水稻胚乳淀粉合成相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)、功能及其互作研究進(jìn)展

陳雅玲 包勁松

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,杭州310029;?通訊聯(lián)系人,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

水稻胚乳淀粉合成相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)、功能及其互作研究進(jìn)展

陳雅玲 包勁松?

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,杭州310029;?通訊聯(lián)系人,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

淀粉作為稻米最主要的儲(chǔ)藏物質(zhì),其生物合成過(guò)程直接影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。水稻淀粉的生物合成在造粉體中通過(guò)一系列酶促反應(yīng)完成。本文綜述了淀粉合成過(guò)程中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(BE)及淀粉脫支酶(DBE)的結(jié)構(gòu)、功能以及各酶之間的相互作用的最新研究進(jìn)展,以期為稻米品質(zhì)改良提供理論參考依據(jù)。

水稻;淀粉合成;胚乳

稻米作為中國(guó)主要口糧,全國(guó)有60%的人口食用。全國(guó)除西藏和青海水稻種植面積較小外,其他各省均種植一定面積的水稻[1]。因此,稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)與人民生活水平的提高息息相關(guān)。雜交水稻育種已實(shí)現(xiàn)了水稻產(chǎn)量的大幅度提高,但是雜交稻的品質(zhì)卻不能滿足廣大群眾的需求。稻米品質(zhì)已成為稻米消費(fèi)和各國(guó)育種學(xué)家的主要考慮因素。

淀粉作為稻米最主要的儲(chǔ)藏物質(zhì),約占水稻種子總質(zhì)量的80%～90%[2],其合成量的增加直接影響水稻的產(chǎn)量。而淀粉顆粒的理化特性如表觀直鏈淀粉含量(AAC)、糊化溫度(GT)、膠稠度(GC)、淀粉黏滯性(starch paste viscosity,又稱RVA譜, RVA profile)及支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)等直接或間接影響稻米的食用及蒸煮品質(zhì)[3,4]。因此,深入了解和研究水稻淀粉的生物合成過(guò)程,對(duì)水稻產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改良具有重要意義。

水稻淀粉的生物合成在葉綠體或造粉體中通過(guò)一系列酶促反應(yīng)完成,包括ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、顆粒結(jié)合型淀粉合酶(GBSS)、可溶性淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(BEs)、淀粉去分支酶(DBEs)和淀粉磷酸化酶(PHO)[5,6]。GBSS催化直鏈淀粉的合成,SSs、BEs和DBEs共同完成支鏈淀粉的合成。目前,通過(guò)對(duì)水稻胚乳突變體材料的培育及研究,淀粉合成過(guò)程中相關(guān)酶的功能已基本確定。本文概述了水稻淀粉合成和積累過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵酶的功能及其相互作用研究的最新進(jìn)展,以期為稻米品質(zhì)改良提供理論參考依據(jù)。

1 水稻胚乳中淀粉合成途徑

水稻淀粉合成包括瞬時(shí)淀粉合成和儲(chǔ)藏淀粉合成兩種形式。瞬時(shí)淀粉在白天積累,晚上降解為植物組織提供能量,主要合成場(chǎng)所在葉綠體中;而儲(chǔ)藏淀粉能不斷合成和積累,可作為種子發(fā)芽時(shí)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),主要合成場(chǎng)所在造粉體中。

在高等植物中,瞬時(shí)淀粉和儲(chǔ)藏淀粉的合成過(guò)程具有很大的差別。在葉綠體中,通過(guò)卡爾文循環(huán)形成的磷酸丙糖(triose-P)或3-磷酸甘油酸(PGA)經(jīng)磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TPT)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,然后由一系列酶催化形成磷酸已糖(Hexose-P),最后用于蔗糖(surose)的合成(圖1-A);而果糖-6-磷酸(F6P)則用于瞬時(shí)淀粉的合成。首先,F6P轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸(G6P),而后在細(xì)胞質(zhì)葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)和葡萄糖磷酸變位酶(PGM)作用下合成葡萄糖-1-磷酸(G1P),隨后G1P在AGPase的催化作用下合成ADPG,ADPG作為淀粉合成相關(guān)酶的底物合成瞬時(shí)淀粉[7](圖1-A)。儲(chǔ)藏淀粉的生物合成以蔗糖為底物,蔗糖水解是儲(chǔ)藏淀粉合成的第一步[7];來(lái)自葉片光合作用合成的或淀粉降解的蔗糖,經(jīng)韌皮部運(yùn)輸至胚乳后,通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),在蔗糖合成酶(SuS)催化下水解形成果糖(Fructose)和UDP-葡萄糖(UDPG),UDP-葡萄糖繼而形成G1P;此外,蔗糖還可水解為己糖,經(jīng)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)子轉(zhuǎn)運(yùn)到胚乳細(xì)胞質(zhì)中,再經(jīng)變構(gòu)酶、己糖激酶等轉(zhuǎn)化成G1P;然后G1P在細(xì)胞質(zhì)ADPGase的作用下形成ADPG;ADPG在由Brittle1基因編碼的內(nèi)包膜蛋白作用下進(jìn)入造粉體中(圖1-B)。Fettke等[8]研究發(fā)現(xiàn),G1P可能通過(guò)假定的G1P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接進(jìn)入造粉體,然后在AGPase催化下合成ADPG。由葡萄糖-1-磷酸形成的ADPG經(jīng)GBSS催化合成直鏈淀粉,SSs負(fù)責(zé)延伸α-1,4糖苷鍵連接的葡萄糖鏈,而后由BEs形成分支,最后由DBEs去除不合適的分支完成支鏈淀粉合成(圖1-C)。

2 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶

在高等植物中,ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化G1P和ATP形成ADPG和焦磷酸(PPi),是胚乳淀粉合成過(guò)程中的限速酶[9,10],直接決定淀粉的合成速率和淀粉累積水平。在水稻中, AGPase以異源四聚體(α2β2)的形式存在,由兩個(gè)大亞基(LSs)和兩個(gè)小亞基(SSs)組成[11,12](表1)。Dawar等[13]通過(guò)SWISS-Model Server網(wǎng)站(http://swissmodel．expasy．org)預(yù)測(cè)了水稻的AGPase結(jié)構(gòu),并利用SAVES網(wǎng)站(http://nihserver．mbi．ucla．edu/SAVES)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)LSs具有19個(gè)β鏈和15個(gè)α螺旋,SSs具有18個(gè)β鏈和15個(gè)α螺旋。對(duì)二聚體表面氨基酸、疏水作用及氫鍵研究可知,A鏈和B鏈之間有19個(gè)氫鍵和28個(gè)疏水分子連接,而A鏈和D鏈之間僅有4個(gè)氫鍵和15個(gè)疏水分子連接;相似的B鏈和C鏈之間有10個(gè)氫鍵和19個(gè)疏水分子連接,C鏈和D鏈之間的氫鍵和疏水分子最多,分別為27和38個(gè)[13](圖2-A)。

圖1 光合作用組織和非光合作用組織中淀粉合成途徑和相關(guān)代謝[7]Fig．1．Schematic representation of the starch biosynthetic pathway and the related metabolism in photosynthetic and non-photosynthetic tissues[7]．

表1 水稻胚乳中淀粉合成相關(guān)基因、功能及表達(dá)特征Table 1．Function and expression pattern of starch synthesis genes in rice endosperm．

目前對(duì)水稻胚乳突變體的研究,LSs和SSs的功能也基本明確。SSs是酶的活性中心,與底物結(jié)合,參與催化和擬制作用,保守性高;而LSs是酶的調(diào)控中心,可以調(diào)節(jié)SSs對(duì)3-磷酸甘油酸和無(wú)機(jī)磷酸的變構(gòu)效應(yīng)來(lái)控制淀粉合成。在植物中,通過(guò)位于SSs的N末端區(qū)域的保守Cys12氨基酸的氧化還原反應(yīng)形成二硫鍵來(lái)進(jìn)行AGPase的變構(gòu)調(diào)節(jié)[14]。在水稻胚乳中,細(xì)胞質(zhì)中AGPase的LSs和SSs分別由Os AGPS2b和OsAGPL2基因編碼;但是Os-AGPS2b編碼的S2b亞單位缺少變構(gòu)調(diào)節(jié)的保守氨基酸Cys12[15]。Tuncel等[15]對(duì)水稻胚乳的LSs進(jìn)行點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn),位于LSs的N末端Cys47和Cys58控制AGPase的氧化還原反應(yīng),表明水稻胚乳中的AGPase酶活性主要由大亞基通過(guò)氧化還原調(diào)控小亞基共同決定。Tang等[16]利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)水稻皺縮突變體w24進(jìn)行研究,也發(fā)現(xiàn)OsAGPS 2b和OSAGPL 2存在著直接的相互作用控制淀粉的合成。因此,位于細(xì)胞質(zhì)中的OsAGPSb和OsAGPL2對(duì)于正常水稻胚乳中AGPase活性和淀粉合成起著關(guān)鍵性作用。

圖2 水稻淀粉合成相關(guān)酶3D結(jié)構(gòu)Fig．2．3D structure of starch synthesis related enzymes in rice．

3 淀粉合酶

淀粉合酶是一類葡萄糖轉(zhuǎn)移酶,以ADPG為底物,葡萄糖殘基通過(guò)α-1,4糖苷鍵摻入寡聚糖引物的非還原末端,最終形成以α-1,4糖苷鍵連接的葡聚糖,葡聚糖又作為淀粉分支酶的底物合成支鏈淀粉[17]。淀粉合酶由多個(gè)基因編碼,并形成多個(gè)共同體。根據(jù)其在淀粉體中存在的狀態(tài),淀粉合酶可分為顆粒結(jié)合型淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(SS)。每一種淀粉合酶又有許多同工型,它們由不同的基因編碼并在淀粉生物合成過(guò)程中承擔(dān)著不同的角色。水稻淀粉合酶由GBSS、SSⅠ、SSⅡ、SSⅢ和SSⅣ5種類型組成(表1)。最新的研究數(shù)據(jù)顯示,水稻和馬鈴薯可能具有SSⅤ類型[18]。

3．1 顆粒結(jié)合型淀粉合酶(GBSS)

GBSS通過(guò)與淀粉顆粒特異性結(jié)合,參與直鏈淀粉的合成。水稻GBSS有兩種同工酶,GBSSⅠ和GBSSⅡ;GBSSⅠ主要控制胚乳等貯藏器官中直鏈淀粉的合成[19],而GBSSⅡ主要控制根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官中瞬時(shí)淀粉的合成[20]。將水稻GBSSⅠ的氨基酸序列提交到SWISS Model Server進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)水稻GBSSⅠ結(jié)構(gòu)具有β片層、α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲;其中α螺旋可能負(fù)責(zé)物質(zhì)運(yùn)輸和酶活性,而β片層可能負(fù)責(zé)酶的亞細(xì)胞定位[21](圖2-B)。

在水稻中,GBSSⅠ由Wx編碼,Wx位于第6染色體上,蛋白質(zhì)大小為60 k D左右。大量研究表明,Wx外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,都將影響其表達(dá)量和蛋白質(zhì)功能。目前在水稻中已經(jīng)報(bào)道了7個(gè)Wx等位基因和7個(gè)功能位點(diǎn),包括Wxb等位基因的第1內(nèi)含子5′端剪切位點(diǎn)G/T突變[22]、wx等位基因的第2外顯子23 bp堿基重復(fù)插入[23]、Wxop和Wxhp等位基因的第4外顯子A/G突變[24,25]、Wxmq等位基因的第4外顯子G/A突變和第5外顯子T/C突變[26]、Wxin等位基因的第6外顯子A/C突變[27]和第10外顯子的C/T突變[28];這7個(gè)功能位點(diǎn)已被證實(shí)與稻米直鏈淀粉含量變化顯著相關(guān)[29]。

此外,GBSS不僅與直鏈淀粉合成相關(guān),而且還可能涉及淀粉顆粒中支鏈淀粉超長(zhǎng)鏈(ELC)的合成。Hanashiro等[30]將GBSSⅠ基因?qū)雡 x水稻突變體中,發(fā)現(xiàn)ELC增加了7．5%～8．4%。水稻SSⅢa缺失突變體中,GBSSⅠ活性的增加伴隨著大量高ELC含量的支鏈淀粉產(chǎn)生[31]。Teng等[32]研究也發(fā)現(xiàn),Wx等位基因的差異還影響SSs、BEs以及PUL的活性,進(jìn)而造成支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)和淀粉理化特性差異。因而,GBSSⅠ不僅負(fù)責(zé)催化直鏈淀粉合成,對(duì)支鏈淀粉的合成也有一定的影響。

3．2 淀粉合酶Ⅰ(SSⅠ)

利用離子交換色譜分析發(fā)現(xiàn),從灌漿期水稻胚乳中提取的可溶性淀粉合酶存在兩個(gè)主要的峰,SSⅠ和SSⅢ;說(shuō)明SSⅠ和SSⅢ為胚乳中主要的SS酶,且SSⅠ活性顯著高于SSⅢ,約占總SS活性的70%[33]。這一結(jié)果在小麥和玉米胚乳中也得到了證實(shí)。水稻的SSⅠ包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子,位于第6染色體上,與Wx距離僅5 cM。Takemoto-Kuno等[34]發(fā)現(xiàn),SSⅠ活性在秈稻和粳稻品種中有顯著差異,Native-PAGE揭示秈稻品種Kasalath中SSⅠ的活性只有粳稻品種日本晴的1/6甚至更少。Chen和Bao[35]利用Native-PAGE研究發(fā)現(xiàn)SSⅠ在不同水稻品種中具有酶譜多態(tài)性,且SSⅠ酶譜多態(tài)性可能由于氨基酸K438替換為氨基酸E438所導(dǎo)致;并對(duì)預(yù)測(cè)的日本晴和93-11的3D結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),這一突變位點(diǎn)不位于酶的催化區(qū)域(黃色和藍(lán)色區(qū)域),但是與氨基酸殘基結(jié)合區(qū)位于同一平面(圖2-C)。

SS和BE重組系玉米胚乳中淀粉鏈長(zhǎng)分布分析表明SSⅠ主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉短鏈(聚合度為6～15)的合成[36]。玉米胚乳中SSⅠ更傾向于以短支鏈為底物,將其底物增加葡聚糖的鏈長(zhǎng)時(shí),SSⅠ的活性也顯著下降,且發(fā)現(xiàn)大部分ADPG都被催化成了聚合度＜10的短鏈,說(shuō)明SSⅠ主要控制A鏈和B1鏈的延伸[37]。在水稻中,Fujita等[38]通過(guò)Tos17逆轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)篩選獲得SSⅠ缺失突變體ssI,在ssI的胚乳中,支鏈淀粉聚合度為8～12的鏈降低,聚合度為6～7和16～19的鏈增加,而長(zhǎng)鏈聚合度不小于21的比例基本不變,表明SSⅠ延伸聚合度為6～7的A鏈或者B鏈形成聚合度為8～12的鏈。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SSⅠ活性的完全缺失并不影響淀粉顆粒的大小和直鏈淀粉含量,也不影響淀粉顆粒晶體結(jié)構(gòu)的形成,說(shuō)明具有其他SS能夠補(bǔ)償SSⅠ功能的缺失或降低。

3．3 淀粉合酶Ⅱ(SSⅡ)

水稻中具有3個(gè)SSⅡ同工酶,即SSⅡa、SSⅡb和SSⅡc,分別位于水稻的第6、2和10染色體上。SSⅡa也稱為SSⅡ-3或ALK,在水稻胚乳中特異性表達(dá);SSⅡb也稱為SSⅡ-2,在葉片中特異性表達(dá),可能與瞬時(shí)淀粉合成相關(guān);SSⅡc又稱為SSⅡ-1,主要在胚乳中低豐度表達(dá)[39]。3個(gè)水稻SSⅡ同工酶相互之間的氨基酸同源性為51%～64%,與其他植物SSⅡ蛋白有52%～73%的同源性[39]。

Umemoto等[40]研究表明,SSⅡa的等位基因差異是導(dǎo)致粳稻日本晴和秈稻Kasalath胚乳支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布差異的最主要原因。Nakamura等[33]研究證明,栽培稻支鏈淀粉結(jié)構(gòu)可分為L(zhǎng)-型和S-型,L型主要存在于秈型品種中,大多數(shù)粳型品種為S-型;S-型支鏈淀粉具有較多的短鏈(DP 6-10)和較少的中長(zhǎng)鏈(DP 12-24),而長(zhǎng)鏈B2和B3鏈的比率沒(méi)有明顯的差異;在蛋白水平上,秈稻的SSⅡa活性顯著高于粳型品種。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù),將秈型品種IR36的SSⅡa的cDNA導(dǎo)入粳型品種中,聚合度＜11的鏈減少,聚合度為13～25的鏈增加,支鏈淀粉從S-型轉(zhuǎn)換成L-型[33]。

大量的研究也表明,在植物胚乳中,SSⅡa通過(guò)延長(zhǎng)支鏈淀粉短鏈聚合度≤10合成中鏈聚合度為12～24[41,42]。Fujita等[43]將高活性的秈稻SSⅡaicDNA導(dǎo)入isa1突變體中,發(fā)現(xiàn)SSⅡai/isa1轉(zhuǎn)基因系中聚合度大于30的鏈增加,且SSⅡa能延伸α-葡聚糖鏈。Wang等[44]對(duì)具有不同SSⅡa等位基因的水稻育種系材料進(jìn)行淀粉結(jié)構(gòu)及糊化溫度分析,發(fā)現(xiàn)SSⅡa能合成中長(zhǎng)鏈(聚合度為16～21),進(jìn)而影響淀粉的糊化溫度。這些研究結(jié)果表明SSⅡa通過(guò)延長(zhǎng)A鏈和B1鏈合成中長(zhǎng)鏈,不形成B2鏈或者更長(zhǎng)的鏈,且直接影響淀粉的理化特性。

3．4 淀粉合酶Ⅲ(SSⅢ)

在水稻胚乳中,SSⅢ活性是僅次于SSⅠ的第二大類淀粉合酶。水稻中已克隆到2個(gè)SSⅢ基因SSⅢa和SSⅢb,分別位于第3和第8染色體上,其中SSⅢa主要存在于胚乳中,SSⅢb在葉片中表達(dá)[11]。Fujita等[38]從水稻胚乳中分離純化獲得SSⅢa酶,其在離體條件下能夠以糖原為引物,延伸鏈長(zhǎng)為聚合度為≤11的鏈合成長(zhǎng)鏈。對(duì)水稻SSⅢa缺失突變體ssⅢa研究發(fā)現(xiàn),其淀粉顆粒結(jié)構(gòu)松散,導(dǎo)致白色中心粉質(zhì)胚乳的形成,相較于野生型,ssⅢa胚乳中支鏈淀粉聚合度為6～9、16～19和33～55的鏈減少,而聚合度為10～15和20～25的鏈增加[31]。Li等[45]對(duì)大麥ss3a突變體(amo1)胚乳支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布研究表明,短鏈聚合度為9～10減少,聚合度為15～24的鏈增加,而長(zhǎng)鏈基本沒(méi)有變化。這些結(jié)果說(shuō)明SSⅢa的功能主要是利用中長(zhǎng)鏈合成支鏈淀粉聚合度聚合度＞30的長(zhǎng)鏈。此外, SSⅢa活性的缺失會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源SSⅠ活性的增加,進(jìn)而促進(jìn)聚合度為9～15和22～29的鏈合成。對(duì)玉米SSⅢa突變體dull的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源SSⅠ活性高于野生型,與水稻結(jié)果類似[46]。最近對(duì)水稻高抗性淀粉(RS)突變體的研究發(fā)現(xiàn),SSⅢa基因突變后顯著提高了水稻胚乳中抗性淀粉、直鏈淀粉、脂類、直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合體含量以及糊化溫度;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SSⅢa對(duì)RS的調(diào)控依賴于Wxa的高水平表達(dá)[86]。因此,可以推斷SS亞型之間存在互作,可以對(duì)部分不具功能或功能不足的SS亞型進(jìn)行功能補(bǔ)償。

3．5 淀粉合酶Ⅳ(SSⅣ)

目前為止,人們對(duì)SSⅣ在谷物中對(duì)葡萄糖鏈長(zhǎng)的作用知之甚少。Hirose和Terao[39]在水稻中發(fā)現(xiàn)SSⅣ有二種同工型SSSⅣa和SSSⅣb,且它們?cè)谒旧L(zhǎng)的整個(gè)階段表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,表明其在胚乳淀粉合成過(guò)程中具有一定的作用。Roldán等[47]從擬南芥中獲得SSⅣ突變體,其胚乳直鏈淀粉與支鏈淀粉的比率基本不變,且支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布也未發(fā)生變化,但是擬南芥胚乳中淀粉顆粒數(shù)量急劇下降,顆粒大小增加,說(shuō)明SSⅣ可能涉及淀粉顆粒的形成及控制淀粉顆粒數(shù)量。Toyosawa等[48]發(fā)現(xiàn)SSⅣa或者SSⅣb基因突變對(duì)水稻胚乳中淀粉顆粒特性影響不大,在ss4b/ss3b雙突變體中淀粉顆粒的數(shù)量和種子中淀粉含量變化不大,但是淀粉顆粒的形態(tài)由規(guī)則的多邊形變成了球形,表明SSⅣ在淀粉顆粒的形成中具有重要的作用。

4 淀粉分支酶

淀粉分支酶(BE)是合成支鏈淀粉的關(guān)鍵酶,主要作用是切開(kāi)α-1,4糖苷鍵連接的葡聚糖,然后轉(zhuǎn)移斷裂的鏈將其還原末端連接到C6羥基上形成α-1,6糖苷鍵從而產(chǎn)生支鏈淀粉的分支結(jié)構(gòu)。根據(jù)淀粉分支酶的生物化學(xué)特性,水稻中的BE有BEⅠ和BEⅡ兩種亞型(表1)。

4．1 淀粉分支酶Ⅰ(BEⅠ)

基于玉米BEⅠ和BEⅡ體外E．coli表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BEⅠ傾向于形成聚合度大于16的長(zhǎng)鏈,而B(niǎo)EⅡ產(chǎn)生聚合度小于12的短鏈[49]。對(duì)水稻BEⅠ突變體sbeⅠ研究發(fā)現(xiàn),其胚乳中支鏈淀粉長(zhǎng)鏈(聚合度大于37和聚合度為12～21)顯著下降,而短鏈(聚合度小于10)和中長(zhǎng)鏈(聚合度為24～34)增加,表明水稻BEⅠ可能主要用于B1鏈的合成,形成B鏈的簇狀結(jié)構(gòu)[50]。此外,sbeⅠ突變體胚乳淀粉相較于野生型具有更低的起始糊化溫度,這一結(jié)果支持支鏈淀粉具有中高比例的長(zhǎng)鏈會(huì)增加糊化的難度[31,51]。Nakamura等[52]研究發(fā)現(xiàn),BEⅠ通過(guò)分枝內(nèi)層及外層葡萄糖鏈形成短鏈及聚合度不小于40的中長(zhǎng)鏈。

成熟的BEⅠ蛋白由755個(gè)氨基酸殘基組成,屬于GH13家族蛋白;BEⅠ結(jié)構(gòu)由3個(gè)模塊組成,分別為碳水化合物結(jié)合區(qū)域48(CBM48)、中心催化區(qū)域(GH13)、C末端α-淀粉酶區(qū)域。BEⅠ中高度保守的氨基酸殘基Tyr235、Asp270、His275、Arg342、Asp344、Glu399和His467為假定的催化活性氨基酸殘基;尤其是Asp344和Glu399非常接近于糖苷鍵,進(jìn)一步確定其為活性中心[53](圖2-D)。

4．2 淀粉分支酶Ⅱ(BEⅡ)

水稻中具有兩種BEⅡ同工型,BEⅡa和BEⅡb,BEⅡa在不同組織中均有存在,BEⅡb僅在胚乳中表達(dá)。水稻BEⅡa缺失突變體be2a胚乳中,支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布相較于野生型沒(méi)有顯著的改變。由此推測(cè),BEⅡa可能對(duì)其他BE同工型具有輔助作用。Nishi等[54]分離鑒定獲得水稻BEⅡb突變體Amylose-Extender(ae突變體),支鏈淀粉長(zhǎng)鏈聚合度≥35(B2和B3鏈)和中長(zhǎng)鏈(聚合度為15～30,A鏈和B1鏈)顯著增加,短鏈(聚合度為6～12)顯著減少。Nakamura等[52]研究發(fā)現(xiàn)BEⅡb專一的轉(zhuǎn)移聚合度6和聚合度7的鏈。利用RNA干擾技術(shù),沉默水稻BEⅡb基因,導(dǎo)致表觀直鏈淀粉含量顯著增加,直鏈淀粉含量最高可增加47．61%[55]。在水稻ae/w x雙突變體胚乳中,不僅無(wú)直鏈淀粉,而且產(chǎn)生更多的長(zhǎng)鏈,少量的聚合度不大于17的鏈,而聚合度為8～12的鏈也大幅度減少。這些數(shù)據(jù)表明BEⅡb在支鏈淀粉A鏈的合成過(guò)程中起著重要的作用。

5 淀粉脫分支酶

淀粉脫分支酶(DBE)能特異性地水解淀粉中的α-1,6糖苷鍵,在氨基酸序列上與α-淀粉酶相似,屬于淀粉水解酶家族。根據(jù)DBE作用底物不同,可分為兩大類(表1):一類是異淀粉酶(ISA),ISA以變性支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉類似物為底物,特異去除其α-1,6糖苷鍵,不能作用于極限糊精和普魯藍(lán);另一類是普魯藍(lán)酶(PUL),PUL以極限糊精和普魯藍(lán)等為底物,特異去除其α-1,6糖苷鍵。

5．1 異淀粉酶(ISA)

水稻ISA有3個(gè)同工型,ISA1、ISA2和ISA3, ISA1在胚乳發(fā)育早期表達(dá),ISA2在葉片和胚乳中均有表達(dá),ISA3在胚乳中表達(dá)量較低,主要在葉片中表達(dá)[11]。對(duì)水稻ISA1突變體sug1研究發(fā)現(xiàn)ISA的表達(dá)與支鏈淀粉聚合度小于12的鏈長(zhǎng)比例有關(guān)[56]。將正常的水稻ISA1基因?qū)胪蛔凅wsugary-1中,突變體表型轉(zhuǎn)換為野生型[57,58]。ISA2缺少酶催化位點(diǎn),生物化學(xué)研究揭示ISA2可能與ISA1形成異源復(fù)合體后起催化作用。Utsumi等[58]研究發(fā)現(xiàn),在水稻胚乳中,只有ISA1同源復(fù)合體在淀粉合成過(guò)程中具有功能,異源復(fù)合體不具有功能,但是在葉片中ISA1-ISA2異源復(fù)合體也參與淀粉合成,且比ISA1同源復(fù)合體更適應(yīng)高溫(40℃)條件下淀粉的合成。朱立楠等[59]對(duì)5個(gè)直鏈淀粉和支鏈淀粉含量不同的粳稻品種胚乳發(fā)育過(guò)程中ISA基因表達(dá)量和活性研究發(fā)現(xiàn),ISA1在整個(gè)胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量明顯高于ISA2,且ISA1的基因表達(dá)量、酶活性與支鏈淀粉含量正相關(guān)。這些研究表明,ISA對(duì)支鏈淀粉的正確合成具有重要的作用,包括剪切支鏈淀粉的過(guò)分支或者移除不當(dāng)分支,保證支鏈淀粉簇狀結(jié)構(gòu)的形成。

5．2 普魯藍(lán)酶(PUL)

在水稻中,PUL基因位于第4染色體上,在整個(gè)灌漿過(guò)程中都有較高水平的表達(dá),同時(shí)在灌漿的中后期達(dá)到峰值[60]。Fujita等[61]研究發(fā)現(xiàn)水稻PUL缺失突變體聚合度為13～29的鏈降低,聚合度小于12的短鏈增加,但其增加幅度要低于sugl突變體;但pul/sugl雙突變體聚合度小于7的短鏈增幅則高于sugl突變體。玉米PUL突變體zpul-204的胚乳結(jié)構(gòu)和組成相較于野生型并沒(méi)有明顯不同,但其sul/zpul-204雙突變體胚乳中大量積累植物糖原。這些研究結(jié)果表明,在胚乳淀粉合成過(guò)程中,PUL可能對(duì)ISA起到補(bǔ)償作用。

最近的研究表明,PUL與稻米淀粉的理化特性具有顯著的相關(guān)性。Tian等[62]研究發(fā)現(xiàn)PUL+ 885的SNPs對(duì)直鏈淀粉的含量具有微效的影響。Yan等[63]分析了118份糯稻中17個(gè)淀粉合成相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),10個(gè)淀粉合成基因涉及控制RVA譜特性,其中PUL與PKV、HPV、CPV、BDV和PT顯著相關(guān)。Kharabian-Masouleh等[64]對(duì)233份水稻淀粉合成相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序,并將獲得的SNPs與淀粉理化特性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),PUL的兩個(gè)SNP與PT、GT和CHK有相關(guān)性。Yang等[65]研究發(fā)現(xiàn),在以SSⅡa的GC/TT SNP為協(xié)變量條件下,PUL為HD的主效位點(diǎn)。這些研究結(jié)果表明, PUL在水稻淀粉合成過(guò)程中具有重要的作用。

6 淀粉合成相關(guān)酶之間的互作

圖3 水稻中淀粉合成相關(guān)酶之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig．3．Potential association networks of starch synthesis enzymes in rice endosperm．

淀粉合成相關(guān)酶之間的互作在小麥、大麥、玉米胚乳中早已被發(fā)現(xiàn)。在小麥胚乳中,SSⅠ、SSⅡa和BEⅡa或BEⅡb形成約260 k D的蛋白質(zhì)復(fù)合物參與淀粉的合成[66]。Liu等[67]研究發(fā)現(xiàn),在玉米胚乳中,SSⅠ、SSⅡa和BEⅡb形成主要的蛋白復(fù)合物,并可能與BEⅡa形成分子量更大的復(fù)合物。利用凝膠滲透色譜法能分離到約670 k D包括SSⅠ、SSⅡa、BEⅡa、BEⅡb和SSⅢ的較大蛋白質(zhì)復(fù)合物,進(jìn)一步研究顯示BEⅡb在復(fù)合物中呈磷酸化狀態(tài)[67,68]。在玉米ae突變體胚乳中野生型蛋白復(fù)合物(SSⅠ、SSⅡa和SBEⅡb)被由SSⅠ、SSⅡa、SBEⅠ、BEⅡa和PHO1組成的新的復(fù)合物代替,且SBEⅠ和SP都被磷酸化了[67]。Liu等[69]利用新的玉米ae突變體研究發(fā)現(xiàn),BEⅡb活性的缺失導(dǎo)致胚乳淀粉中形成SSⅠ、SSⅡa和BEⅠ復(fù)合體, PHO1不參與形成復(fù)合體。

將水稻胚乳淀粉合成過(guò)程中主要的淀粉合成相關(guān)酶氨基酸序列提交到STRING網(wǎng)站(http:// string-db．org)預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)之間的互作,發(fā)現(xiàn)SSs、BEs和DBEs之間可能存在互作,但未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(圖2)。近年來(lái),對(duì)水稻胚乳中淀粉合成相關(guān)酶之間的互作也已從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。Bao等[70]對(duì)稻米淀粉直鏈淀粉含量(AAC)和糊化溫度(GT)的研究發(fā)現(xiàn),低AAC水稻具有高或低GT,高AAC水稻具有中或低GT;推測(cè)控制AAC的酶GBSSⅠ與控制GT的酶SSⅡa之間可能存在互作;并假定了一個(gè)SSⅡa和GBSSⅠ互作模型。Nakamura等[71]研究證明純化的水稻PHO1與BEⅠ、BEⅡa或者BEⅡb復(fù)合物具有功能互作。Nakamura等[72]在體外對(duì)水稻SS和BEs酶促反應(yīng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),SSⅠ酶促反應(yīng)能被BEs所促進(jìn),BEs活性也能被SSⅠ所促進(jìn),說(shuō)明SSⅠ和BEs具有相互作用。Crofts等[73]利用凝膠滲透色譜、免疫共沉淀等方法,對(duì)日本晴胚乳中淀粉合成相關(guān)酶進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),＞700 k D的蛋白復(fù)合物中包括SSⅡa、SSⅢa、SSⅣb、BEⅠ、BEⅡb和PUL,200～400 k D的蛋白復(fù)合物中包括SSⅠ、SSⅡa、BEⅡb、ISA、PUL和Pho1,免疫共沉淀揭示SSs-BEs、BEⅡa-Pho1以及DBE-BEⅠ形成蛋白復(fù)合物。Chen和Bao等[35]研究發(fā)現(xiàn),SSⅠ與PUL,SSⅠ與BEs,PUL與BEs具有互作,且日本晴和93-11胚乳中蛋白質(zhì)互作模式不同。盡管水稻胚乳中淀粉合酶之間已確定能形成蛋白質(zhì)復(fù)合物,但這種復(fù)合物的形成所起的作用還沒(méi)有被完全了解。蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成提高了淀粉合成效率,因?yàn)橐粋€(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物作為下一個(gè)反應(yīng)的底物時(shí)可以在復(fù)合物內(nèi)部很快傳遞(底物運(yùn)輸通道),但是具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

7 展望

淀粉代謝途徑研究一直受到廣泛的關(guān)注,隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)以及結(jié)構(gòu)分析等方法的應(yīng)用,水稻淀粉生物合成過(guò)程中涉及到的關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)、功能及互作已基本明確,但是對(duì)于淀粉合成相關(guān)酶是如何與葡萄糖鏈進(jìn)行互作以及淀粉合成相關(guān)酶復(fù)合體是如何參與淀粉的生物合成過(guò)程,所知甚少。淀粉合成相關(guān)酶是通過(guò)不同的方式與環(huán)境中的葡萄糖鏈相互作用,如GBSS、BEⅡb以及SSⅠ通過(guò)緊密或松散的方式結(jié)合于淀粉顆粒的不同位置,進(jìn)而與葡萄糖鏈互作;但是一些酶如DBEs幾乎完全溶于基質(zhì)中,以非共價(jià)的方式與碳水化合物結(jié)合,因而對(duì)其如何與葡萄糖鏈相互作用的機(jī)制還需要更多的體內(nèi)或體外分析數(shù)據(jù)進(jìn)行闡明。此外,淀粉合成過(guò)程還受一些調(diào)控因子的調(diào)節(jié),如flo2編碼一種具有RPT結(jié)構(gòu)蛋白調(diào)節(jié)淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)[74];flo6編碼具有CBM48結(jié)構(gòu)域的蛋白,與ISA1結(jié)合調(diào)控淀粉合成[75];鋅指蛋白OsbZIP58能激活水稻淀粉合成,影響淀粉顆粒數(shù)量以及改變短鏈和中長(zhǎng)鏈比例[76];而這些調(diào)控因子之間是否存在聯(lián)系,淀粉合成過(guò)程中是否存在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)其基因及蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)還未可知,有待進(jìn)一步的研究。

淀粉合成相關(guān)基因已成功應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種篩選優(yōu)質(zhì)稻米中的優(yōu)異基因。利用分子標(biāo)記已經(jīng)培育出一系列含低直鏈淀粉含量基因Wx-mq的優(yōu)良食味粳稻品種如Milk Queen、關(guān)東194、南粳46、南粳9108等[77-79]。楊瑞芳[80]利用控制水稻抗性淀粉合成的主效基因sbe3-rs進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種獲得了3個(gè)高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的抗性淀粉水稻。但是,目前開(kāi)發(fā)獲得的淀粉合成相關(guān)基因的分子標(biāo)記仍較少,優(yōu)質(zhì)水稻的培育仍需較多的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種。

在過(guò)去的幾十年,全球環(huán)境逐漸變暖;在水稻種植的季節(jié)里,最高溫和最低溫平均每10年分別升高0．3℃和0．2℃[81]。環(huán)境的惡化對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大的沖擊。Liu等[82]研究發(fā)現(xiàn),高溫會(huì)增加堊白率,降低水稻產(chǎn)量、直鏈淀粉含量以及總淀粉含量。Chen等[83]研究也發(fā)現(xiàn),短期的高溫增加了堊白率,使得淀粉顆粒變得松散,增加了單個(gè)淀粉顆粒。最近的研究表明,淀粉合成過(guò)程中相關(guān)基因如GBSS、BEⅠ和BEⅡb在高溫條件下下調(diào)表達(dá)[84,85]。然而在高溫條件下,堊白率的增加及淀粉顆粒的變化與淀粉合成相關(guān)基因有何關(guān)聯(lián),其分子機(jī)制仍不清楚;是否存在新的淀粉合酶復(fù)合體介導(dǎo)高溫下淀粉合成也待進(jìn)一步的研究。因而,在越來(lái)越嚴(yán)峻的環(huán)境條件下,以水稻為研究對(duì)象,闡明水稻淀粉的合成分子機(jī)制,對(duì)于提高水稻產(chǎn)量、改良稻米品質(zhì),提高中國(guó)農(nóng)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力,具有重要的意義。

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Progress in Structures,Functions and Interactions of Starch Synthesis Related Enzymes in Rice Endosperm

CHEN Yaling,BAO Jinsong?
(Institute of Nuclear Agricultural Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310029, China;?Corresponding author,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

Starch is the predominant rice seed reserves．Rice yield and eating quality are influenced by the process of starch biosynthesis．In endosperm amyloplast,starch biosynthesis is a result of complex network of many enzymes．This report summarized the structures,functions and interactions of ADP-glucose pyrophosphorylase(AGPase), starch synthases(SSs),starch branching enzymes(BEs)and starch debranching enzymes(DBEs)．It will provide helpful information to breed high yield and good quality rice．

rice;starch synthesis;endosperm

Q944.46;S511.01

A

1001-7216(2017)01-0001-12

2016-09-30;修改稿收到日期:2016-11-1。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2016XZZX001-09);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LZ13C130001)。