復(fù)方總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

祝曉慶，楊 潔，邵 娟，劉 超，吳基良

(湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 咸寧 437100)

復(fù)方總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

祝曉慶，楊 潔，邵 娟，劉 超，吳基良

(湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 咸寧 437100)

目的 探討復(fù)方總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的保護(hù)作用。方法 15只7周齡的♂C57BL/6小鼠普通飲食為正常對照組；75只7周齡的♂ ApoE基因敲除小鼠高脂飲食，隨機(jī)分為5組：模型組、辛伐他汀組、低劑量復(fù)方總黃酮組、中劑量復(fù)方總黃酮組、大劑量復(fù)方總黃酮組。灌胃16周造模完成后，采集血清，分離胸主動脈。HE染色檢查胸主動脈斑塊，檢測血脂4項(xiàng)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)和血清SOD；ELISA檢測IL-1β、NF-κB值。結(jié)果 模型組胸主動脈斑塊明顯，復(fù)方總黃酮組斑塊均不同程度變小。復(fù)方

ApoE基因敲除小鼠；動脈粥樣硬化；復(fù)方總黃酮；脂質(zhì)代謝；斑塊；炎癥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，膽固醇在動脈壁的積累促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成，血管壁的增厚與狹窄，隨后導(dǎo)致心腦血管疾病[1]，AS作為心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因[2]，成為人類健康的頭號殺手，給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。隨著生活水平的提高和人口老年化的日益嚴(yán)重，AS的發(fā)病率越來越高，其防治也越來越引起了人們的重視。

生物總黃酮是一大類黃酮類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多植物的有效成分，常見于人們的日常飲食中[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，高黃酮的攝入對AS有較好的預(yù)防和治療作用[4-5]。本文中的復(fù)方總黃酮由本實(shí)驗(yàn)室自行提制，主要成分是陳皮、山楂和葛花等，前期實(shí)驗(yàn)已證明其有非常好的抗氧化作用[6]。本文擬通過ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠高脂飲食建立AS模型，探討復(fù)方總黃酮對其的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為AS尋求有效的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 7周齡♂ C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號: SCXK(鄂)2014-0004；7周齡♂ ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004，合格證號：11401300032681，適應(yīng)性喂養(yǎng)(SPF級)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 高脂飼料、藥品、試劑 高脂飼料購于北京華阜康生物科技有限公司；復(fù)方總黃酮(主要成分陳皮、山楂和葛花等，由本實(shí)驗(yàn)室自行提煉，浸膏中總黃酮的含量為870 mg·g-1)；辛伐他汀(東京化成工業(yè)株式會社)；甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，均購于南京建成生物研究所；小鼠白介素-1 beta(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠核因子κB(NF-κB)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購于伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)，血糖儀(羅氏)，多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，電子分析天平(德國Sartorius公司) ，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)小鼠共分為6組。75只7周齡的♂ ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成5組，每組15只：分別為模型組(M組)、辛伐他汀組(S組)、復(fù)方總黃酮低、中、高組(FL、FM、FH組)，均高脂飲食。S組每日5 mg·kg-1辛伐他汀灌胃；FL、FM、FH組每日分別給予200、400、800 mg·kg-1復(fù)方總黃酮灌胃，M組每日灌胃等體積生理鹽水。15只7周齡的C57BL/6小鼠為正常對照組(C組)，普通飲食，每日灌胃等量生理鹽水。連續(xù)飼養(yǎng)給藥16周，所有動物均飼養(yǎng)在SPF級動物房。

1.2.2 指標(biāo)檢測

1.2.2.1 體質(zhì)量監(jiān)測和血糖檢測 每周一8點(diǎn)定時稱量記錄小鼠體質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)第16周剪斷小鼠尾巴尖端，從尾根擠壓到尾稍取血，血糖測定儀檢測血糖。

1.2.2.2 生化測定 小鼠眼球取血處死，全血直接取在1.5 mL EP管中，靜置2 h，3 000 r·min-1，4℃離心15 min后取上清液，采用ELISA試劑盒測定IL-1β、NF-κB值。生化試劑盒測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD值。

1.2.2.3 病理形態(tài)學(xué)檢查 取出胸主動脈，固定于4%的多聚甲醛中24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察胸主動脈形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方總黃酮對小鼠體質(zhì)量和血糖的影響 小鼠體質(zhì)量均穩(wěn)步增長，M組小鼠體質(zhì)量增加幅度最大，給藥組小鼠體質(zhì)量增長幅度均小于模型組，但大于C組(Fig 1A)。M組血糖較C組升高，且差異有顯著性(P<0.01)，給藥組較M組均有降低，F(xiàn)M組降低差異有顯著性(P<0.05)(Fig 1B)。

Fig 1 Effect of different treatment on body weight(A) and blood glucose(B) in mice

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsmodel

2.2 復(fù)方總黃酮對胸主動脈形態(tài)的影響 C組胸主動脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密有序。內(nèi)膜、中膜、外膜均未見泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積；M組血管內(nèi)膜有大片斑塊形成，泡沫細(xì)胞堆積、部分破裂，動脈粥樣硬化病灶明顯；各給藥組較M組胸主動脈內(nèi)膜斑塊明顯變小，F(xiàn)H組小鼠胸主動脈較FL、FM組小鼠胸主動脈病變輕，血管內(nèi)壁有少量泡沫細(xì)胞聚集，斑塊較小(Fig 2)。

Fig 2 Histopathology of thoracic aorta in different groups(HE staining×200)

A:Control；B:Model；C:Simvastatin；D:Low compound flavonoids；E:Middle compound flavonoids；F:High compound flavonoids

2.3 生化指標(biāo)

2.3.1 復(fù)方總黃酮對血脂的影響 M組的TC 、TG、LDL-C較C組均明顯升高，HDL-C較C組明顯降低，且差異有顯著性(P<0.01)；給藥組的TC、TG、LDL-C較M組均明顯降低，HDL-C與M組比較明顯升高，且復(fù)方總黃酮中劑量、大劑量組與M組相比差異均有顯著性(P<0.05)(Fig 3)。

2.3.2 復(fù)方總黃酮對SOD的影響 M組的SOD值較C組明顯降低，且差異有顯著性(P<0.01)。給藥組的SOD值均有升高，F(xiàn)M、FH組與M組相比差異有顯著性(P<0.05)(Fig 4)。

2.3.3 復(fù)方總黃酮對IL-1β、NF-κB的影響 M組的IL-1β、NF-κB值較C組均明顯升高，且差異有顯著性(P<0.01)，給藥組均有所降低，F(xiàn)M、FH組降低與M組相比差異有顯著性(P<0.05)(Fig 5)。

3 討論

AS是膽固醇和脂質(zhì)積累在血管內(nèi)壁的一種慢性血管性炎性病變，其特征是血管內(nèi)壁有脂質(zhì)斑塊，管腔內(nèi)變窄和變硬。AS發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，大量研究顯示，異常的脂質(zhì)代謝和慢性炎癥在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7-8]。

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 4 Effect of different treatment

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 5 Effect of different treatment on serum

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

他汀類藥物是心血管疾病一級預(yù)防和二級預(yù)防的基石，但其并不能解決所有的血脂異常相關(guān)問題，且長期使用會導(dǎo)致多種副作用，如肝損傷、肌肉毒性等[9-10]。因此，我們在充分重視他汀類藥物核心地位的同時，也在試圖尋求新的藥物，植物來源的黃酮類化合物備受關(guān)注。已知黃酮類化合物是一類大自然中廣泛存在的多分子天然化合物，為植物體多酚類的代謝物，已報道了10 000多個結(jié)構(gòu)物[11]。本研究以ApoE-/-♂ 小鼠高脂飲食復(fù)制AS模型，給予復(fù)方總黃酮治療，目的在于探究復(fù)方總黃酮對AS小鼠的早期干預(yù)作用。16周后，黃酮組斑塊明顯減小，血清中血脂和炎癥因子水平明顯下降，抗氧化水平明顯增強(qiáng)。

一些研究表明，黃酮類化合物包括淫羊藿苷[12]、山柰酚[13]等能有效降低AS動物模型體內(nèi)的血脂水平，在本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方總黃酮也能較好改善血脂代謝異常,與已知文獻(xiàn)一致。IL-1β是致AS的重要炎性細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)研究顯示，缺乏IL-1β或IL-1受體的小鼠頸動脈內(nèi)膜增生減輕；相反，IL-1受體拮抗劑缺乏的小鼠易發(fā)生AS[14]。人IL-1β的單克隆抗體Canakinumab，能選擇性中和IL-1β，降低IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生抗AS作用[15]。NF-κB是“Rel”家族中一個重要轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB參與炎癥反應(yīng)中的多種信號通路，對AS的發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用[16]。在Leyva-Lopez等[17]研究中表明，黃酮類化合物能調(diào)節(jié)免疫功能，減少炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、NF-κB,可治療炎癥相關(guān)疾病。超氧化物歧化酶(SOD)是目前研究最多的一種自由基清除劑，對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活性與血管功能有著密切關(guān)系[18]。在我們的研究中，復(fù)方總黃酮組的SOD明顯升高，IL-1β、NF-κB明顯下降，說明復(fù)方總黃酮較好地提高了機(jī)體的抗氧化能力，其抗炎效應(yīng)也與已知文獻(xiàn)報道相一致。

綜上所述，復(fù)方總黃酮可能通過調(diào)節(jié)血脂紊亂，抑制炎癥反應(yīng)來減緩小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)程，我們的研究可能為AS 的藥物治療提供新思路。

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Effect of compound flavonoids on atherosclerosis in ApoE-/-mice

ZHU Xiao-qing, YANG Jie, SHAO Juan, LIU Chao, WU Ji-liang

(HubeiKeyLaboratoryofCardiovascular,CerebrovascularandMetabolicDiseases,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Aim To investigate the protective effect of compound total flavonoids on atherosclerosis in ApoE-/-knockout mice.Methods Seven-week old C57BL/6 mice considered of the normal group(n=15);seven-week old ApoE-/-mice were fed with high-fat diet and were assigned randomly into 5 groups: model group, simvastatin group, the low compound flavonoids group, the middle compound flavonoids group and the high compound flavonoids group. After 16 weeks, mice serum and aortas were harvested. The formation of atherosclerotic plaque was analyzed by HE staining, The serum level of lipids profiles and superoxide dismutase(SOD)were deterrnined. The levels of IL-1β and NF-κB in serum were detected by ELISA assay.Results Area of atherosclerotic lesion was significantly less in the compound flavones group than in model. The level of TC，TG，LDL-C，IL-1β，NF-κB in serum of the compound flavonoids group were decreased significantly, while SOD and HDL-C increased significantly compared with the model group, and the difference was significant(P<0.05).Conclusion The compound flavonoids have a good protective effect on early atherosclerosis in mice, which may be due to its alleviating effects on hyperlipidemia and inflammation and oxidation.

ApoE knockout mice; atherosclerosis; compound flavonoids; lipid metabolism; plaque; inflammation

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.016.html

2016-10-11，

2016-11-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81270355)

祝曉慶(1983-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:179503030@qq.com; 吳基良(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)、臨床藥學(xué)，通訊作者，E-mail:xywjl@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.008

A

1001-1978(2017)02-0180-05

R-332；R284.1；R344；R364.5；R543.501

總黃酮組的TC、TG、LDL-C、IL-1β、NF-κB明顯降低，HDL-C、SOD含量明顯升高，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 復(fù)方總黃酮對小鼠早期動脈粥樣硬化有良好的保護(hù)作用，可能與其降脂抗炎作用有關(guān)。