)測定 MDL11939給藥15 min后給予乙酸，觀察乙酸腹腔注射后1 h內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。扭體反應(yīng)標準[5]為小鼠出現(xiàn)腹部收縮伴隨著身體拉長、后肢伸張等非自主性動作。

1.5.2 熱縮足反射潛伏期測定 急性切口痛于術(shù)后4 h進行TWL測定。CCI模型于術(shù)后d 3通過TWL篩選造模成功的小鼠，在術(shù)后d 7再進行TWL測定。統(tǒng)一采用熱輻射刺激儀測定小鼠足底TWL。將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves等[8]方法用熱輻射刺激儀照射小鼠足底，照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為TWL。熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致，自動切斷時間為25 s，以免造成熱輻射損傷，為避免或減少前1次刺激對隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時間至少為5 min，每只動物測定3次，取平均值作為小鼠TWL值。在具體時間點時只需測定1次。

2 結(jié)果

2.1 MDL11939對急性乙酸內(nèi)臟痛小鼠扭體反應(yīng)的影響 與Vehicle組相比，小鼠給予乙酸后，出現(xiàn)腹部收縮伴隨著身體拉長、后肢伸張等行為，表現(xiàn)為扭體反應(yīng)明顯增加(Fig 1A、1C，P<0.01)。與乙酸模型組相比，給予5-HT2A受體拮抗劑MDL11939之后，0.25、0.5、1.0 mg·kg-1給藥組扭體反應(yīng)的次數(shù)降低(Fig 1A、1C，P<0.01)，且在劑量上存在相關(guān)性，呈負相關(guān)(Fig 1B，r=-0.85)。而MDL11939+Vehicle組，小鼠沒有發(fā)生扭體反應(yīng)(Fig 1A)，說明MDL11939對腹腔注射Vehicle組沒有引起任何作用，MDL11939在腹腔注射乙酸后的效應(yīng)是通過5-HT2A受體介導(dǎo)的。以上結(jié)果表明，MDL11939可以劑量依賴性地降低急性乙酸內(nèi)臟痛小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)，明顯緩解疼痛。

2.2 MDL11939對急性切口痛小鼠患側(cè)TWL的影響 鑒于乙酸內(nèi)臟痛模型MDL11939腹腔給藥呈劑量依賴性地抑制疼痛，在高劑量1.0 mg·kg-1時，小鼠活動被明顯抑制，0.5 mg·kg-1就可以有效減輕疼痛，故在其他模型中選取中劑量0.5 mg·kg-1進行實驗。在切口痛組和自身切口痛造模4 h 后，TWL值降低，痛閾下降。與切口痛組和自身給藥前相比，MDL11939在給藥后1 h內(nèi)明顯提高了小鼠的熱縮足閾值(Fig 2，P<0.05，P<0.01)。以上結(jié)果表明MDL11939可以有效地減輕急性切口痛。

2.3 MDL11939對CCI慢性神經(jīng)病理性痛小鼠患側(cè)TWL的影響 術(shù)后d 3篩選出造模成功的小鼠，于d 7進行TWL測定時發(fā)現(xiàn)，CCI模型組小鼠的TWL評分相對健側(cè)明顯降低，表明痛閾下降。在MDL11939給藥后1 h內(nèi)，小鼠的熱縮足閾值明顯提高(Fig 3，P<0.05，P<0.01)，以上結(jié)果表明MDL11939可以有效地緩解CCI神經(jīng)病理性痛。

Fig 1 Dose response curves of 5-HT2Aantagonist MDL11939 on body writhing reaction of visceral pain induced by intraperitoneal administration of acetic acid in mice

A:The number of 1 h cumulative writhing reaction times; B:The dose correlation curve of MDL11939; C:The effect of different doses of MDL11939 on acetic acid pain in 1 h.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsacetic acid group

Fig 2 Effects of 5-HT2Aantagonist MDL11939 on ipsilateral TWL of acute incision pain in mice

The time-course of TWL in incision pain mice.#P<0.05,##P<0.01vsincision pain group

Fig 3 Effects of MDL11939 on ipsilateral TWL of CCI chronic neuropathic pain in mice

The time-course of TWL after intraperitoneal administration of 5-HT2Aantagonist MDL 11939 in CCI mice in 1 h.#P<0.05,##P<0.01vsCCI group

3 討論

5-HT2AR在外周存在于黏膜下神經(jīng)叢、背根神經(jīng)節(jié)、表皮真皮結(jié)合處的無髓鞘軸突等部位，高表達于初級感覺神經(jīng)元，在中樞表達于脊髓、大腦皮質(zhì)、杏仁核、海馬、室旁核等眾多腦區(qū)，參與了外周傷害性感受的外周敏化和中樞敏化過程[9]。

疼痛作為一種常見的傷害性感受，5-HT2AR在疼痛領(lǐng)域中的作用也受到越來越多的關(guān)注。本實驗通過建立急性乙酸內(nèi)臟痛、急性切口痛和CCI神經(jīng)病理性痛模型，經(jīng)腹腔系統(tǒng)性給藥，發(fā)現(xiàn)MDL11939可以有效地減輕乙酸內(nèi)臟痛小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，提高切口痛和CCI痛小鼠患側(cè)的TWL閾值。以往研究發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)CCI模型中，5-HT在損傷側(cè)神經(jīng)表達增多，在脊髓表達降低[10]；鞘內(nèi)注射5-HT2A/2C受體激動劑α甲基5-HT可以劑量依賴性地抑制熱敏痛，這種作用可被預(yù)先鞘內(nèi)注射5-HT2AR的拮抗劑Ketanserin逆轉(zhuǎn)[11]；在脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型中，5-HT2AR介導(dǎo)了神經(jīng)損傷引起的痛覺超敏和神經(jīng)病理性痛[12]。以上結(jié)果表明，在神經(jīng)損傷病理性痛模型中，5-HT及5-HT2AR在外周和脊髓的表達可能存在差異。脊髓5-HT2AR能夠降低慢性內(nèi)臟痛大鼠的痛覺敏化[13]，而本實驗中5-HT2AR介導(dǎo)了急性乙酸內(nèi)臟痛小鼠扭體反應(yīng)的增加。切口痛模型中，5-HT2AR提高了切口痛患側(cè)的疼痛下行易化作用，鞘內(nèi)注射Ketanserin可以減輕疼痛[14],本實驗中通過外周給予MDL11939也減輕了疼痛。一般認為，外周傷害性刺激發(fā)生時，腸嗜鉻細胞釋放5-HT，一方面直接激活腸神經(jīng)系統(tǒng)，另一方面通過初級感受神經(jīng)元向脊髓中樞傳遞，在腦內(nèi)整合，通過腦干下行易化或抑制系統(tǒng)，對脊髓背角5-HT不同的受體亞型進行調(diào)控發(fā)揮作用。而大量實驗研究表明5-HT2AR參與了其中各個環(huán)節(jié)的調(diào)控，腹腔系統(tǒng)性給藥，可能是通過減少外周炎性介質(zhì)降低了外周敏化[1]，也可能是影響了血液循環(huán)中炎癥介質(zhì)通過5-HT2AR介導(dǎo)的中樞敏化[15]，但具體的機制仍需要進一步研究。

綜上所述，5-HT2AR在疼痛中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，其激活、表達與疼痛刺激類型、刺激強度均存在一定的相關(guān)性，明確其在疼痛中的作用及作用機制，將為臨床的疼痛診療提供新的靶點和思路。

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Effects of intraperitoneal injection of 5-HT2Areceptor antagonist MDL11939 on acute and chronic pain in mice

HUANG Si-ting1, JI Ning-ning1, DU Lei1, ZHANG Gong-liang2, ZHANG Yong-mei1

(1.JiangsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiology,CollegeofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,XuzhouJiangsu221002,China；2.SchoolofBasicMedicalSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To investigate the effects and significance of 5-HT2Areceptor antagonist MDL11939 on acute acetic acid visceral pain, acute incision pain and chronic constriction injury (CCI) of sciatic nerve inmice. Methods Kunming male mice were suffered acute acetic acid visceral pain, acute incision pain and CCI neuropathic pain. After each animal model was established, MDL11939 was injected intraperitoneally. The writhing reaction was used to assess acute acetic acid visceral pain, while the thermal withdrawal latency (TWL) was used to evaluate the acute incision pain and CCI neuropathic pain. Results Compared with the control group, MDL11939 (0.25, 0.5, 1.0 mg·kg-1, i.p.) relieved acetic acid visceral pain significantly in a dose-dependent manner in mice, as revealed by the significant reduction of the number of twisting. In acute incision pain and CCI neuropathic pain, MDL11939 (0.5 mg·kg-1, i.p.) significantly increased TWL level. Conclusion 5-HT2Areceptor antagonist MDL11939 has analgesic effects on visceral pain, acute pain and neuropathic pain, which might be a novel therapeutic target to treat different pain in clinical situations.

5-HT2Areceptor; MDL11939; visceral pain; sciatica; incision pain; CCI

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.032.html

2016-10-15,

2016-11-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81171041，81271217)；江蘇省高校自然科學(xué)基金重點項目(No 13KJA320001)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(No BK20161171)

黃思婷(1990-)，女，碩士生，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控，E-mail:shuimudeshijie@163.com; 張詠梅(1970-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控、腦功能衰竭機制及其防治，通訊作者，E-mail:zhangym700@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.016

A

1001-1978(2017)02-0223-05

R-332；R392.11；R441.1；R916.4