鞘氨醇激酶1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制研究

杜春陽，肖 夏，王鑫貴，符 姣，馮益平，胡鳳麗，陳恩立，任韞卓

(河北醫(yī)科大學病理學教研室，河北 石家莊 050017)

鞘氨醇激酶1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制研究

杜春陽，肖 夏，王鑫貴，符 姣，馮益平，胡鳳麗，陳恩立，任韞卓

(河北醫(yī)科大學病理學教研室，河北 石家莊 050017)

目的 觀察鞘氨醇激酶1(SphK1)在單側(cè)輸尿管結(jié)扎導致的小鼠腎間質(zhì)纖維化模型中的作用及分子機制。方法 CD-1小鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、假手術(shù)加藥物干預組(Sham+PF-543)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(unilateral ureteral obstruction, UUO)和輸尿管結(jié)扎加藥物干預組(UUO+PF-543)。分別于手術(shù)后1、3、7、14 d取材，采用Western blot方法檢測SphK1、纖維化相關(guān)指標mature TGF-β1、FN和Col Ⅰ及自噬相關(guān)因子LC3、Beclin1、Atg5和Atg12的蛋白表達水平；免疫組織化學染色方法觀察SphK1、FN和ColⅠ的腎組織定位表達情況；Masson染色光鏡下觀察腎小管間質(zhì)纖維化的病變面積，電鏡下觀察腎小管細胞內(nèi)自噬體形成情況。結(jié)果 與Sham組相比，UUO組小鼠腎組織SphK1及自噬相關(guān)的蛋白表達水平明顯升高，呈現(xiàn)時間依賴性；單側(cè)輸尿管結(jié)扎導致腎小管細胞內(nèi)自噬體增多；纖維化相關(guān)因子的表達明顯升高并伴隨腎間質(zhì)纖維化的病變面積增加；與UUO組相比，PF-543干預明顯降低腎組織SphK1及自噬相關(guān)蛋白的表達，同時腎小管細胞內(nèi)自噬體形成減少；但PF-543干預導致UUO腎組織纖維化相關(guān)因子的表達進一步升高，間質(zhì)纖維化的病變進一步加重。結(jié)論 SphK1在腎間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮腎保護作用，這一作用可能主要是通過誘導自噬實現(xiàn)的。

鞘氨醇激酶1；單側(cè)輸尿管結(jié)扎；自噬；纖維化；PF-543；電鏡

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是多種病因所致的慢性腎臟疾病(chronic kidney disease, CKD)發(fā)展至終末期腎功能衰竭的重要病理基礎[1]。與腎小球硬化相比，RIF與腎功能減退關(guān)系更為密切，直接反映了腎功能受損的嚴重程度。在RIF中，腎小管上皮細胞的變性、壞死、轉(zhuǎn)分化及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的大量生成和沉積發(fā)揮了重要作用[2]。自噬(autophagy)是細胞清除受損細胞器及異常蛋白，避免發(fā)生凋亡和壞死的重要自身保護機制，可被饑餓、損傷、細胞分化及正常生長調(diào)節(jié)所誘導，在多種生理及病理條件下發(fā)揮細胞保護作用。研究顯示，自噬在包括糖尿病腎病[3]、缺血/再灌注腎損傷[4]及梗阻性腎損傷[5]中均起到了一定的調(diào)節(jié)作用。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)是細胞生物學功能的重要調(diào)控分子，能將具有促凋亡功能的鞘氨醇(sphingosine，Sph)磷酸化為具有促存活功能的鞘氨醇1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)，進而調(diào)控細胞的生長發(fā)育[6]。以往研究表明，SphK1/S1P信號通路在慢性腎臟疾病的發(fā)病及其病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。TGF-β1能誘導體外培養(yǎng)的足細胞及大鼠系膜細胞SphK1的高表達，抑制SphK1的表達后，RIF相關(guān)蛋白α-SMA、laminin 及TIMP-1的表達亦明顯減低[7]。新近有研究顯示SphK1能夠通過誘導自噬延緩肺組織纖維化，發(fā)揮保護作用[8]。目前，有關(guān)SphK1在單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導的腎組織纖維化中的作用尚不明確。本實驗旨在觀察SphK1對單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導的腎組織纖維化及自噬激活的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡♂ CD-1小鼠(25～28) g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，于SPF級飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。SphK1特異性抑制劑PF-543購自美國Selleck Chemicals公司。兔抗FN單克隆抗體及兔抗SphK1、TGF-β1(mature)、I型膠原(collagen Ⅰ, Col Ⅰ)、LC3、β-actin多克隆抗體購自美國Promega公司。兔抗Beclin1、Atg5和Atg12多克隆抗體為美國Proteintech公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)為美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組及取材 實驗動物隨機分為4組: 假手術(shù)組(Sham)、假手術(shù)加藥物干預組(Sham+PF-543)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(unilateral ureteral obstruction, UUO)和輸尿管結(jié)扎加藥物干預組(UUO+PF-543)，每組32只。UUO及UUO+PF-543組小鼠于無菌手術(shù)室行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制備腎纖維化模型。Sham及Sham+PF-543組小鼠手術(shù)中除不結(jié)扎左側(cè)輸尿管外，其余操作步驟均與模型組相同。藥物干預組于UUO模型建立當日開始腹腔注射PF-543 (1 mg·kg-1·d-1), Sham及UUO組每天腹腔注射等體積的生理鹽水，至取材前。分別于術(shù)后d 1、3、7、14處死老鼠。切取左腎, 部分置于2.5%的戊二醛中固定，進行電鏡觀察；部分腎組織置于4%多聚甲醛中固定, 進行光鏡觀察、PAS、Masson染色及免疫組織化學檢查；另留取部分腎皮質(zhì)置于液氮中保存, 進行總蛋白質(zhì)的提取及檢測。

1.2.2 Masson染色 4%多聚甲醛中固定24 h的腎組織標本經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋后，制成厚為2 μm石蠟切片。常規(guī)Masson染色。應用HPIAS-2000影像分析軟件，對Masson染色切片腎間質(zhì)中膠原染色陽性部分進行計算機的輔助分析，結(jié)果以腎間質(zhì)纖維化面積的百分比來表示。

1.2.3 免疫組織化學染色檢測腎組織SphK1、FN和ColⅠ的表達 2 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，隨后用胃蛋白酶(1 g·L-1)進行抗原修復，37℃，10 min。一抗分別為抗SphK1(1 ∶200)、抗FN(1 ∶200)和抗Col Ⅰ(1 ∶100)，4℃冰箱過夜。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌后滴加二抗(山羊抗兔IgG,1 ∶200)。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑顯色后，蘇木精復染、常規(guī)脫水、透明、封片。Image Pro Plus 6.0軟件分析切片中陽性染色面積，結(jié)果以陽性面積百分比表示。

1.2.4 透射電鏡下觀察自噬體 將各組小鼠腎皮質(zhì)切取約1 mm3大小的組織塊，立即浸入預冷的2.5%戊二醛中固定。固定完成后，按電鏡超薄切片常規(guī)處理步驟進行脫水、包埋、固化及切片，乙酸雙氧鈾染色，枸櫞酸鉛復染，Hitachi H7500透射電鏡觀察腎小管上皮細胞的結(jié)構(gòu)變化，計數(shù)每10個同等放大倍數(shù)電鏡視野下腎小管上皮細胞內(nèi)自噬體數(shù)量。

1.2.5 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達水平 各組取等量腎組織(100 mg)放入EP管中，加入預冷的組織蛋白裂解液1 mL，研磨，冰上靜置裂解30 min后，4℃、12 000 r·min-1離心20 min。Lowry法測定各管上清液中蛋白質(zhì)濃度。取裂解蛋白50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入SphK1、mature TGF-β1、FN、Col Ⅰ、LC3、Beclin1、Atg5和Atg12抗體，4℃冰箱過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(1 ∶5 000稀釋)，37℃孵育1.5 h；洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X光片暗盒，壓片，顯影，定影。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對Western條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SphK1在UUO模型腎組織不同時間點的表達情況 Western印跡結(jié)果顯示，SphK1在對照sham組有基礎量的表達，UUO組其表達明顯增多，呈明顯時間依賴性(Fig 1)。

Fig 1 Expression of SphK1 detected by Western blot in sham or UUO group(n=8)

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.2 自噬相關(guān)基因在UUO模型腎組織不同時間點的表達情況 Western印跡結(jié)果顯示，與對照sham組相比，輸尿管梗阻1 d后即出現(xiàn)自噬相關(guān)基因Beclin1及Atg5的表達增高，3 d和7 d表達迅速增加，14 d逐漸降低至基礎水平；LC3-Ⅱ及Atg12在輸尿管梗阻3 d表達增高，7 d達到高峰(P<0.01, Fig 2)。

2.3 PF-543對各組腎組織SphK1表達的影響 SphK1的蛋白表達在UUO組(梗阻腎)1 d開始升高，且隨著梗阻時間延長進行性增高，14 d達到最高；而UUO+PF-543組SphK1的蛋白表達水平較UUO組同期明顯下降(P<0.01, Fig 3A)。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，SphK1主要表達于UUO小鼠腎小管上皮細胞的胞質(zhì)，明顯高于對照sham組；PF-543明顯降低了SphK1的表達(Fig 3B)。

Fig 2 Expression of LC3,Beclin1,Atg5 and Atg12 detected by Western blot in sham or UUO group(n=8)

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.4 PF-543對各組腎組織自噬體形成及自噬相關(guān)蛋白表達的影響 與假手術(shù)sham組相比，UUO組自噬相關(guān)蛋白在輸尿管梗阻后7 d表達明顯增高；PF-543干預抑制了輸尿管梗阻誘導的自噬相關(guān)蛋白的高表達(P<0.05, Fig 4A)；sham+PF-543組與sham組之間表達無差異。透射電鏡下觀察各組小鼠腎組織，與假手術(shù)sham組相比，UUO組小鼠腎組織中自噬體明顯增多，UUO+PF-543組自噬體數(shù)量較UUO組減少(Fig 4B)。

Fig 3 Expression of SphK1 in UUO

##P<0.01vsUUO group

2.5 PF-543對各組腎組織間質(zhì)纖維化的影響 與假手術(shù)sham組相比，輸尿管梗阻7 d腎組織纖維化相關(guān)指標mature TGF-β1、FN及Col Ⅰ的蛋白表達明顯升高，PF-543干預后其表達反而進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01, Fig 5A)。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，UUO組FN及Col Ⅰ的表達增強，Col Ⅰ主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì)，而FN主要表達于腎間質(zhì)；PF-543干預后FN及Col Ⅰ的表達進一步增強(Fig 5B、5C)。Masson染色結(jié)果顯示，UUO組術(shù)后7 d小管間質(zhì)病變面積較假手術(shù)sham組明顯增加；PF-543干預后小管間質(zhì)的病變較UUO組進一步加重(Fig 6)。

Fig 4 Effect of PF-543 on activation of autophagy in UUO mice analyzed by Western blot(A) and transmission electron microscope(B)(n=8)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsUUO group

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化，無論源自炎癥、代謝、免疫或者機械性梗阻，都將不可逆性地進展至終末期腎功能衰竭[9]。因此，由慢性腎小管間質(zhì)損傷導致的腎間質(zhì)纖維化已經(jīng)成為幾乎所有腎臟疾病共同的最終結(jié)局。在腎臟纖維化過程中，腎間質(zhì)炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化、TGF-β表達上調(diào)，以及ECM過度沉積均對腎間質(zhì)纖維化的進展發(fā)揮了不可替代的作用[10]。本研究中Masson染色結(jié)果顯示，UUO組腎間質(zhì)纖維化面積增加，Western blot及免疫組織化學染色顯示ECM的重要組成成分FN及ColⅠ的蛋白表達明顯升高。與此同時，腎組織內(nèi)mature TGF-β1的蛋白表達也明顯增強。

越來越多的研究證實，SphK1在體內(nèi)多個器官的纖維化性疾病進展中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括肺臟、心臟、肝臟及腎臟。研究顯示，SphK1和纖連蛋白FN在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中高表達，抑制劑抑制SphK1的表達后，F(xiàn)N的表達也隨之降低，呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性[11]。TGF-β1是組織纖維化中最關(guān)鍵的促纖維化生長因子。體外培養(yǎng)的足細胞中，TGF-β1刺激上調(diào)了SphK1的表達，應用siRNA敲低SphK1的表達后，TGF-β1誘導的FN的高表達也受到明顯的抑制，提示SphK1在腎細胞纖維化中發(fā)揮了典型的促纖維化作用[12]。有趣的是，在對SphK1基因敲除鼠誘導腎間質(zhì)纖維化的模型研究中，卻發(fā)現(xiàn)了完全相反的結(jié)果。與野生型小鼠相比，SphK1基因敲除鼠的腎間質(zhì)纖維化的病變更嚴重，纖維化調(diào)控因子CTGF的表達明顯升高[13]。在缺血/再灌注導致的急性腎損傷模型中，SphK1通過激活S1P受體1，減輕了腎組織的損傷，發(fā)揮腎臟保護作用[4]。本研究結(jié)果顯示，在UUO梗阻小鼠腎臟中，SphK1的表達明顯增加，呈現(xiàn)時間依賴性；PF-543能夠抑制SphK1的表達，同時與UUO組相比，mature TGF-β1、FN及Col Ⅰ的表達水平反而增加了，間質(zhì)纖維化程度也明顯加重。這一結(jié)果與SphK1基因敲除鼠的研究結(jié)果相一致，提示SphK1在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)揮了抗纖維化的保護作用。

Fig 5 Effect of PF-543 on expression of mature TGF-β1,FN and Col Ⅰin UUO mice (n=8)

A: Results of Western bolt; B: Immunohistochemical staining of Col I; C: Immunohistochemical staining of FN.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05vsUUO group

Fig 6 Effect of PF-543 on deposition of collagen in UUO mice detected by Masson staining

自噬是細胞內(nèi)高度保守的維持細胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的一種重要的細胞內(nèi)降解機制，其通過雙層膜包裹大分子蛋白和受損或衰老的細胞器而形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并在其中完成降解過程。自噬對細胞的作用具有兩面性，在低水平損傷時，細胞自噬被激活，并通過降解清除受損細胞器的過程起到了初步嘗試重建細胞穩(wěn)態(tài)的作用；若細胞損傷的嚴重程度超過了自噬可承受的范圍時，就導致了程序性的細胞死亡，稱之為II類程序性細胞死亡[14]。近年來，自噬在腎臟疾病中的作用被廣泛關(guān)注。糖尿病腎病中，足細胞自噬缺陷是導致患者出現(xiàn)蛋白尿和腎小球硬化的重要激發(fā)靶點[15]。在嘌呤霉素氨基核苷(PAN)腎病模型中，自噬激活標志蛋白LC3的表達在早期明顯下降，而在恢復期明顯加強[16]。脂聯(lián)素通過AMPK信號通路激活內(nèi)皮細胞自噬，進而抑制醛固酮誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，延緩了高血壓性腎組織纖維化進程[17]。在UUO小鼠模型中，Li等[18]發(fā)現(xiàn)梗阻后7 d，腎組織內(nèi)的自噬體形成明顯增加，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1也明顯高表達，腎組織內(nèi)近端小管損傷加重，上皮細胞凋亡率明顯增加。在本研究中，輸尿管梗阻早期即出現(xiàn)自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5及Atg12的表達增高，7 d達到頂峰，14 d逐漸降低至基礎水平。電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，輸尿管梗阻7 d時腎組織內(nèi)自噬體數(shù)量較對照組明顯增加，與前述結(jié)果相一致。

新近研究發(fā)現(xiàn)，SphK1能夠通過誘導自噬參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細胞中，SphK1激活細胞自噬，促進腫瘤細胞的生長[19]。饑餓狀態(tài)下，SphK1激活自噬，抑制了MCF-7細胞的死亡，保證了細胞存活[20]。TGF-β1誘導的肺纖維化模型中，SphK1通過誘導自噬延緩了肺組織纖維化的進程[8]。因此，我們進一步觀察了SphK1與自噬之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，PF-543能夠抑制UUO梗阻小鼠腎組織自噬的激活，減少自噬體的形成及自噬相關(guān)基因的表達，提示SphK1可能通過誘導自噬在腎組織纖維化中發(fā)揮保護作用。意外的是，我們發(fā)現(xiàn)SphK1的表達與腎組織自噬的激活并不呈現(xiàn)平行關(guān)系，這可能與UUO 14 d腎組織細胞損傷嚴重，超出了自噬的可承受范圍，出現(xiàn)了細胞的死亡密切相關(guān)。

綜上所述，在輸尿管梗阻導致的腎組織纖維化中，SphK1的表達增高可能是一種適應性的增高，進而通過激活自噬發(fā)揮對腎組織的保護作用。

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Role of SphK1 in renal tubulointerstitial fibrosis and its mechanism

DU Chun-yang,XIAO Xia,WANG Xin-gui, FU Jiao，F(xiàn)ENG Yi-ping,HU Feng-li，CHEN En-li, REN Yun-zhuo

(DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017，China)

Aim To investigate the effect of sphingosine kinase 1(SphK1) on unilateral ureteral obstruction(UUO)-induced tubulointerstitial fibrosis and explore the possible mechanism.Methods The CD-1 mice were randomly divided into four groups: sham-operation group(Sham), PF-543 treatment control group(Sham+PF-543), model group(UUO) and PF-543 treatment group(UUO+PF-543). On 1,3,7 and 14 d after operation, eight mice were selected randomly from each group and sacrificed. The protein expressions of SphK1,mature TGF-β1,FN,ColⅠ,LC3,Beclin1,Atg5 and Atg12 were observed by Western blot. The histological changes were examined by Masson′s trichrome stain. Immunhistochemistry was performed to measure the levels of expression of SphK1,FN and ColⅠ. Transmission electron microscope was used to observe the autophagic body.Results SphK1 expression and autophagy were both upregulated in a mouse model of kidney fibrosis induced by UUO. Meanwhile, increased mature TGF-β1 and deposition of extracellular matrix(ECM) were observed in tubulointerstitial areas compared with sham-operated mice. After intraperitoneal injection with the SphK1 specific inhibitor PF-543 in UUO mice, enhanced expression of SphK1 and activated autophagy were significantly abrogated. However, aggravation of renal fibrosis was detected when SphK1 inhibitor PF-543 was applied to suppress SphK1 expression in UUO mice.Conclusion SphK1 activation is renoprotective through the induction of autophagy in the pathogenesis of kidney fibrosis.

sphingosine kinase 1；unilateral ureteral obstruction；autophagy；fibrosis；PF-543；transmission electron microscope

2016-10-08，

2016-11-18

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.028.html

河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃(No 20150628); 河北醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新實驗項目資助課題

杜春陽 (1980-)，女，博士，講師,研究方向：腎臟病理學,E-mail: duchunyang55@163.com； 任韞卓(1978-)，女，博士，教授,研究方向：腎臟病理學,通訊作者，E-mail: renyunzhuo1978@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.014

A

1001-1978(2017)02-0212-07

R-332；R329.24；R345.57；R692.320.22