水稻光溫敏不育系“六圃法”提純保真原種繁殖體系的建立與應用

吳俊鄧啟云,,?齊紹武莊文石祖興周川廣

(1湖南雜交水稻研究中心/雜交水稻國家重點實驗室,長沙410125;2湖南袁創(chuàng)超級稻技術有限公司,長沙410100;?通訊聯(lián)系人, E-mail:dqy100＠163．com)

水稻光溫敏不育系“六圃法”提純保真原種繁殖體系的建立與應用

吳俊1鄧啟云1,2,?齊紹武1莊文1石祖興2周川廣2

(1湖南雜交水稻研究中心/雜交水稻國家重點實驗室,長沙410125;2湖南袁創(chuàng)超級稻技術有限公司,長沙410100;?通訊聯(lián)系人, E-mail:dqy100＠163．com)

【目的】水稻光溫敏不育系的提純保真繁殖對于兩系法雜交水稻的發(fā)展和應用具有十分重要的意義?，F(xiàn)有提純繁殖技術多以防止起點溫度漂移為目的,而忽視了生物學性狀的提純保真。為解決這些問題,本研究結合光溫敏不育系Y58S的多年大規(guī)模原種生產實踐,建立了水稻光溫敏不育系“六圃法”提純保真原種繁殖體系?！痉椒ā吭摷夹g體系基本步驟如下:首先,直接從生產上大規(guī)模制種使用的不育系種子中取樣,種植“典型單株篩選圃”,進行典型單株初選;其次,通過“起點溫度鑒定圃”篩選不育起點溫度基本一致的核心單株,進行起點溫度純化;然后,通過“群體觀察圃”、“配合力鑒定圃”和“制種試驗圃”來確保光溫敏不育系的遺傳背景基本純合和表型整齊一致,從而決選保真核心株系,進而獲得保真核心種子;最后,建立連續(xù)穩(wěn)定的品種“專一性原種繁殖圃”來實現(xiàn)原原種和原種的高純度生產?！窘Y論】實踐證明,該技術體系可確保獲得育性穩(wěn)定、表型整齊,且遺傳背景來源基本一致的光溫敏不育系原種,大幅度提高水稻光溫敏不育系繁殖的安全可靠性和生產效率。2008年以來,應用該技術體系生產了249萬kg Y58S生產用種,基本消滅了同形可育株,純度全部達到99．5%以上。目前這些Y58S生產用種已經(jīng)全部銷售給各種業(yè)公司進行雜交制種,生產的雜交種子推廣1474萬hm2以上。

水稻;光溫敏不育系;提純保真繁殖體系;Y58S

按照袁隆平“三系-兩系-一系”的雜交水稻發(fā)展戰(zhàn)略思想[1],我國雜交水稻已從三系法技術體系逐漸向兩系法技術體系發(fā)展。兩系法技術體系“一系兩用”,配組自由,降低了種子生產成本,易于選配出強優(yōu)勢的超高產組合,在生產中已占主導地位。據(jù)統(tǒng)計,2005年以來,全國年推廣面積最大的雜交水稻品種都是兩系雜交水稻[2,3]。位于長江流域水稻主產區(qū)的湖南、湖北、安徽等省的兩系雜交水稻種植面積都超過了三系雜交水稻[4]。隨著兩系雜交水稻的大面積生產應用,需要大量的光溫敏不育系原種,這對光溫敏不育系核心種子提純和原種生產提出了更高的要求。

1 現(xiàn)有技術及其不足

兩系法的載體光溫敏不育系的雄性不育性具有隨光長、溫度等生態(tài)因子的變化而波動的特點,因而生產上育性轉換起點溫度“漂變”現(xiàn)象非常突出,從而造成光溫敏不育系繁殖或生產制種失敗等巨大潛在風險[5]。針對這一現(xiàn)象,袁隆平等提出核心種子生產程序,即通過人工低溫篩選核心單株、自交生產原原種、由原原種繁殖生產用種的光溫敏不育系原種繁育程序[6,7]。該程序能有效控制不育起點溫度的遺傳“漂變”,已成為目前光溫敏不育系提純繁殖的核心技術。此后,水稻育種研究工作者們以該程序為基礎進行了改進研究。如一些研究者[8,9]先后提出利用海南春季自然低溫條件代替人工氣候室等專業(yè)設備進行起點溫度鑒定和提純,從而達到降低生產成本的目的;但同時由于自然低溫的不可控性,增加了提純繁殖的風險。張繁等[10]提出了一種利用不育系不同穗層之間的生育期差異而形成的后發(fā)分蘗穗定向培養(yǎng)生產核心種子方法。該方法簡化了生產程序,但專業(yè)技術水平要求較高,而且由于不同分蘗穗發(fā)育時間的連續(xù)性致使實際操作難度極大,并不能有效降低成本[11]。馬鎮(zhèn)榮等[12]則通過利用花藥培養(yǎng)技術純合基因型來實現(xiàn)光溫敏不育系的快速提純,該方法有可能縮短育種時間,但也存在難度較大,甚至不適合提純生產上大面積應用的光溫敏不育系核心種子。上述各種光溫敏不育系提純繁殖技術方法,對豐富技術思路、提高效率、降低成本具有積極意義。然而,這些技術方法都集中在以防止起點溫度“漂變”為核心目的的技術改進。在實際應用中,不育系品種的株葉形態(tài)、生育期、一般配合力和制種特性等性狀的一致性都有可能在繁殖過程中因各種內外因素而發(fā)生變化,多代繁殖、特別是連續(xù)原種繁殖易導致品種失真。如受微效基因影響較大的配合力就很容易產生變化,需通過配合力試驗、制種試驗等一系列試驗來確保品種的真實性。近年來,生產上還出現(xiàn)了一種與光溫敏不育系株葉穗粒形態(tài)基本一致、生育期相近,在各種光溫條件下花藥均能正常散粉、結實正常的“同形可育株”。因同形可育株從株葉形態(tài)、株高、生育期等方面都難以辨別、剔除,導致不育系繁殖純度嚴重降低,進而可能給大面積兩系大田制種生產帶來嚴重損失[13]。常規(guī)除雜手段很難根除同形可育株,需要從不育系核心種子及原原種繁殖源頭上進行控制。綜上所述,對于實現(xiàn)水稻光溫敏不育系品種的高純度繁殖生產和綜合性狀的“防雜保真”,迫切需要有一個高效完善的體系。筆者通過對光溫敏不育系提純繁殖的多年實踐和總結,建立了水稻光溫敏不育系“六圃法”提純保真原種繁殖體系,用來保純保真繁殖遺傳性和表型一致的、確保大面積制種生產安全的水稻光溫敏不育系原種種子[14]。

2 “六圃法”提純保真原種繁殖體系技術原理

2．1 典型單株篩選圃

目前的繁殖技術直接從原原種選擇典型單株,因為沒有經(jīng)過大規(guī)模生產應用檢驗,容易出現(xiàn)選擇不當而導致性狀偏離。本技術體系直接從大面積制種生產所用的光溫敏不育系種子中取樣,種植“典型單株篩選圃”(圖1),并主要根據(jù)育種家經(jīng)驗從中選擇與該品種原有性狀保持一致的典型單株。因其經(jīng)過了生產應用上大規(guī)模種植的超大群體檢驗,能確保從中選擇的典型單株具有原有品種的農藝性狀特點。此為保持品種真實性(保真)措施的第一步。

2．2 起點溫度鑒定圃

在光溫敏不育系育性轉換過程中,存在一個育性轉換的臨界溫度,即當環(huán)境氣溫高于該臨界溫度時,無論光長如何,水稻光溫敏不育系均表現(xiàn)為不育,這個臨界溫度就是育性轉換的起點溫度。在推廣應用過程中,發(fā)現(xiàn)不育起點溫度有遺傳“漂移”的現(xiàn)象。鄧啟云等認為光溫敏不育系的不育性受主基因控制,但其不育起點溫度值受到微效多基因群的影響。起點溫度“漂移”的遺傳本質如下:在大田繁殖過程中,帶有較多顯性微基因(具有加性效應)的單株對溫度或光照更敏感,其起點溫度偏高從而易于收獲種子,因此其在后代群體中很快占據(jù)優(yōu)勢,導致不育系群體不育起點溫度平均值逐代向上“漂移”。“漂移”現(xiàn)象也必然由于不育性遺傳中微基因作用的普遍性而普遍存在[7,15]。因此,光溫敏不育系繁殖必須按照“核心種子生產技術體系”進行嚴格的提純,將漂移幅度控制在生產允許的范圍之內[7]。本技術體系的育性轉換“起點溫度鑒定圃”即是在選擇典型單株之后,嚴格按照水稻光溫敏不育系育性轉換起點溫度純化程序進行純化,得到起點溫度不變且育性穩(wěn)定的“核心種子”(圖1)。

2．3 核心種子“三圃”保真

雜交水稻不育系經(jīng)過多年多代繁殖后,由于機械混雜、生物混雜、自然變異累積以及選擇不當產生性狀偏離等原因,都會出現(xiàn)不同程度的混雜退化導致品種失真,造成配合力降低、開花習性變劣、制種性能變差以及株、葉、穗、粒性狀與生育期分離等后果[16]。而現(xiàn)有光溫敏不育系繁殖技術方法集中以防止起點溫度“漂變”為核心目的,難以防止品種失真。對于保持原有品種特征特性和遺傳本質的“保真種子”沒有引起業(yè)界、特別是種子行政主管部門的足夠重視。因此,本技術體系引入“保真核心種子”的概念,即保持原有品種特征特性和遺傳本質,同時又保持原有品種較低的起點溫度不變,而且純度達到原原種級別的種子。

本技術體系通過建立“群體觀察圃”、“配合力鑒定圃”和“制種試驗圃”來鑒定核心株系保真情況(圖1)。其中,“群體觀察圃”通過種植較大規(guī)模的水稻光溫敏不育系群體進行放大觀察,考察其主要農藝性狀的一致性、整齊度和育性穩(wěn)定性;“配合力鑒定圃”通過對核心株系的測交配組,觀察其配合力變化情況,確保配合力穩(wěn)定;“制種試驗圃”則用于考查水稻光溫敏不育系的開花習性、異交特性、制種產量。通過此三圃配合,來確保光溫敏不育系的遺傳背景基本純合和表型性狀整齊一致,從而決選核心株系獲得保真核心種子。

2．4 專一性原種繁殖圃

水稻光溫敏不育系原種生產主要通過冷水串灌或利用自然低溫來進行高效繁殖[17]。原原種或原種純度至關重要。特別是近年來生產上出現(xiàn)的同形可育株問題,已給原種繁殖和大田制種生產帶來嚴重干擾。同形可育株與不育系表型高度相似,常規(guī)除雜手段很難根除,從不育系核心種子及原原種繁殖源頭上控制同形可育株的發(fā)生被認為是最有效的策略。筆者等通過對多年光溫敏不育系原種繁殖實踐,認為通過核心種子套袋繁殖,再配合固定繁殖基地、建立專一性原種繁殖圃(圖1),實現(xiàn)三代嚴格自交再配合嚴格除雜,即可從源頭上完全控制甚或消除同形可育株[13,14]。

3 “六圃法”提純保真繁殖技術體系操作程序

根據(jù)上述水稻光溫敏不育系提純保真技術原理結合生產實踐,建立了一套完整的水稻光溫敏不育系提純保真繁殖技術體系(圖1),具體操作程序如下。

3．1 典型單株篩選圃

3．1．1 樣本種植

選擇肥力條件均勻、排灌方便的田塊,播種取自光溫敏不育系大面積生產用種的樣品種子,種植3000株以上的群體,按一般栽培管理,保證各單株之間條件一致,建立典型單株篩選圃。

3．1．2 初選

經(jīng)多次觀察,田間選擇具有原品種典型株葉形態(tài)且整齊一致的單株600～800株,在其主穗進入幼穗分化4期時,移入盆缽中,每缽栽3～4株。

3．2 起點溫度鑒定圃

3．2．1 低溫篩選

將上述盆缽栽培4～5 d的典型單株材料搬移到人工氣候室或恒溫冷水池,21．0℃～22．5℃低溫處理約7 d,然后將盆缽移到自然條件下并掛牌編號,生長5 d,當80%植株的分蘗開始抽穗時,選擇當天抽出的穗子進行花粉取樣鏡檢,每株鏡檢3～4穗,連續(xù)鏡檢3～5 d,選擇花粉不育度為100%的單株為核心單株。

3．2．2 再生低溫復雄

將核心單株刈割再生,待再生后核心單株進入育性敏感期時將其移置于溫度為20℃～21．5℃的環(huán)境中7～10 d,然后移至室外,抽穗前分單株套袋,成熟時分株收獲種子,得到傳統(tǒng)意義上的水稻光溫敏不育系核心種子(核心1代種子,H1)。

3．2．3 種植核心株系

將核心種子分株系進行冷水串灌或自然低溫繁殖,各種植100～200株,根據(jù)生育期、株葉形態(tài)等指標進行初步篩選,淘汰不整齊株系,將高矮一致、具有原品種典型株葉形態(tài)的水稻光溫敏不育系核心株系套袋或嚴格隔離,并依序將套袋或嚴格隔離的水稻光溫敏不育系核心株系編號,待其成熟時分株系收獲種子,所獲種子即為水稻光溫敏不育系核心2代種子(H2)。

圖1 水稻光溫敏不育系“六圃法”提純保真繁殖體系Fig．1．System for seed purification and multiplication of PTGMS line in rice．

3．3 “三圃”保真

3．3．1 配合力鑒定圃

將收獲H2種子后的水稻光溫敏不育系核心株系植株移植到正常田塊刈割再生,待其再生苗抽穗后,選用該水稻光溫敏不育系任一審定組合的父本進行測交配組,分株系收獲測交種子,并分株系種植測交后代各100～200株,同時種植該組合大面積制種種子作為對照,建立配合力鑒定圃,對各水稻光溫敏不育系核心株系進行配合力鑒定。

3．3．2 群體觀察圃和制種試驗圃

將核心2代種子(H2)分為三份:一份分株系種植200～1000個單株,以此建立群體觀察圃,觀察該圃的水稻光溫敏不育系群體的整齊度及其育性穩(wěn)定性;另一份用于制種試驗,即建立制種試驗圃,觀察該圃中光溫敏不育系的開花習性、異交特性、制種產量,并將制種試驗收獲的種子各種植200～500個單株,繼續(xù)觀察其配合力變化;第三份儲存?zhèn)溆谩?/p>

3．3．3 得到保真核心種子

根據(jù)配合力鑒定圃、群體觀察圃和制種試驗圃的測試鑒定結果,綜合分析決選出各方面都表現(xiàn)良好的10～20個水稻光溫敏不育系保真核心株系,所選株系對應的備用種子即為本技術體系所提純的水稻光溫敏不育系核心2代保真種子,冠名“保真核心種子”(H3)。在遺傳學意義上H3＝H2,但在生物學意義上,H3與H2完全不同。H3種子可在嚴格隔離條件下用于繁殖原原種種子(H4)。

3．3．4 兩代嚴格自交

需要嚴格自交的“兩代”是指核心種子和原原種種子,嚴格自交的措施通常采用單株套袋收種。通過這兩代的嚴格自交收種,可以從源頭上避免高起點溫度單株或可育單株串粉混雜,防止起點溫度漂移和同形可育株的產生。

3．4 專一性原種繁殖圃

3．4．1 固定繁殖基地

選擇隔離條件好、水源充足、排灌方便并且集中連片的田塊建立成單一不育系專門的冷水串灌繁殖基地。該基地每年僅用作同一不育系原原種繁殖原種。在繁殖基地中打深水井,為育性轉換敏感期使用大功率水泵抽地下冷水串灌繁殖田提供穩(wěn)定冷水源。長期固定的冷水串灌原種繁殖基地,徹底消除落田谷雜株,可嚴格控制甚或消除同形可育株。

3．4．2 強化除雜

用原原種種子(H4)在該不育系固定繁殖基地繁殖,繁殖階段盡可能地除盡各類異形株和同形可育株,對獲得的不育系原種(H5)進行純度鑒定。用原種種子大量繁殖光溫敏不育系生產用種(H6)種子,并對生產用種種子進行純度鑒定,鑒定后的高質量生產用種可提供給種業(yè)公司用于大面積制種生產。

4 提純保真原種繁殖生產實踐

Y58S是本課題組選育的水稻光溫敏不育系,具有農藝性狀優(yōu)良、一般配合力好、抗病抗逆力強、起點溫度低、異交結實率高等優(yōu)點[18]。Y58S是生產上使用最廣泛的不育系之一,據(jù)統(tǒng)計,已有95個以Y58S為母本的雜交稻組合共通過130次省級以上審定,其中通過國家審定組合20個[19]。這些組合以廣適性為其突出優(yōu)點在生產上大面積推廣。其代表性品種Y兩優(yōu)1號自2010年起連續(xù)4年成為中國年推廣面積最大的雜交水稻品種[3],Y兩優(yōu)2號、Y兩優(yōu)900分別于2011、2014年通過農業(yè)部專家組現(xiàn)場測產驗收,平均產量達到926．6 kg/667m2和1026．7 kg/667 m2,多次刷新一季中稻較大面積單產世界紀錄。Y兩優(yōu)系列組合的快速發(fā)展及推廣面積的持續(xù)迅速增加,需要大量合格的Y58S生產用種。尤其是Y58S具有異交結實率高的特點,在不育系繁殖時極易造成生物學混雜,給Y58S原種生產提出了很高的要求。根據(jù)本提純保真繁殖生產技術體系,2008年以來,連續(xù)8年原種生產均取得成功,共生產高純度Y58S生產用種249萬kg,純度均在99.5%以上。這些種子已提供給全國30余家從事Y兩優(yōu)系列組合開發(fā)的種子公司進行制種生產,生產的雜交種子可以推廣1474萬hm2以上。實踐證明,該技術體系可確保高純保真的光溫敏不育系生產用種供應,大幅度提高水稻光溫敏不育系繁殖的安全可靠性和生產效率。

5 討論與展望

水稻光溫敏不育系原種是兩系法雜交水稻大面積生產用種的源頭,由于其巨大的繁殖系數(shù),核心種子質量對大面積制種和糧食生產安全有至關重要的影響。按保守的繁殖產量測算,一株保真核心單株的種子(100粒),經(jīng)過保真核心種子(H3)-原原種(H4)-原種(H5)-生產用種(H6)的擴繁,可以繁殖用于5～6萬畝制種田的母本種子,進一步可以制出滿足50萬hm2大田生產的雜交種子。相比現(xiàn)有的其他水稻光溫敏不育系原種繁殖技術,“六圃法”提純保真原種繁殖體系通過更為嚴密和完善的程序,實現(xiàn)高純保真的光溫敏不育系繁殖和生產,其可靠性和效果都已通過生產實踐的檢驗。并且其技術步驟還可以進一步豐富和完善,如近年來發(fā)展迅速的基因組測序技術[20],將基于新一代測序技術的“全基因組指紋鑒定譜”或芯片技術與本技術體系相結合,無疑將提高提純保真的準確度和效率。

水稻光溫敏不育系核心種子的生產事關兩系法雜交水稻種業(yè)安全和國家糧食安全。然而,水稻光溫敏不育系能自交繁殖的特點導致親本容易外流,部分小規(guī)模的中小種子公司在不具備技術基礎的情況下自行繁殖光溫敏不育系種子以降低種子生產成本,結果出現(xiàn)光溫敏不育系育性轉換起點溫度升高、同形可育株超標、在制種期間自交結實,因而造成雜種質量不合格,甚至出現(xiàn)制種全盤失敗的現(xiàn)象已屢見不鮮。由于中小種業(yè)公司在我國種業(yè)市場上仍具有相當大的份額,一旦其制種失敗,將給種業(yè)安全和糧食安全造成較大威脅。本技術體系的建立和多年應用實踐結果表明,建立專業(yè)化的技術團隊,嚴格按照光溫敏不育系提純保真原種繁殖技術體系的程序化要求,逐級進行核心種子、保真核心種子、原原種、原種、生產用種的繁殖與生產,是避免兩系法雜交水稻種子生產的無序和風險、確保大面積生產安全和國家糧食安全的有效途徑。呼吁有關部門予以高度重視。

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Establishment and Application of“Six-Nursery Method”System for Seed Purification and Multiplication of PTGMS Lines in Rice

WU Jun1,DENG Qiyun1,2,?,QI Shaowu1,ZHUANG Wen1,SHI Zuxing2,ZHOU Chuanguang2
(1 Hunan Hybrid Rice Research Center/State Key Laboratory of Hybrid Rice,Changsha 410125,China;2Bio-Rice(Hunan)Co．Ltd．,Changsha 410100,China;?Corresponding author,E-mail:dqy100＠163．com)

【Objective】Guaranteeing the seed purity of photo-thermo-sensitive genic male sterile(PTGMS)lines is extremely important for developing and using two-line hybrids．Problems still remained in existing technologies which put too much emphasis on preventing the threshold temperature drift and neglect maintaining not only high seed purity but authenticity．To solve these problems,a new set of“Six-Nursery Method”purification and multiplication system of PTGMS lines in rice has been established based on years of multiplication practices of PTGMS line Y58S in large scale commercially．【Method】Key technologies of this system are as follows:initial separating typical monoclonal in screening nursery which is sampled directly from commercial foundation seeds in mass multiplication,and then genetically purifying critical temperature inducing male sterility in critical temperature identification nursery; integrating evaluation results in 3 nurseries,such as group observation nursery,combining ability identification nursery and outcrossing testing nursery,to the final selection for purified genetic background and uniformed phenotype,in order to screening authentic core lines and to obtaining original seed;establishing a specifical original seed multiplication base to achieve the high purity original seed;multiplying original seed to produce breeder seed and multiplying breeder seed to produce foundation seed of PTGMS lines．【Conclusion】Practices have proved that application of such a set of techniques could guarantee stable sterility and identical genetic background of PTGMS line and greatly improve the safety and reliability of two line hybrids in commercial production．Since 2008,2．49 million kg foundation seeds of Y58S with the purity over 99．5%have been produced by applying this purification and multiplication system,and been provided to seed companies for hybrid seed production,which have produced a large number hybrid seeds for planting 14．74 million hectare in farmer’s field．

rice;PTGMS;purification and multiplication system;Y58S

S511.0351

A

1001-7216(2017)01-0099-06

2016-03-28;修改稿收到日期:2016-08-24。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0101103);國家自然科學基金資助項目(31470089)。