寨卡病毒包膜prM-E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析

盧 昌，李 娜，薛 璞，李 楠，陳 平

寨卡病毒包膜prM-E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析

盧 昌1,2，李 娜1，薛 璞2，李 楠1,2，陳 平1,2

包膜蛋白prM-E是黃病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有許多病毒的表面抗原，與病毒的致病力和宿主嗜性有關(guān)，但目前對(duì)寨卡病毒的prM-E蛋白研究很少，作者利用生物信息學(xué)方法對(duì)寨卡病毒的E蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，重點(diǎn)闡述了prM-E蛋白在黃病毒形成病毒樣顆粒過程中的應(yīng)用，并對(duì)寨卡病毒病毒樣顆粒的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

ZIKV；登革熱病毒；包膜蛋白prM-E

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一種由蚊子傳播的蟲媒病病毒，可以導(dǎo)致新生兒“小頭癥”。該病毒最早于1947年發(fā)現(xiàn)于烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴體內(nèi)，隨后于1948年在非洲伊蚊體內(nèi)分離得到寨卡病毒，1956年學(xué)者通過喂食小鼠和猴子感染ZIKV的伊蚊，成功地復(fù)制了ZIKV的感染[1]。在1968年和1971年至1975年間在尼日利亞人體內(nèi)分離得到ZIKV，血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，40%尼日利亞人ZIKV血清抗體為陽(yáng)性。該病毒的活動(dòng)一直比較隱秘，僅存在于赤道周圍的非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)[2]。2015年和2016年，ZIKV在巴西引起了疫情，WHO將該病毒列為國(guó)際緊急衛(wèi)生事件[3]。迄今為止，還沒有防治ZIKV的有效方法，因此迫切地需要開發(fā)防治ZKIV的疫苗。

1 ZIKV的組裝和成熟

ZIKV屬于黃病毒科黃病毒屬，與所有黃病毒科成員一樣含有單股正鏈RNA基因組，其功能如同mRNA，編碼病毒聚蛋白。該病毒編碼的多聚蛋白與其他黃病毒科成員一樣，可以在宿主細(xì)胞蛋白酶和自身的非結(jié)構(gòu)蛋白作用下裂解成為3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制和后期病毒粒子的組裝，而其結(jié)構(gòu)蛋白可以在宿主細(xì)胞因子的作用下包裝成為成熟的病毒粒子[4]。

當(dāng)ZIKV入侵宿主細(xì)胞時(shí)，E蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合誘導(dǎo)病毒粒子包膜與細(xì)胞膜融合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor-mediated endocytosis，RMF)使核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5]。ZIKV的RNA完成復(fù)制以后，在宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近被衣殼蛋白C包繞形成核衣殼。研究發(fā)現(xiàn)，黃病毒衣殼蛋白C的N端有一段信號(hào)肽序列，可以識(shí)別病毒的RNA，使衣殼蛋白C形成二聚體，最終組裝成核衣殼[6]。然而，黃病毒核衣殼形成的具體機(jī)理還不太清楚。隨后，核衣殼可能通過芽生方式獲得包膜，與prM和E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)組裝成未成熟的病毒粒子。未成熟的病毒粒子警報(bào)外分泌途徑裝運(yùn)，在高爾基體外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的低pH值條件下，prM被弗林蛋白酶裂解成為M蛋白，使包膜蛋白發(fā)生重排，形成具有感染性的病毒粒子[7]。

2 ZIKV包膜蛋白prM-E二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KU321639基因組序列，下載包括ZKIV的prM和E蛋白氨基酸序列，同時(shí)下載登革熱1型病毒(dengue virus 1，DENV-1)、登革熱2型病毒(dengue virus 2，DENV-2)、登革熱3型病毒(dengue virus 3，DENV-3)、登革熱4型病毒(dengue virus 4，DENV-4)和日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的prM和E蛋白氨基酸序列。通過DNAStar的MegAlign軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在ZIKV的E蛋白的C端存在著兩段比較保守區(qū)域，分別位于338-358和463-473區(qū)段(見圖2)。DENV研究發(fā)現(xiàn)，黃病毒科的prM-E蛋白結(jié)構(gòu)相似，在膜蛋白的C端都存在有α螺旋結(jié)構(gòu)(M-H、E-H1和E-H2)和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(M-T1、M-T2、E-T1、E-T2)，E蛋白的E-H1和E-H2之間存在著一段整個(gè)黃病毒科成員都比較保守的結(jié)構(gòu)區(qū)(LGDTAWDFGS)(見圖1、圖2和圖3)[8]。E蛋白的N端含有3個(gè)球蛋白結(jié)構(gòu)域(EDⅠ、EDⅡ和EDШ)，參與ZIKV的分子識(shí)別，EDⅠ和EDШ直接存在一端比較保守的區(qū)域[9]。

圖1 ZIKV、DENV-2、DENV-3、DENV-4的prM/M蛋白氨基酸的多序列比對(duì)Fig.1 Alignment of flavivirus premembrance/membrance amino acid sequences

圖2 ZIKV、DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4、JEV的E蛋白氨基酸的多序列比對(duì)Fig.2 Alignment of flavivirus envelope amino acid sequences

圖3 ZIKV的prM-E蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted structure of Zika virus premembrane and envelop protein

使用DNAStar的Protean軟件對(duì)prM和E蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，prM蛋白130-145和150-170區(qū)間，M蛋白的460-475和405-500區(qū)間各存在兩個(gè)比較明顯的疏水性區(qū)域，該區(qū)段可能存在兩個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。而在prM蛋白的85-130區(qū)間，E蛋白的330-460區(qū)間可能有著明顯的α螺旋結(jié)構(gòu)域。通過ExPASy的Phobius軟件進(jìn)一步對(duì)prM和E蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，在prM和E蛋白的C端各存在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與Protean的預(yù)測(cè)結(jié)果相似。綜合以上的分析結(jié)果可以預(yù)測(cè)在ZIKV的prM-E蛋白中存在著黃熱病毒prM-E蛋白所特有的特征。

因而，可以預(yù)測(cè)包膜蛋白E是ZIKV的主要包膜糖蛋白，含有多種B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，是ZIKV的主要保護(hù)性抗原。此外，包膜蛋白E還可能參與ZIKV入侵宿主細(xì)胞、膜融合、誘導(dǎo)中和抗體、紅細(xì)胞凝集等生物學(xué)功能。EDⅠ由位于E蛋白單體中心區(qū)域的β結(jié)構(gòu)組成，其一端與指樣結(jié)構(gòu)的EDⅡ相連接，而EDШ是IgG免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)，能夠誘導(dǎo)中和抗體，是主要的抗原區(qū)域。此外，EDⅠ和EDШ直接的連接區(qū)域可以形成不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，可能與病毒粒子的包裝有關(guān)[10]。黃病毒E蛋白的N-糖基化位點(diǎn)與病毒的感染力和組裝密切相關(guān)，序列分析發(fā)現(xiàn)ZIKV的E蛋白Asn-154屬于糖基化的位點(diǎn)[11]。Oumar等對(duì)已鑒定的ZIKV病毒序列進(jìn)行多序列分析發(fā)現(xiàn)，ZIKV的MR766株的E蛋白上沒有該糖基化位點(diǎn)，這可能與該毒株感染伊蚊有關(guān)，直接影響了該毒株的地方流行性[12]。

prM和E蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(M-T1和M-T2、E-T1和E-T2)可在細(xì)胞膜內(nèi)形成反向平行結(jié)構(gòu)，而且α螺旋結(jié)構(gòu)(M-H、E-H1和E-H2)平行分布于脂質(zhì)雙分子層外側(cè)，中和M、E蛋白與磷脂雙分子層之間的靜電排斥力，穩(wěn)定M和E蛋白組裝成病毒粒子。此外，E-T1具有膜定位作用，是E蛋白形成VLP必要的條件，E-T2是NS1的作用信號(hào)肽，利于E蛋白形成VLP，而E-H2可以穩(wěn)定prM-E異物二聚體結(jié)構(gòu)。在衣殼蛋白C和包膜蛋白prM連接處存在著兩個(gè)切割位點(diǎn)，與登革熱病毒相似，位于胞質(zhì)側(cè)的prM信號(hào)肽可以通過NS2B/NS3的切割激活，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)的信號(hào)肽可以被宿主細(xì)胞酶識(shí)別切割。在缺少衣殼蛋白C時(shí)，prM難以正確定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，位于胞質(zhì)側(cè)的信號(hào)肽序列無法正確地被切割[13]。

3 黃病毒VLPs的研究進(jìn)展

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的多個(gè)拷貝按照一定的方式排列，通過自我組裝的方式形成的不含有感染力的，與病毒粒子相似的顆粒樣物質(zhì)。VLPs不含病毒基因組，因此不具有感染能力，但是它幾乎含有病毒所有的抗原表位，能夠順利的進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，模仿病毒產(chǎn)生自然感染的免疫能力[14-15]。其次，VLPs作為疫苗的安全性和保護(hù)率高于目前的所使用的滅活疫苗和弱毒疫苗，這些優(yōu)點(diǎn)使得VLPs是目前為止最具有優(yōu)勢(shì)的候選疫苗。目前有多重病毒的VLPs得到了很好的研究，如口蹄疫病毒[16]、豬圓環(huán)病毒[17]、人類免疫缺陷病毒[18]、人乳頭瘤病毒[19]、登革熱病毒等[20]。

目前黃病毒科的登革熱病毒空衣殼的研究比較透徹，包膜蛋白prM和E共表達(dá)時(shí)可以形成病毒樣顆粒VLP。而然，在登革熱2型病毒VLP表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn)，其E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)含有較強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，阻礙了分泌型VLP的形成。E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)位于其C端的20%，該結(jié)構(gòu)區(qū)包括E-H1、E-H2、E-T1、E-T2區(qū)域。研究者將登革熱2型病毒E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)用日本乙型腦炎病毒E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)替代，在VLP表達(dá)過程檢測(cè)到了分泌型的VLP。該結(jié)果表明，日本乙型腦病毒的Stem-achor結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)比較弱，可形成分泌型的VLP。然而，用日本乙型腦炎病毒E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)替代登革熱4型病毒E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)，登革熱4型病毒的分泌型VLP有所降低，這可能與黃病毒的跨膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。但是，在登革熱2型病毒自然感染過程可以形成成熟的病毒粒子，這可能與C蛋白的結(jié)構(gòu)功能有關(guān)，具體原理還不清楚[21-23]。Devid等對(duì)登革熱2型病毒E蛋白的Stem-achor結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)I407L、M410A、M421L可以增加E蛋白二聚體的疏水性和靈活性，大大地增加了VLP的分泌[8]。

4 ZIKV新型疫苗的研究展望

腺病毒感染的宿主細(xì)胞范圍比較廣泛，其感染后可以在體內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體滴，因而重組腺病毒載體是十分理想的活載體疫苗。復(fù)制缺陷型腺病毒載體可以包裝、表達(dá)較大的外源抗原蛋白，且外源基因不能再接種體內(nèi)復(fù)制，具有較高的安全性。相比較于裸質(zhì)粒DNA和痘病毒載體，重組腺病毒載體所引起的機(jī)體免疫反應(yīng)較強(qiáng)，已被廣泛用于研制口蹄疫病毒[16]、流感病毒[24]、瘧疾的疫苗[25]。然而，是否能夠利用復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)ZIKV的VLPs需要進(jìn)一步的試驗(yàn)分析。

ZIKV病毒的組裝發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，C和prM之間的信號(hào)肽序列可以指導(dǎo)prM蛋白正確地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，從而被病毒的NS2B/NS3蛋白酶和宿主細(xì)胞的信號(hào)肽酶切割。在單獨(dú)表達(dá)ZIKV的prM蛋白和E蛋白時(shí)，需要在prM蛋白前加一段信號(hào)肽序列。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇一段來源于乙型腦炎病毒C末端的信號(hào)肽序列MGKRSAGSIMWLASLAVVIACAGA，通過軟件分析發(fā)現(xiàn)該序列可以作為ZKIV的prM的有效信號(hào)肽，切割位點(diǎn)可能位于信號(hào)肽和prM之間。

ZIKV的E蛋白擁有與登革熱病毒E蛋白相似的結(jié)構(gòu)，其410L和421M與登革熱病毒E蛋白一樣，但是其407A與日本乙型腦炎病毒E蛋白相似。寨卡病毒的E蛋白C端是否具有強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，prM和E蛋白表達(dá)后是否能夠形成分泌型的VLP，E蛋白Stem-achor結(jié)構(gòu)被日本乙型腦炎病毒替代后VLP分泌量是否會(huì)增加還不清楚，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明。

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Function and structure analysis of premembrane and envelope proteins of Zika virus

LU Chang1,2, LI Na1, XUE Pu2, LI Nan1,2, CHEN Ping1,2

(1.HebeiAnyuTechnologyCo.,LTD,Langfang065500,China;2.JiaxingAnyuBiologicalTechnologyCo.,LTD,Jiaxing314000,China)

The premembrane and envelope proteins (prM-E), which contains the mainly protective antigen related with virulence and tropism, are the primary structural protein of flavivirus. However, prM-E in ZIKV is rarely understood. We have analyzed the structure and biological effects of prM-E in ZIKV by bionformatics methods. The prM-E proteins virus-like particles of dengue virus was introduced in the present. Then, the prM-E proteins virus-like particles of ZIKV was prospected.

ZIKV; dengue virus; premembrane and envelope proteins

Chen Ping, Email: pchen8513@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.015

陳平，Email：pchen8513@sina.com

1. 河北安宇科技有限公司，廊坊 065500； 2. 嘉興安宇生物科技有限公司，嘉興 314000

R373.9

A

1002-2694(2017)01-0081-04

2016-05-09；編輯：劉岱偉