布比卡因對人肺上皮細胞短路電流影響的研究

崔 湧，姜學東，于 同，丁 炎，聶宏光

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110001；2. 武警遼寧省總隊醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110034；3.中國醫(yī)科大學代謝病分子機制與藥物研究所，遼寧 沈陽 110122)

布比卡因對人肺上皮細胞短路電流影響的研究

崔 湧1，姜學東2，于 同3，丁 炎3，聶宏光3

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110001；2. 武警遼寧省總隊醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110034；3.中國醫(yī)科大學代謝病分子機制與藥物研究所，遼寧 沈陽 110122)

目的 布比卡因是長效酰胺類局麻藥，本研究旨在觀察布比卡因對人肺上皮細胞短路電流的影響，并探討可能的機制。方法 應用尤斯灌流室裝置測定H441單層細胞的短路電流。由總電流減去阿米洛利抑制后的電流算得阿米洛利敏感性電流，以用藥前H441單層細胞的阿米洛利敏感性電流初始值為100%對照。用100 μmol·L-1布比卡因處理H441細胞，在0、15、30、60 min 4個時間點提取蛋白用于Western blot，研究布比卡因對ERK1/2蛋白磷酸化的影響。結果 布比卡因能夠劑量依賴性抑制H441單層細胞的短路電流，此電流可被阿米洛利抑制；Western blot結果顯示，布比卡因能夠促進ERK1/2蛋白磷酸化。結論 布比卡因通過抑制人肺上皮細胞阿米洛利敏感性電流而降低肺泡上皮離子轉運，其機制可能與其促進ERK1/2蛋白磷酸化有關。臨床上對伴有肺部疾患的病人應用布比卡因時應考慮其可能對肺泡上皮液體清除的影響。

布比卡因；短路電流；上皮鈉通道；蛋白磷酸化；肺水腫；肺泡液體清除率

肺泡液體清除率(alveolar fluid clearance，AFC)對肺臟生理和病理狀態(tài)下的液體平衡，如肺水腫、急性肺損傷和成人呼吸窘迫癥，均起重要的調控作用。增加AFC能加速肺水腫的恢復，改善肺泡上皮的氣體交換。相反，減少AFC能降低急性肺損傷和成人呼吸窘迫癥病人的生存率，誘發(fā)肺水腫的發(fā)生[1-3]。布比卡因是長效酰胺類局麻藥，可用于局部浸潤麻醉、外周神經(jīng)阻滯、硬脊膜外阻滯和蛛網(wǎng)膜下腔阻滯。最近的臨床報道表明，布比卡因頸叢麻醉及布比卡因過敏均可致急性肺水腫[4-6]，但具體機制尚不清楚。由于鈉離子的轉運是肺泡液體清除的重要驅動力，肺泡上皮細胞頂側膜的上皮鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)是影響AFC的主要決定因素[3]，我們推測布比卡因可能通過影響位于細胞頂膜側的阿米洛利敏感性ENaC而影響肺臟液體清除。本研究旨在探討布比卡因與阿米洛利敏感性電流之間的關系，明確布比卡因是否對肺泡上皮Na+轉運有抑制作用及其相應的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人NCI-H441(H441)細胞株購自ATCC公司，用添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基(ATCC)進行培養(yǎng)。阿米洛利及布比卡因購于美國Sigma公司。

1.2 H441細胞株培養(yǎng) 取H441細胞株接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、含有5% CO2和95% O2的濕化氣體中孵育生長。將細胞以約5×106/cm2的密度種于Transwell小室(Corning)中，隔天換液1次，培養(yǎng)7～10 d，使跨間皮阻抗達 500 MΩ以上。

1.3 H441細胞株單層細胞短路電流檢測及布比卡因的干預 按相關文獻方法記錄H441單層細胞短路電流[7]。將H441單層細胞置于兩側灌以生理鹽溶液(mmol·L-1：117 NaCl、25 NaHCO3、4.7 KCl、1.2 MgSO4、1.2 KH2PO4、2.5 CaCl2、11 D-glucose；pH 7.3～7.4)的尤斯灌流室(Physiologic Instruments)中，滲透壓在290～300 mOsm。單層細胞兩側持續(xù)充以95% O2和5% CO2混合氣體，所用溶液新鮮配制，預熱至37 ℃?？缟掀ざ搪冯娏鞑捎贸湟? mol·L-1KCl、4%瓊脂糖鹽橋的Ag-AgCl電極測定。H441單層細胞短路至0 mV，每10 s給予10 mV脈沖刺激1次，每次1 s，監(jiān)測跨上皮阻抗和短路電流。短路電流和阻抗達到平穩(wěn)時，加入1 μmol·L-1～10 mmol·L-1布比卡因及上皮鈉通道特異性抑制劑阿米洛利于H441單層細胞的頂膜側，持續(xù)記錄短路電流和阻抗，直至達到新的平衡。由總電流減去阿米洛利抑制后的電流算得阿米洛利敏感性電流，以用藥前H441單層細胞的阿米洛利敏感性電流初始值為100%對照。

1.4 ERK1/2蛋白磷酸化 H441細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。用100 μmol·L-1布比卡因處理H441細胞，在0、15、30、60 min 4個時間點，提取蛋白后，應用10%凝膠進行SDS-PAGE分析。 在TBST溶解的5%無脂肪凍干奶粉溶液中孵育1 h后，加入一抗，4 ℃過夜。二抗室溫孵育60 min。每次抗體反應后，用緩沖液TBST沖洗3次，每次15 min。本實驗所用抗體購自Cell Signaling公司，應用ECL 試劑盒(Thermo，SuperSignal)分析圖像。所用抗體的稀釋濃度為1 ∶1 000，研究布比卡因對ERK1/2蛋白磷酸化的影響。

2 結果

2.1 布比卡因對H441單層細胞短路電流的影響 用不同濃度布比卡因刺激H441細胞單層，并于尤斯灌流室系統(tǒng)上測定其短路電流的變化。如Fig 1A所示，1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1、1 mmol·L-1、10 mmol·L-1布比卡因能夠劑量依賴性抑制人H441單層細胞的短路電流，此電流可被100 μmol·L-1上皮鈉通道特異性抑制劑阿米洛利明顯抑制。

2.2 不同濃度布比卡因對H441單層細胞阿米洛利敏感性電流的影響 由總電流減去阿米洛利抑制后的電流算得阿米洛利敏感性電流，以用藥前H441單層細胞的阿米洛利敏感性電流初始值為100%對照。如Fig 1B所示，布比卡因降低阿米洛利敏感性電流的作用隨藥物濃度增加而增強，其半數(shù)抑制濃度為98.1 μmol·L-1。由此我們推測，布比卡因能夠通過降低阿米洛利敏感性電流而抑制ENaC的功能。

Fig 1 Effects of different concentrations of bupivacaine on amiloride-sensitive currents in H441 monolayers

A: Representative short-circuit current (Isc) trace showed application of a series of concentrations of bupivacaine from 1 μmol· L-1to 10 mmol·L-1; B: Normalized amiloride-sensitive currents at each concentration were plotted as a dose-response curve (n=8). The raw data were calculated by fitting with the Boltzmann equation. The IC50value was 98.1 μmol·L-1

2.3 布比卡因對ERK傳導通路蛋白磷酸化的影響 為了進一步檢測布比卡因對ENaC功能影響的分子機制，基于蛋白的磷酸化是許多毒性物質引發(fā)的最常見的翻譯后修飾現(xiàn)象，以及細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)與ENaC的密切關系，我們接下來檢測了布比卡因改變2種ERK蛋白(ERK1/2)的磷酸化和去磷酸化之間平衡的可行性。用100 μmol·L-1布比卡因處理H441細胞，分別于0、15、30、60 min 4個時間點提取蛋白進行磷酸化分析。如Fig 2顯示，隨著藥物處理時間延長，布比卡因能夠促進ERK傳導通路蛋白磷酸化。Fig 3總結了不同時間點布比卡因對ERK傳導通路蛋白磷酸化的影響，可見布比卡因能夠在短時間內增強ERK1/2的蛋白磷酸化水平。以用藥前蛋白磷酸化水平為100%，15、30、60 min時間點ERK1/2的蛋白磷酸化水平與對照組相比均有明顯差異(P<0.05)。

Fig 2 Effects of bupivacaine on ERK1/2 phosphorylation

Fig 3 Bupivacaine affects ERK1/2 phosphorylation

*P<0.05vscontrol

3 討論

局部麻醉藥在圍術期的應用非常廣泛，因此探討其對肺功能的影響對于指導臨床用藥具有重要意義。肺泡Ⅱ型上皮細胞除分泌表面活性物質外，還參與鈉的主動運輸。鈉通過肺泡表面的ENaC(因其對阿米洛利敏感，又稱為阿米洛利敏感性鈉通道)進入細胞內，再由位于基底膜的Na+-K+-ATP酶將其泵入肺間質，同時伴隨著水的被動轉運，一旦水被轉運至肺間質，就形成向肺門的壓力梯度，通過淋巴管將水清除出肺。這一過程維持肺泡腔處于相對“干燥”狀態(tài)，利于氣體交換。因此，肺泡上皮Na+的主動轉運及Na+-K+-ATP酶的活性對于調節(jié)肺泡內的液體平衡，防止肺水腫的發(fā)生具有重要作用[8]。布比卡因是臨床最常用的局麻藥之一，與其他局麻藥相比，布比卡因的治療濃度與毒性濃度之間的濃度差較小，臨床應用時易發(fā)生毒性反應。誤入靜脈或從用藥局部吸收過多是布比卡因誘發(fā)毒性反應的主要原因[9]。最近的臨床報道表明，布比卡因頸叢麻醉及布比卡因過敏均可致急性肺水腫[4-6]，但具體機制尚不清楚。已有證據(jù)表明，在體情況下通過肺泡上皮的Na+主動轉運途徑在新生兒肺泡液體重吸收以及維持成年肺臟的肺泡腔干燥狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用。在人類，肺泡上皮通過主動轉運Na+來清除多余水分的能力與肺水腫患者的存活率呈正相關[10]。我們推測，布比卡因可能通過抑制ENaC而降低AFC。

H441細胞是人肺腺癌細胞，為研究ENaC功能活性的經(jīng)典細胞。本實驗運用尤斯灌流室系統(tǒng)，測定H441細胞單層的阿米洛利敏感性鈉電流。通過給藥前后電流的變化來確定布比卡因對ENaC功能的影響。本研究結果顯示，布比卡因能夠劑量依賴性抑制H441單層細胞的短路電流，此電流可被阿米洛利抑制。提示布比卡因可能通過抑制肺泡上皮Na+轉運而降低肺臟液體清除，其機制可能與抑制阿米洛利敏感性上皮鈉通道有關。

同時，本實驗進一步研究了布比卡因對ERK傳導通路蛋白磷酸化的影響。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一。絲裂原活化蛋白激酶是一組能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，調節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程。ERK包括ERK1和ERK2，是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵因子，磷酸化激活的ERK1/2由胞質轉位到核內，進而介導并參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的惡變等多種生物學反應。有文獻研究表明，ERK1/2與ENaC關系密切[11-12]，轉化生長因子-β1通過ERK1/2通路減少頂膜α-ENaC mRNA的表達[13]。本實驗Western blot結果顯示，布比卡因能夠促進ERK1/2蛋白磷酸化。以上研究結果表明，布比卡因可能通過激活ERK1/2磷酸化來抑制肺泡ENaC的功能，降低與上皮鈉通道有關的阿米洛利敏感性鈉電流，阻礙Na+的重吸收。其他諸如布比卡因通過抑制心肌細胞鈉通道導致心肌抑制而參與肺水腫發(fā)生的因素，還需進一步研究。

(致謝: 本研究的所有工作均在中國醫(yī)科大學的代謝病分子機制與藥物研究所進行。)

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Effects of bupivacaine on short-circuit currents in human alveolar epithelial cells

CUI Yong1,JIANG Xue-dong2,YU Tong3,DING Yan3,NIE Hong-guang3

(1.DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China; 2.DeptofThoracicSurgery,LiaoningProvincialGeneralHospitalofArmedPoliceForce,Shenyang110034,China; 3.InstituteofMetabolicDiseaseResearchandDrugDevelopment,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

Aim Bupivacaine is a kind of long-acting amide local anesthetics. This paper aims to explore the effects of bupivacaine on the short-circuit currents in human alveolar epithelial monolayers and study the possible mechanisms.Methods Short-circuit currents were recorded by ussing-chamber setup. Amiloride-sensitive currents were defined as the difference between the total current and the amiloride-resistant current. ERK1/2 phosphorylation protein levels were analyzed by Western blot at 0, 15, 30 and 60 min after administration of 100 μmol·L-1bupivacaine.Results Bupivacaine could inhibit the short-circuit currents in H441 monolayers dose-dependently, which could be inhibited by amiloride. Western blot analysis showed that bupivacaine increased the level of ERK1/2 phosphorylation.Conclusion These data demonstrate that bupivacaine can reduce the alveolar ion transport by inhibiting the amiloride-sensitive currents, possibly by the enhancement of ERK1/2 phosphorylation. The effects of alveolar fluid clearance following application of bupivacaine should be considered clinically when the patient is complicated with lung injury.

bupivacaine; short-circuit currents; epithelial sodium channel; protein phosphorylation; pulmonary edema; alveolar fluid clearance

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.022.html

2016-11-13,

2016-12-15

國家自然科學基金資助項目(No 81270098)；遼寧省自然科學基金資助項目(No 2014021093)

崔 湧(1972-)，男， 博士，副教授，研究方向：圍手術期肺臟保護，E-mail：cynhg@sina.com; 聶宏光(1973-)，女，博士，教授，研究方向：肺上皮離子轉運，通訊作者，E-mail：hgnie@cmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.011

A

1001-1978(2017)02-0197-04

R322.35；R329.24；R541.63；R971.2