大鼠慢性束縛應激后腸道病理及其菌群變化

王 華, 王志紅

合肥市第二人民醫(yī)院消化內科, 合肥 230000

大鼠慢性束縛應激后腸道病理及其菌群變化

王 華, 王志紅*

合肥市第二人民醫(yī)院消化內科, 合肥 230000

基于慢性束縛應激法建立大鼠慢性應激模型，結合蘇木精-伊紅染色和腸道細菌基因間重復序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)-PCR技術觀察大鼠腸道組織病理及菌群變化規(guī)律。選取10只健康雄性sprague-dawley (SD)大鼠，隨機分為對照組和模型組，每組5只。對照組正常飼養(yǎng)，模型組采用束縛筒每天束縛應激4 h，連續(xù)造模30 d，造模前后記錄大鼠的體重并于造模后進行行為學評估，采用脫臼法處死并收集大鼠腸道組織及其內容物，包被切片后進行HE染色，腸道內容物初步分離后提取基因組DNA并采用ERIC-PCR檢測菌群變化規(guī)律。結果顯示，與對照組相比，應激模型組大鼠體重、穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均顯著降低，強迫游泳不動時間顯著延長、糖水偏愛顯著降低；造模后大鼠腸道微絨毛結構破損嚴重，細胞核輕微固縮且深染，腸道菌群變化明顯，出現(xiàn)了多個特征性變化條帶。采用慢性束縛應激法并結合行為學評估成功建立了大鼠慢性應激模型，結合病理學檢測和腸道菌群表達譜變化為基于慢性應激相關疾病的研究提供了重要參考，具有一定的應用價值。

大鼠慢性束縛應激模型；行為學評估；腸道組織；腸道菌群；變化

以往的研究揭示了應激對機體的神經內分泌系統(tǒng)[7]、免疫系統(tǒng)[8]和胃腸道系統(tǒng)[9]等具有明顯的調控作用，初期的反應調控機體的代償作用，進而促進機體分泌保護因子維持機體基本平衡，后期的反應將造成機體的代償紊亂，出現(xiàn)嚴重的應激性疾病。當機體處于長期的壓力應激下，壓力信號通過機體的交感和副交感神經傳導，進而導致腸道出現(xiàn)不正常的生理改變而改變腸道菌群生活的環(huán)境，最終導致腸道菌群發(fā)生顯著性改變[10,11]。本研究結合文獻報道研究慢性束縛應激后大鼠的行為學變化、腸道病理學及菌群變化，以期從腸道菌群的角度為慢性應激性損傷機理的研究提供新的研究思路和方法，具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取10只成年雄性SD(sprague-dawley)大鼠，體重200～220 g，隨機分為對照組和模型組，每組5只。實驗前適應飼養(yǎng)一周：自然光照，室溫22±2℃，自由攝取食物和水，每日定時更換飼料，通風良好，排除其他應激因素干擾。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性束縛應激動物模型制備 上述適應性飼養(yǎng)的大鼠置于束縛筒中，每天束縛應激4 h，連續(xù)應激處理30 d。大鼠束縛期間禁食禁水，束縛結束后恢復自由飲水。其中，束縛筒用于限制大鼠的活動范圍，對軀體和胃腸道等無壓迫，對其呼吸無抑制。束縛筒內置一個移動插片控制大鼠的活動空間，調節(jié)到其不產生強烈反抗的程度。

1.2.2 慢性束縛應激大鼠行為學評估 ①曠場實驗。曠場實驗需要在安靜、暗光環(huán)境下進行，行為測定于造模前和造模后各進行1次。將大鼠放置曠場箱中，每次測定5 min，包括穿越格數(shù)(以穿越底面積塊數(shù)為水平運動得分)、直立次數(shù)(為垂直運動得分)及理毛次數(shù)，記錄各組數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計學分析。

②強迫游泳實驗。強迫游泳實驗前，分別將大鼠置于強迫游泳缸內進行預適應游泳15 min，然后用毛巾擦干，24 h后進行強迫游泳6 min，計算大鼠后4 min在水面漂浮的累計不動時間，記錄各組數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計學分析。不動時間判斷標準：大鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動作以保持在水面即為不動。

以天津市和平區(qū)、河西區(qū)、河東區(qū)、南開區(qū)、河北區(qū)、紅橋區(qū)6個區(qū)的養(yǎng)老機構作為調研對象，每區(qū)隨機抽取8家養(yǎng)老機構，共發(fā)放問卷48份，回收有效問卷46份，有效回收率95.8%。

③糖水偏愛實驗。糖水消耗實驗前，將大鼠進行分籠飼養(yǎng)(1只/籠)，分別給予等體積的1%蔗糖水2瓶(200 mL/瓶)進行糖水預適應訓練24 h。然后于造模禁水24 h后的第30 d，分別給予等體積的1%蔗糖水和純水各1瓶(200 mL/瓶)，1 h后稱量剩余液體的體積，計算大鼠的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗和糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。記錄各組數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3 樣品收集及處理 行為學檢測結束后，將大鼠脫臼處死，分別收集回腸、盲腸、結腸組織及其內容物，組織樣本經生理鹽水清洗后置于4%多聚甲醛固定備用，組織內容物收集凍存于-80℃低溫冰箱待進行基因組DNA提取。

1.2.4 HE染色 采用脫臼法處死大鼠，分別收集回腸、盲腸、結腸組織及其內容物，組織樣本經生理鹽水清洗后投入預先配好的固定液中(4%多聚甲醛)固定及切片，切片厚3～4 μm。脫水后進行HE染色，蘇木精染色5 min，自來水沖洗多余染液；1%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化15 s左右，鏡檢待細胞核和核內染色質清晰為止，自來水沖洗30 min，蒸餾水沖洗2 min；0.5%伊紅溶液染色5 min，使細胞核著色；梯度乙醇各脫水3 min：70%→85%→95%→100%；二甲苯I和II透明10 min后中性樹膠封片，采集圖片并進行分析。分別選取每只大鼠胃部、回腸、盲腸、結腸較好的切片各1張，進行40倍、100倍、200 倍光鏡下觀測拍照保存。

1.2.5 腸道組織內容物基因組DNA提取 按照基因組DNA提取試劑盒所述步驟進行回腸、盲腸、結腸等腸道組織內容物基因組DNA提取：稱取180～200 mg組織內容物置于2 mL EP管，加入1.4 mL GSL緩沖液，間歇振蕩混勻1 min，70℃水浴5 min；渦旋混勻15 s，13 000 r/min室溫離心1 min，吸取上清液至一新的2 mL EP管，加入抑制劑吸附片，室溫孵育1 min，13 000 r/min室溫離心3 min；吸取上清液至新的1.5 mL EP管并重復加入抑制劑吸附片并離心；吸取200 μL上清液至新的1.5 mL EP管并加入15 μL蛋白酶K，進而加入200 μL GB緩沖液渦旋混勻15 s，70℃水浴5 min；加入200 μL無水乙醇并渦旋混勻，并將所有液體轉移至CR2吸附柱，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入500 μL GD緩沖液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入700 μL PW漂洗液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入500 μL PW漂洗液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；將CR2吸附柱置于新的收集管，12 000 r/min室溫離心2 min，棄去收集管并室溫放置10 min；再將CR2吸附柱置于新的收集管，并于CR2吸附柱膜中心位置加入50 μL TB洗脫液，室溫放置2～5 min，12 000 r/min室溫離心2 min，收集離心液-20℃冰箱保存。

1.2.6 ERIC-PCR檢測 按照文獻報道的ERIC-PCR引物序列(ERIC-1: 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC-2: 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)進行化學合成并稀釋備用。以上述定量的基因組DNA為模板，按照如下體系加樣：1 μL基因組DNA模板、0.125 μL Ex-Taq(5 U/μL)、2.5 μL 10×Ex-TaqBuffer、2 μL dNTP、0.5 μL ERIC-1、0.5 μL ERIC-2，ddH2O定容至25 μL。加樣完成后進行ERIC-PCR擴增，具體步驟為：95℃預變性7 min； 90℃ 30 s, 52℃ 1 min, 65℃ 8 min, 30個循環(huán);65℃ 16 min,4℃保存。PCR擴增產物采用1%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳驗證，凝膠成像儀采集圖片后進行分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 所有的統(tǒng)計過程均用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。用均數(shù)±標準誤差均值(Mean±SE)表示。采用Kolmogorov-Smirnov Z法進行正態(tài)性檢驗，采用Student’st-test檢驗比較兩組間差異，P<0.05水平有顯著差異認定結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 慢性束縛應激后大鼠體重變化

如下圖1所示，比較慢性束縛應激方法處理前后大鼠體重變化發(fā)現(xiàn)，造模前模型組大鼠的體重與對照組相比不存在顯著差異，造模后模型組大鼠的體重顯著低于對照組，說明慢性束縛應激影響了大鼠的體重變化。

2.2 慢性束縛應激后大鼠曠場穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)變化

如圖2所示，慢性束縛應激模型組大鼠的曠場穿越次數(shù)與對照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的曠場直立次數(shù)與對照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的曠場理毛次數(shù)與對照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的強迫游泳不動時間顯著延長，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明大鼠的行為學發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了明顯抑郁傾向。

圖1 造模前后大鼠體重變化Fig.1 Analysis of rat body weight change before or after modeling.注:“**”表示同一處理組與對照相比差異極顯著(P<0.01)。

圖2 大鼠慢性束縛應激后行為學變化Fig.2 Analysis of rat behavior changes after chronic constraint stress.注:“**”表示同一處理組與對照相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 慢性束縛應激后大鼠糖水偏愛變化

如圖3所示，與對照組相比，慢性束縛應激模型組大鼠的糖水偏愛性明顯降低近30%，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明慢性束縛應激后大鼠出現(xiàn)了厭食等抑郁癥狀。

圖3 大鼠慢性束縛應激后糖水偏愛Fig.3 Analysis of rat scurose preference after chronic constraint stress.注：“**”表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.4 慢性束縛應激后大鼠腸道組織形態(tài)變化

如圖4(彩圖見圖版二)所示，與對照組相比，急性應激后回腸組織形態(tài)結果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細胞局部溶解，細胞核皺縮變形并深染；盲腸組織形態(tài)結果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細胞局部溶解，細胞核皺縮變形并深染；結腸組織形態(tài)結果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細胞局部溶解，細胞核皺縮變形并深染，說明慢性束縛應激導致大鼠消化道出現(xiàn)了驗證的病理性損傷。

2.5 慢性束縛應激后大鼠腸道菌群變化

如圖5中ERIC-PCR鑒定結果所示，與對照組相比，大鼠回腸組織250～500 bp處的條帶和1 000～2 000 bp處的條帶在慢性束縛應激處理后消失；大鼠盲腸組織中特征性條帶較多，慢性束縛應激處理后在250～500 bp和2 000 bp處出現(xiàn)明顯特征條帶，大于2 000 bp處的條帶在應激后消失；大鼠結腸組織在應激后大于2 000 bp的條帶消失，在250～500 bp之間出現(xiàn)明顯特征條帶。說明慢性束縛應激嚴重破壞了大鼠的腸道菌群平衡。

圖4 HE染色檢測慢性束縛應激后大鼠回腸、結腸、盲腸組織病理變化Fig.4 The pathological change assay of the stomach, ileum, cecum and colon in acute stress rats using HE staining.(彩圖見圖版二)

3 討論

為了研究慢性應激對機體病理及腸道菌群的影響，本研究采用慢性束縛應激法成功建立了大鼠慢性束縛應激模型，束縛期間禁食禁水，束縛后恢復自由飲水，每天束縛4 h，持續(xù)30 d。結果發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應激后大鼠的體重和對照組相比明顯降低，曠場穿越次數(shù)、直立次數(shù)和理毛次數(shù)顯著降低，強迫游泳時間顯著延長，糖水偏好顯著降低，大鼠出現(xiàn)抑郁癥狀。腸道病理結果顯示，慢性束縛應激后大鼠的回腸、盲腸、結腸組織粘膜及微絨毛等嚴重破壞，細胞變形，細胞核深染。

圖5 ERIC-PCR檢測慢性束縛應激后大鼠回腸、盲腸、結腸菌群變化Fig.5 The change of intestinal flora profile of the stomach, ileum, cecum and colon in acute stress rat by ERIC-PCR.

人類腸道細菌數(shù)量是人體自身細胞數(shù)量的10倍，其基因數(shù)量是人體的100倍，生理狀態(tài)下，腸道微生物的組成、功能與宿主之間存在動態(tài)平衡，即腸道穩(wěn)態(tài)。數(shù)目龐大、種類多樣的微生物組成了復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，顯著調節(jié)消化道免疫、營養(yǎng)物質吸收、能量代謝和腸道生物屏障功能[12,13]。由于不同宿主的微生物可能會在其他宿主體內引起不良反應。一旦平衡被各種內外因素打破，其生存環(huán)境改變，正常的免疫和代謝等功能紊亂，出現(xiàn)各種臨床癥狀稱為菌群失調。當宿主的飲食結構、生活習慣和生理發(fā)育等發(fā)生變化時，體內菌群的結構也會發(fā)生變化[14,15]。本文ERIC-PCR結果顯示，慢性束縛應激后大鼠胃腸道菌群發(fā)生了特征性變化，如回腸250～500 bp和1 000～2 000 bp的條帶消失，盲腸250～500 bp出現(xiàn)新條帶，結腸2 000 bp左右的條帶消失，250～500 bp出現(xiàn)新條帶，表明盲腸和結腸的腸道菌群種類較多，變化較快，在受到外界壓力刺激時最先受到影響且變化較明顯。然而，無論是對照組還是模型組，同組大鼠的腸道菌群的變化差異也比較大，腸道菌群的個體差異較大，受到外界因素的影響較多，后續(xù)我們將進一步優(yōu)化實驗增加樣品量，并判定應激后優(yōu)勢菌落的變化。同時，結合分子生物學技術收集優(yōu)勢菌群條帶進行主條帶分析，并判定慢性束縛應激刺激下機體腸道菌群的變化規(guī)律。

本研究基于慢性束縛應激法建立了大鼠的慢性束縛應激模型，結合行為學評估及腸道組織病理和腸道內容物菌群變化揭示了特征病理和特征變化菌群規(guī)律，為基于腸道菌群研究慢性應激潛在作用規(guī)律的研究奠定了重要基礎。

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Alteration of Rat Intestinal Pathology and Flora Based on the Chronic Stress Model

WANG Hua, WANG Zhihong*

DepartmentofGastroenterology,theSecondPeoplesHospitalofHefei,Hefei230000,China

To establish the rat chronic stress model using the chronic stress method, and further observe the variation rule of rat intestinal pathology and its flora based on HE staining and ERIC-PCR technique. A total of 10 healthy male SD rats were chosen, and randomly divided into two groups: Control group and model group, 5 rats in each group. Wherein, rats in control group were regular raised, and rats in model group were perform constraint stress for 4 hours everyday using a constraint tube for 30 days, and the rats body weight was recorded before or after modeling, and then performed the behavioral evaluation. In addition, rats were killed, and the intestinal tissues and contents were collected, and then sliced to stain by HE staining, and the genomic DNA was extracted to perform ERIC-PCR assay. Results showed that, compared to control, the body weight, the number of through, upright, grooming significantly decreased, the no moving time of forced swimming significantly prolonged, and sugar water preference significantly decreased. Furthermore, the microvilli of intestinal tract were seriously damaged, and nuclei mild contraction and deeply staining. The intestinal flora obviously changed, and several characteristic bands appeared. Rats chronic stress model was correctly established using chronic constraint stress methods and behavioral evaluation, and provided a significant reference on the study of the chronic stress associated diseases based on pathological assay and intestinal flora expression profile alteration, and exhibited a certain application value.

rats chronic constraint model; behavioral evaluation; intestinal tissue; intestinal flora; alteration

2016-08-23; 接受日期：2016-10-13

合肥市科技局重點立項項目[合科(2011)25號]資助。

王華，醫(yī)師，研究方向為分子細胞生物學。E-mail：410908699@qq.com。*通信作者：王志紅，主任醫(yī)師，碩士生導師,研究方向為分子細胞生物學。 E-mail：410908699@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.09