視神經(jīng)脊髓炎患者水通道蛋白4基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的研究

王青松，戴慶箐，王 浩，徐 竹，張藝凡，楚 蘭*

·論著·

視神經(jīng)脊髓炎患者水通道蛋白4基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的研究

王青松1，戴慶箐2，王 浩2，徐 竹2，張藝凡2，楚 蘭2*

目的 從基因水平研究水通道蛋白4(AQP4)基因外顯子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)以及其在視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法 選取2010年3月—2012年6月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院收治的視神經(jīng)脊髓炎患者72例為視神經(jīng)脊髓炎組，同時(shí)期本院收治的多發(fā)性硬化患者80例為多發(fā)性硬化組，取全血DNA進(jìn)行AQP4基因的SNP位點(diǎn)分析，并通過特異性的定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)攜帶AQP4基因表達(dá)序列的綠色熒光蛋白表達(dá)載體(pEGFP)重組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)誘變，根據(jù)相應(yīng)SNP位點(diǎn)突變生成相應(yīng)突變質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立抗AQP4抗體檢測(cè)細(xì)胞株。分析視神經(jīng)脊髓炎患者6種突變細(xì)胞株與原始細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度水平及視神經(jīng)脊髓炎組與多發(fā)性硬化組不同細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度陽性率的差異。結(jié)果 視神經(jīng)脊髓炎組共發(fā)現(xiàn)6個(gè)AQP4基因SNP位點(diǎn)，位于2號(hào)和5號(hào)外顯子，分別為R108T、I110N、E280R、D281R、P295R、E317M。1、3、4號(hào)外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)AQP4基因SNP位點(diǎn)，多發(fā)性硬化組未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的AQP4基因SNP位點(diǎn)。構(gòu)建R108T、I110N、R108T/I110N、E280R/D281R、P295R、E317M細(xì)胞株，R108T/I110N、E280R/D281R、E317M細(xì)胞株與原始細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。視神經(jīng)脊髓炎組與多發(fā)性硬化組中原始細(xì)胞株及R108T、I110N、R108T/I110N、E280R/D281R、P295R、E317M細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 視神經(jīng)脊髓炎患者AQP4基因SNP位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致表達(dá)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可以改變其抗原性，抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)度不同可能是導(dǎo)致不同突變組間滴度差異的原因。

視神經(jīng)脊髓炎；水通道蛋白質(zhì)4；多態(tài)性，單核苷酸

王青松，戴慶箐，王浩，等.視神經(jīng)脊髓炎患者水通道蛋白4基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(3)：331-336.[www.chinagp.net]

WANG Q S,DAI Q Q,WANG H,et al.Single nucleotide polymorphic site of aquaporin-4 gene in patients with neuromyelitis optica[J].Chinese General Practice，2017，20(3)：331-336.

視神經(jīng)脊髓炎又名Devic病，是主要累及視神經(jīng)及脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性脫髓鞘疾病，1894年由DEVIC[1]首次進(jìn)行了比較詳細(xì)的報(bào)道。2004年LENNON等[2]首次發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)脊髓炎-IgG與視神經(jīng)脊髓炎具有相關(guān)性，隨后2005年LENNON等[3]證實(shí),視神經(jīng)脊髓炎-IgG的靶抗原即為水通道蛋白4(AQP4)。視神經(jīng)脊髓炎-IgG的發(fā)現(xiàn)使學(xué)者逐漸認(rèn)識(shí)到視神經(jīng)脊髓炎與多發(fā)性硬化的區(qū)別。目前對(duì)于視神經(jīng)脊髓炎及多發(fā)性硬化的研究涉及種族分布、免疫機(jī)制、病理改變、治療和預(yù)后等諸多方面，且已有大量研究從基因水平探討了多發(fā)性硬化患者的發(fā)病機(jī)制，但從基因水平探討視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究仍較少[4-5]。本研究分析視神經(jīng)脊髓炎患者AQP4基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，并建立不同位點(diǎn)變異的細(xì)胞株，檢測(cè)視神經(jīng)脊髓炎患者體內(nèi)抗AQP4抗體滴度，根據(jù)抗AQP4抗體滴度的差異研究不同的變異位點(diǎn)，進(jìn)而探討其在視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年3月—2012年6月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院收治的視神經(jīng)脊髓炎患者72例為視神經(jīng)脊髓炎組，其中男14例，女58例；發(fā)病年齡12～60歲，平均發(fā)病年齡(40.6±13.0)歲；擴(kuò)展殘疾狀況評(píng)分(EDSS)3.5～7.5分，平均EDSS(4.3±1.6)分；其中高危綜合征16例。視神經(jīng)脊髓炎及高危綜合征患者入組標(biāo)準(zhǔn)參照2006年WINGERCHUK等[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)(除外抗AQP4抗體陽性)。選取同時(shí)期本院收治的多發(fā)性硬化患者80例為多發(fā)性硬化組，其中男36例，女44例；發(fā)病年齡18～66歲，平均發(fā)病年齡(37.7±11.8)歲；EDSS 2.5～6.0分，平均EDSS(3.6±2.1)分。多發(fā)性硬化患者入組標(biāo)準(zhǔn)參照國際通用2005年McDonald標(biāo)準(zhǔn)(除外腦脊液寡克隆區(qū)帶陽性)[7]。手術(shù)切除的成年人腦膜瘤患者的瘤體組織(62歲男性患者)由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院神經(jīng)外科提

本研究背景：

目前，視神經(jīng)脊髓炎的確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。2004年LENNON等首次發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)脊髓炎-IgG與視神經(jīng)脊髓炎具有相關(guān)性，隨后在2005年LENNON等通過使用冷凍小鼠腦、肝、腎、胃組織切片及水通道蛋白4(AQP4)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK-293)的方法再次證明了視神經(jīng)脊髓炎-IgG的靶抗原即為AQP4，而視神經(jīng)脊髓炎-IgG即為抗AQP4抗體。從而使得視神經(jīng)脊髓炎成為第一個(gè)有明確自身靶抗原的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。就目前所知，對(duì)視神經(jīng)脊髓炎患者AQP4基因水平的變化與疾病的關(guān)系的相關(guān)研究較少，目前為止僅有數(shù)篇關(guān)于AQP4基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)在腦卒中發(fā)病機(jī)制方面的相關(guān)研究，故本研究目的在于探討AQP4基因SNP位點(diǎn)與視神經(jīng)脊髓炎的關(guān)系，并進(jìn)一步從基因水平來探討其發(fā)病機(jī)制。

供。研究對(duì)象均知情并簽署正式書面授權(quán)書，相關(guān)實(shí)驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者由2名神經(jīng)內(nèi)科副主任級(jí)別以上醫(yī)師獨(dú)立診斷。

1.2 材料 AQP4-綠色熒光蛋白(GFP)融合表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP4為本實(shí)驗(yàn)室保存；HEK293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、D-Hanks液、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM購自Gibco公司；LipofectamineTM2000、G418、Alexa568標(biāo)記的山羊抗人IgG均購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；兔抗人AQP4多克隆抗體、山羊抗兔IgG購自 Millipore公司。設(shè)備：臺(tái)式高速離心機(jī)TGL-16G 型，水浴恒溫振蕩器DSHZ-300型，電熱恒溫水浴箱HH.WZ1 420型，梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀9600型，紫外分光光度計(jì)，DNA凝膠成像分析系統(tǒng)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ-5型，水平電泳槽Ⅲ33A型，電子天平FA1104MA110，超低溫冰箱，流式細(xì)胞儀，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Olympus熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 PCR及產(chǎn)物測(cè)序 在患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等相關(guān)治療之前抽取清晨空腹靜脈血5 ml于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，-80 ℃儲(chǔ)存以備檢測(cè)。取500 μl血樣加入到1.5 ml離心管中,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min(離心半徑為6 cm)，分離血清。常規(guī)采用酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，PCR法擴(kuò)增AQP4基因(NC_000018)的1、2、3、4、5號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列，引物序列、解鏈溫度及擴(kuò)增后片段長度見表1。PCR擴(kuò)增后對(duì)目的片段進(jìn)行基因測(cè)序(310型全自動(dòng)遺傳分析儀設(shè)備，Applied Biosystems公司)，采用Chromas 2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 AQP4基因外顯子引物序列、解鏈溫度及擴(kuò)增后片段長度

Table 1 Primer sequences,melting temperature and amplified fragment length of exons of AQP4 gene

外顯子引物序列解鏈溫度(℃)擴(kuò)增后片段長度(bp)Exon1上游引物：5′-CAGGCAATGAGAGCTGCAC-3′下游引物：5′-ACAGTTTCATCTTTTGGCCCTA-3′605122Exon2-1上游引物：5′-GTAGTGGCTTCTGATGCTG-3′下游引物：5′-AGCAAAGGGAGATGAGAA-3′508234Exon2-2上游引物：5′-TGGTTCTCATCTCCCTTTGCT-3′下游引物：5′-GCAAGAAGCTTGGAGTCCTAG-3′569284Exon3上游引物：5′-TGTCATCGAAAATACTCTTG-3′下游引物：5′-AATGGACTTGGAAACTTACT-3′488238Exon4上游引物：5′-GTAGCCCTGTTTCAGCAAT-3′下游引物：5′-TCTGTGCTATTCTTTCCCTA-3′492294Exon5上游引物：5′-TCGTTTTAAAGAAGCCTTCAGC-3′下游引物：5′-CTGCTTTCAGTGCGATCTTCTA-3′600216

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析后獲取AQP4基因的SNP位點(diǎn)信息，提取湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院神經(jīng)外科獲取的成年人腦膜瘤患者的瘤體組織(征得患者同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))中總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄(上游引物：5′-TTCTAGACCACCATGAGTGAC

AGACCCAC-3′，含XbaⅠ酶切位點(diǎn)TCTAGA；下游引物：5′-CGTGTACATCATACTGAAGACAATACCTCTCCA

G-3′，含BsrGⅠ酶切位點(diǎn)TGTACA)獲取人源AQP4全長cDNA(AQP4亞型a，GenBank accession number NM_001650)，PCR獲取全長AQP4基因。將該基因整合到能夠表達(dá)GFP的質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech公司)多克隆位點(diǎn)，并測(cè)序確認(rèn)。

1.3.3 定點(diǎn)誘變及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)試驗(yàn)取得的SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)采用定點(diǎn)誘變(QuikChange mutagenesis protocol，Stratagene)對(duì)AQP4 cDNA的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，構(gòu)建相應(yīng)的突變質(zhì)粒(廣州復(fù)能基因有限公司)，定點(diǎn)誘變后的AQP4 cDNA經(jīng)測(cè)序確認(rèn)相關(guān)變異位點(diǎn)。采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000法將以上構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，采用含0.8 g/L G418(Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基篩選細(xì)胞2周并經(jīng)流式細(xì)胞儀分選，使細(xì)胞GFP穩(wěn)定表達(dá)率在80%左右。

1.3.4 血清抗AQP4抗體滴度 血清抗AQP4抗體滴度的檢測(cè)參照TAKAHASHI等[8]方法，利用細(xì)胞分析法，將患者血清稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000(抗體滴度水平≥1∶256作為陽性)的比例。以兔抗人AQP4抗體為一抗(1∶2 000，Millipore公司)、山羊抗兔IgG為二抗(1∶1 000，Millipore公司)作為陽性對(duì)照。吸光度≥0.31為陽性，<0.31為陰性。基因分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)AQP4基因SNP位點(diǎn)，分別為R108T、I110N、E280R、D281R、P295R、E317M。為探討變異位點(diǎn)與視神經(jīng)脊髓炎的關(guān)系，進(jìn)一步采用定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)AQP4 cDNA的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，根據(jù)前述，采用單點(diǎn)突變及雙點(diǎn)突變構(gòu)建了6種不同的突變質(zhì)粒，即R108T、I110N、R108T/I110N、E280R/D281R、P295R、E317M。同時(shí)以無突變位點(diǎn)質(zhì)粒構(gòu)建細(xì)胞株作為原始細(xì)胞株，定點(diǎn)誘變后的AQP4 cDNA經(jīng)測(cè)序確認(rèn)相關(guān)變異位點(diǎn)。確認(rèn)變異位點(diǎn)后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將6種含有變異位點(diǎn)的質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建與突變位點(diǎn)相應(yīng)的6組細(xì)胞株。細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)AQP4及GFP后檢測(cè)血清抗AQP4抗體滴度。

2 結(jié)果

2.1 目的序列PCR及SNP分析 對(duì)視神經(jīng)脊髓炎患者外周血進(jìn)行AQP4基因外顯子區(qū)域的測(cè)序結(jié)果顯示，在AQP4基因2號(hào)、5號(hào)外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，而其余3個(gè)外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，多發(fā)性硬化組均未發(fā)現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)(見表2)。

2.2 視神經(jīng)脊髓炎患者血清抗AQP4抗體滴度分析 使用上述構(gòu)建的6種突變細(xì)胞株和原始細(xì)胞株對(duì)視神經(jīng)脊髓炎患者血清進(jìn)行抗AQP4抗體滴度定量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：R108T、I110N、P295R細(xì)胞株與原始細(xì)胞株間血清抗AQP4抗體滴度水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；R108T/I110N、E280R/D281R、E317M細(xì)胞株與原始細(xì)胞株間血清抗AQP4抗體滴度水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表2 AQP4基因外顯子SNP位點(diǎn)情況及各組分布

注：SNP=單核苷酸多態(tài)性，R=精氨酸，T=蘇氨酸，I=異亮氨酸，N=天冬酰胺，E=谷氨酸，D=天冬氨酸，P=脯氨酸，M=甲硫氨酸

表3 視神經(jīng)脊髓炎患者6種突變細(xì)胞株與原始細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度水平比較

Table 3 Comparison of serum antibody titers level of anti-AQP4 between six mutated cell lines and original cell lines in patients with NMO

組別例數(shù)血清抗AQP4抗體滴度對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(x±s)t值aP值原始細(xì)胞株721∶1000～1∶2500317±054--R108T721∶1000～1∶2000314±0331045057I110N721∶1000～1∶1500318±0310765072R108T/I110N721∶512～1∶1500302±0214132004E280R/D281R721∶512～1∶1500303±0094077004P295R721∶1000～1∶2000311±0410825068E317M721∶512～1∶1500305±0164875003

注：a為與原始細(xì)胞株比較；-為無此數(shù)據(jù)

2.3 視神經(jīng)脊髓炎組與多發(fā)性硬化組不同細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度陽性率比較 視神經(jīng)脊髓炎組與多發(fā)性硬化組中原始細(xì)胞株及R108T、I110N、R108T/I110N、E280R/D281R、P295R、E317M細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

3 討論

視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病機(jī)制涉及遺傳和環(huán)境多種致病因素。本研究從基因水平探討了其發(fā)病機(jī)制，AQP4基因包含有5個(gè)外顯子，分別編碼相對(duì)分子量為31 000和34 000的兩種蛋白。腦組織中主要為相對(duì)分子量為34 000的M23型[9]，高表達(dá)部位主要位于血-腦脊液屏障、腦-腦脊液屏障附近，在與血管及軟膜相接的星形細(xì)胞足突上表達(dá)密度最高，呈“極化表達(dá)”現(xiàn)象[10-13]。相關(guān)研究提示在諸如視神經(jīng)頭、腦室系統(tǒng)周圍的室管膜部位的血-腦脊液屏障結(jié)構(gòu)相對(duì)不完整，同時(shí)這些部位也是某些AQP4蛋白的高表達(dá)部位，從而使這些部位成為潛在的血漿抗體接觸通道[14]。PITTOCK等[15-16]研究表明，在影像學(xué)上視神經(jīng)脊髓炎中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘的好發(fā)部位與AQP4的高表達(dá)部位均有良好的一致性。

基于多項(xiàng)研究成果，WINGERCHUK[17]提出視神經(jīng)脊髓炎致病機(jī)制：在視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病過程中，AQP4-Ab與AQP4胞外段結(jié)構(gòu)結(jié)合導(dǎo)致IgG與靶抗原結(jié)合后內(nèi)化，從而進(jìn)一步介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。故目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為視神經(jīng)脊髓炎即為抗體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)[2]?？笰QP4抗體在這一機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其靶抗原AQP4也日益得到重視。

就目前研究所知，關(guān)于多發(fā)性硬化與HLA基因的關(guān)系已有諸多研究[18-19]，而對(duì)AQP4基因水平的變化與疾病的關(guān)系研究較少。SORANI等[20]通過對(duì)188例志愿者的血樣進(jìn)行AQP4的基因分析發(fā)現(xiàn)了24個(gè)變異位點(diǎn)，其中9個(gè)位點(diǎn)位于編碼區(qū)域；通過對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變后蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了AQP4對(duì)水的通透性降低，1個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致了AQP4對(duì)水的通透性增加。而KLEFFNER等[21]通過對(duì)41例大腦中動(dòng)脈梗死患者進(jìn)行AQP4基因分析后發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNP位點(diǎn)，其中1個(gè)位點(diǎn)(rs9951307)與大腦中動(dòng)脈梗死以后的腦水腫嚴(yán)重程度相關(guān)。以上研究顯示AQP4基因水平發(fā)生的變化在相關(guān)疾病中均扮演了重要角色，但AQP4基因水平變化與視神經(jīng)脊髓炎患者發(fā)生的關(guān)系研究尚較少。國內(nèi)麥衛(wèi)華等[22]研究發(fā)現(xiàn)AQP4啟動(dòng)子0中的1003點(diǎn)突變(A-G)、AQP4啟動(dòng)子1中的400位點(diǎn)與401位點(diǎn)間的插入突變與多發(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎易患性相關(guān)。而MATIELLO等[23]研究并未發(fā)現(xiàn)與視神經(jīng)脊髓炎呈相關(guān)性的AQP4 SNP位點(diǎn)。因此有關(guān)研究結(jié)果仍有爭(zhēng)議。

基因水平的突變，尤其是非同義的突變會(huì)影響到其所表達(dá)的肽段一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化并可能會(huì)在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，如遺傳痙攣性截癱中常見的突變位點(diǎn)His139Tyr、Trp144Term等位點(diǎn)突變均參與了發(fā)病[24]。本研究發(fā)現(xiàn)位于2號(hào)和5號(hào)外顯子區(qū)域共6個(gè)SNP位點(diǎn)，突變的單核苷酸位點(diǎn)為R108T、I110N、E280R、D281R、P295R及E317M。6個(gè)核苷酸位點(diǎn)均為非同義突變，且突變的結(jié)果均導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生變化，其變異結(jié)果必然會(huì)對(duì)相應(yīng)一級(jí)結(jié)構(gòu)肽段產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)AQP4基因的不同表達(dá)亞型在檢測(cè)血清抗體滴度時(shí)存在較大差異[2]，這也佐證了作者的設(shè)想：基因水平的差異或變化可能會(huì)影響相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合的強(qiáng)度，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)AQP4蛋白的不同部位其抗原性具有較大差異，其胞外段作為與抗AQP4抗體的結(jié)合部位，其胞外LoopE與抗體具有更高的親和性[25]；盡管本研究發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)距這一高親和性結(jié)構(gòu)域相對(duì)較遠(yuǎn)，但這是否可以潛在地改變LoopE的親和性還有待于進(jìn)一步研究。

表4 視神經(jīng)脊髓炎組與多發(fā)性硬化組不同細(xì)胞株血清抗AQP4抗體滴度陽性率比較〔n(%)〕

本研究檢測(cè)的視神經(jīng)脊髓炎組抗AQP4抗體陽性率為75.0%，提示國內(nèi)人群視神經(jīng)脊髓炎患者抗AQP4抗體陽性率水平較國外報(bào)道水平偏低[26]，而目前我國視神經(jīng)脊髓炎診斷標(biāo)準(zhǔn)是基于歐美國家研究結(jié)果所制定，鑒于人種不同所導(dǎo)致的相關(guān)研究結(jié)果差異，因此提示目前現(xiàn)行的診斷標(biāo)準(zhǔn)可能并不完全適用于我國人群，如何進(jìn)一步行隨機(jī)多中心雙盲的相關(guān)研究以確定適合于我國甚至是亞洲人群的視神經(jīng)脊髓炎診斷標(biāo)準(zhǔn)是個(gè)亟待解決的課題。另外，本研究中多發(fā)性硬化組有4例患者檢測(cè)到抗AQP4抗體陽性，可能提示其與抗AQP4抗體陰性的多發(fā)性硬化患者有不同的發(fā)病機(jī)制，其轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況如何，本文作者將繼續(xù)給予追蹤隨訪。

視神經(jīng)脊髓炎患者AQP4基因水平的非同義突變可以導(dǎo)致其所編碼的氨基酸發(fā)生變化，進(jìn)而影響外周血抗體與靶抗原AQP4的結(jié)合強(qiáng)度，表現(xiàn)為試驗(yàn)結(jié)果中不同變異位點(diǎn)細(xì)胞株所檢測(cè)的滴度水平具有組間差異，這樣的突變是否參與了視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。基因水平的變化所引起的微小結(jié)構(gòu)改變可能會(huì)導(dǎo)致其抗原性產(chǎn)生相應(yīng)的變化，因此從基因水平來探討視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)很好的研究靶點(diǎn)。由于本研究僅對(duì)AQP4基因的1、2、3、4、5號(hào)共5個(gè)外顯子進(jìn)行了相關(guān)的SNP位點(diǎn)分析，且由于樣本量有限，獲得的SNP位點(diǎn)信息有限，今后應(yīng)進(jìn)一步對(duì)AQP4基因啟動(dòng)子區(qū)域SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，從而完成對(duì)AQP4基因的全部外顯子及啟動(dòng)子SNP位點(diǎn)分析后再進(jìn)行單體型相關(guān)分析。

作者貢獻(xiàn)：王青松、王浩進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；王青松、戴慶箐、王浩進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；徐竹、張藝凡、楚蘭進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]DEVIC E.Subacute myelitis complicated by optic neuritis [J].Bull Med(Paris),1894,8(5):1033-1034.

[2]LENNON V A,WINGERCHUK D M,KRYZER T J,et al.A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis[J].Lancet，2004,364(9451):2106-2112.

[3]LENNON V A，KRYZER T J,PITTOCK S J，et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel[J].J Exp Med，2005,202(4):473-477.

[4]KIRA J.Neuromyelitis optica and opticospinal multiple sclerosis:mechanisms and pathogenesis[J].Pathophysiology,2011,18(1):69-79.

[5]LIM B C,HWANG H,KIM K J,et al.Relapsing demyelinating CNS disease in a Korean pediatric population:multiple sclerosis versus neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2011,17(1):67-73.

[6]WINGERCHUK D M,LENNON V A，PITTOCK S J，et al.Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica[J].Neurology，2006,66(10):1485-1489.

[7] POLMAN C H,REINGOLD S C,EDAN G，et al.Diagnostic criteria for multiple sclerosis:2005 revisions to the "McDonald Criteria" [J].Ann Neurol,2005,58(6):840-846.

[8]TAKAHASHI T，F(xiàn)UJIHARA K，NAKASHIMA I,et al.Establishment of a new sensitive assay for anti-human aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica [J].Tohoku J Exp Med,2006，210(4):307-313.

[9]HIROAKI Y，TANI K，KAMEGAWA A,et al.Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion[J].Mol Biol，2006,355(4):628-639.

[10]AMIRY-MOGHADDAM M，XUE R，HAUG F M，et al.Alpha-syntrophin delietion removes the pervascular but not endothelial pool of aquaporin-4 at the blood-brain barrier and delays the development of brain edema in an experimental model of acute hyponatremia [J].FASEB J,2004,18(3):542-544.

[11]CAVAZZIN C，F(xiàn)ERRARI D，F(xiàn)ACCHETTI F，et al.Unique expression and localization fo aquaporin-4 and aquaporin-9 in murine and human neural stem cells and in their glial progeny[J].Glia，2005,53(2):167-181.

[13]牛會(huì)叢，張星虎.視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病機(jī)制及治療策略研究進(jìn)展[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2013,20(3):208-211. NIU H C,ZHANG X H.Research progress of pathogenic mechanisms and therapeutic strategies of neuromyelitis optica[J].Chinese Journal of Neuroimmunology and Neurology,2013,20(3):208-211.DOI:10.3969/j.issn.1006-2963.2013.03.015.

[14]FUJIHARA K.Neuromyelitis optica and astrocytic damage in its pathogenesis[J].J Neurol Sci,2011,306(1/2):183-187.

[15]PITTOCK S J,WEINSHENKER B G,LUCCHINETTI C F,et al.Neuromyelitis optica brain lesions localized at sites of high aquaporin 4 expression[J].Arch Neurol,2006,63(3):964-968.

[16]PITTOCK S J,LENNON V A,KRECKE K,et al.Brain abnormalities in neuromyelitis optica [J].Arch Neurol，2006,63(3):390-396.

[17]WINGERCHUK D M.Neuromyelitis optica:new findings on pathogenesis[J].Int Rev Neurobiol，2007，79(1):665-688.

[18]DEAN G,YEO T W,GORIS A,et al.HLA-DRB1 and multiple sclerosis in Malta[J].Neurology，2008,70(2)：101-105.

[19]MCELROY J P,CREE B A,CAILLIER S J,et al.Refining the association of MHC with multiple sclerosis in African Americans[J].Hum Mol Genet,2010,19(15)：3080-3088.

[20]SORANI M D,ZADOR Z，HUROWITZ E，et al.Novel variants in human Aquaporin-4 reduce cellular water permeability[J].Hum Mol Genet，2008，17(15):2379-2389.

[21]KLEFFNER I,BUNGEROTH M，SCHIFFBAUER H，et al.The role of aquaporin-4 polymorphisms in the development of brain edema after middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,2008,39(4):1333-1335.

[22]麥衛(wèi)華,胡學(xué)強(qiáng),龍友明，等.水通道蛋白4啟動(dòng)子基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎遺傳易患性的關(guān)系[J].中華神經(jīng)科雜志,2012,45(5):312-317. MAI W H,HU X Q,LONG Y M，et al.Associations of aquaporin-4 promoter polymorphism to multiple sclerosis and neuromyelitis optica in southern Chinese population[J].Chinese Journal of Neurology,2012,45(5):312-317.

[23]MATIELLO M,HEBRINK D,JACOB A,et al.Genetic analysis of AQP4 in neuromyelitis optica patients[J].Mult Scler,2007,13(Suppl 7):S196-197.

[24]STEVANIN G,RUBERG M,BRICE A.Recent advances in the genetics of spastic paraplegias[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2008,8(3)：198-210.

[25]HIROAKI Y，TANI K，KAMEGAWA A，et al.Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion[J].J Mol Biol，2006，355(4):628-639.

[26]WATERS P,JARIUS S,LITTLETON E,et al.Aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica and longitudinally extensive transverse myelitis[J].Arch Neurol,2008,65(7):913-919.

(本文編輯：陳素芳)

Single Nucleotide Polymorphic Site of Aquaporin-4 Gene in Patients with Neuromyelitis Optica

WANGQing-song1,DAIQing-qing2,WANGHao2,XUZhu2,ZHANGYi-fan2,CHULan2*

1.DepartmentofNeurology,XiangyangHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Xiangyang441000,China2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

*Correspondingauthor:CHULan,Chiefphysician，Professor，Doctoralsupervisor;E-mail:chulan8999@sohu.com

Objective To study the single nucleotide polymorphic(SNP) site in exon region of aquaporin-4(AQP4) gene and its possible effects on the pathogenesis of neuromyelitis optica(NMO)based on gene level.Methods 72 patients with NMO who were treated in Xiangyang Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine from March 2010 to June 2012 were selected as NOM group,and 80 patients with multiple sclerosis admitted to this hospital during the same period were treated as multiple sclerosis group.The SNP site analysis of AQP4 was made to the whole blood DNA,and site-directed mutagenesis was conducted to the recombinant plasmid of plasmid enhanced green florescence protein(pEGFP) that carried AQP4 gene expression sequence by specific site-directed mutagenesis.The corresponding mutated plasmids were generated according to mutation of relevant SNP sites,and lipofection transfection method was used to build anti-AQP4 antibodies of the corresponding plasmid transfected cells so as to detect the cell line.The difference of serum antibody titers level of anti-AQP4 between six mutated cell lines and original cell lines in patients with NMO and positive rate of antibody titer of serum anti-AQP4 of different cell lines between NMO and multiple sclerosis groups were both analyzed.Results Six SNP sites of AQP4 gene were found in NMO group,which were located in exon 2 and 5,they were R108T,I110N,E280R,D281R,P295R and E317M.SNP sites of AQP4 gene were not found in exon 1,3 and 4,and no corresponding SNP sites of AQP4 gene was found in the multiple sclerosis group.Builded the R108T,I110N,R108T/I110N,E280R/D281R,P295R,E317M cell lines.There was significant difference in the antibody titer level of serum anti-AQP4 between the R108T/I110N,E280R/D281R,E317M and the original cell lines(P<0.05).There was significant difference in the positive rate of serum anti-AQP4 antibodies of the original cell lines and cell lines R108T,I110N,R108T/I110N,E280R/D281R,P295R,E317M between NMO group and multiple sclerosis group(P<0.05).Conclusion The SNP sites of AQP4 gene in patients with NMO may lead to changes in the primary structure of expressing protein and can change its antigenicity.The different intensity of the antigen-antibody reaction may be the reason of the difference in titers between mutation groups.

Neuromyelitis optica；Aquaporin 4；Polymorphism,single nucleotide

貴州省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LG字[2011]004號(hào))

R 744.52

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.03.013

2016-07-24；

2016-12-13)

1.441000 湖北省襄陽市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2.550004 貴州省貴陽市，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

*通信作者：楚蘭，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師；E-mail:chulan8999@sohu.com