2013-2014年福州市環(huán)境污水應(yīng)用于腸道病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果分析

楊秀惠，朱旺峰，蔡少健，周 勇，嚴(yán)延生

2013-2014年福州市環(huán)境污水應(yīng)用于腸道病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果分析

楊秀惠1,2，朱旺峰1,3，蔡少健1,2，周 勇1,2，嚴(yán)延生1,2

目的 了解環(huán)境污水監(jiān)測(cè)對(duì)腸道病毒(Enterovirus,EV)相關(guān)疾病防控的意義和作用。方法 選擇福州祥板和洋里兩個(gè)污水處理廠作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，每月采集進(jìn)口污水各1份，應(yīng)用陰離子膜進(jìn)行污水濃縮，接種RD、L20B和HEp-2進(jìn)行病毒分離，微量血清中和試驗(yàn)及RT-PCR確定其血清型，VP1測(cè)序遺傳特征分析。結(jié)果 2013-2014年采集的48份污水標(biāo)本中44份(91.67%)病毒分離陽(yáng)性，分離到268株病毒，已鑒定涵蓋22個(gè)血清型；病毒分離高峰期為2-7月，較監(jiān)測(cè)病例高峰早約2個(gè)月。2013年?？啦《?Echovirus，Echo)7型為優(yōu)勢(shì)血清型(43.61%)，2014 年轉(zhuǎn)變?yōu)镋cho6占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(62.96%)；遺傳特征分析顯示：Echo6和Echo7污水分離株較同時(shí)期病例分離株更為多樣；病例株與污水株具高度同源性，在遺傳進(jìn)化樹(shù)圖位于同一個(gè)分支。結(jié)論 環(huán)境污水應(yīng)用于腸道病毒監(jiān)測(cè)，較現(xiàn)有的病例監(jiān)測(cè)更為敏感。

污水；腸道病毒；監(jiān)測(cè)；遺傳特征

人類(lèi)腸道病毒(human enterovirus，HEV)屬于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬，有100多個(gè)血清型，分為HEV-A～D 4組[1]。大部分感染表現(xiàn)為無(wú)癥狀隱性感染或僅輕微呼吸道、胃腸道癥狀，重癥如腦干腦炎、腦膜炎、急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)、心肌炎、手足口病(hand-foot and mouth disease，HFMD)等雖不多見(jiàn)但常見(jiàn)于以免疫功能較為不健全的嬰幼兒。感染疾病譜廣且無(wú)血清型特異性，表現(xiàn)為同一血清型可有不同的臨床表現(xiàn)，如腸道病毒71型(EV71)既能引起HFMD，也能引起AFP、腦干腦炎等；不同血清型可導(dǎo)致相同的疾病，如柯薩奇病毒(Coxsackievirus A,CVA)6型、CVA10、CVA16、EV71等均可導(dǎo)致HFMD，脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)、EV71及部分Echo均能導(dǎo)致AFP。近年來(lái)，我國(guó)手足口病的流行和部分地區(qū)病毒性腦炎的暴發(fā)等事件反映了腸道病毒感染已成為嚴(yán)重影響兒童的身心健康與社會(huì)穩(wěn)定公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。

腸道病毒血清型及疾病譜復(fù)雜，以臨床標(biāo)本為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)存在其局限性，環(huán)境污水監(jiān)測(cè)可補(bǔ)充其不足，并將監(jiān)測(cè)窗口前移約3月，起到疾病預(yù)警預(yù)測(cè)作用[2]。福建省地處亞熱帶，是HEV高流行區(qū)域。為了解環(huán)境污水監(jiān)測(cè)對(duì)腸道病毒相關(guān)疾病防控的意義，2013年開(kāi)始選擇福建省會(huì)城市福州做為監(jiān)測(cè)點(diǎn)開(kāi)展相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 污水標(biāo)本來(lái)源 選擇福州市祥坂和洋里兩所污水處理廠為監(jiān)測(cè)點(diǎn), 服務(wù)面積和人口分別為19 km2、約20萬(wàn)人和58 km2、近100萬(wàn)人；服務(wù)范圍基本涵蓋了福州市主城區(qū)，含鼓樓區(qū)、臺(tái)江區(qū)和大部分晉安區(qū)。每月中旬于入口處采集污水標(biāo)本約1 L，低溫冷藏運(yùn)送至福建省疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室，48 h內(nèi)完成濃縮處理。

1.2 病例標(biāo)本來(lái)源 陽(yáng)性病例標(biāo)本來(lái)源于福建省AFP病例、HFMD和無(wú)菌性腦炎病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

1.3 標(biāo)本處理及濃縮 采用陰離子膜吸附-堿洗脫法進(jìn)行濃縮處理和洗脫[3]，獲得2次洗脫液，用0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾后接種敏感的細(xì)胞或于-50 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離及型別鑒定 濃縮處理后的污水標(biāo)本同時(shí)接種L20B、RD 和Hep-2 3種細(xì)胞，每種細(xì)胞各8管，每管200 μL。置36.5 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)，7 d為1代，連續(xù)2代。當(dāng)CPE達(dá)到75%以上時(shí)收獲病毒，置-20 ℃以下保存。陽(yáng)性孔病毒先用荷蘭國(guó)家公共健康與環(huán)境保護(hù)研究所(The National Institute for Public Health and Enviroment Protection，the Netherlands；RIMV)提供的EV組合血清進(jìn)行微量血清中和試驗(yàn)定型，未能定型的標(biāo)本再應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和序列分析法定型，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5-6]。

1.5 VP1基因序列分析 參照文獻(xiàn)[5-6]方法對(duì)陽(yáng)性分離物進(jìn)行腸道病毒VP1基因序列全長(zhǎng)擴(kuò)增，陽(yáng)性產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用sequencher軟件進(jìn)行序列分析校正整理，用Bioedit軟件進(jìn)行序列比對(duì)及同源性分析，用Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，建樹(shù)Model參數(shù)選擇為遺傳距離，建樹(shù)方法為neighbor-joining法，以bootstrap法評(píng)價(jià)樹(shù)結(jié)構(gòu)，參數(shù)選擇1 000。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定 2013-2014年兩個(gè)污水處理廠共采集標(biāo)本48份，44份(91.67%)病毒分離陽(yáng)性。共接種細(xì)胞1 152管，260管(22.6%)分離到病毒株；除1管為非腸道病毒及8管尚無(wú)法鑒定其型別外，251管定型成功，其中16管(15管兩型混合，1管三型)為混合病毒；其他235管均為單型，共分離到268株病毒。兩個(gè)污水處理廠總病毒分離率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.08，P=0.78)。

病毒株涵蓋22個(gè)血清型，224株(86.5%)為HEV-B組；44株(13.5%)屬C組，主要為三型脊灰疫苗株病毒(表1)；未分離到A和D組血清型病毒。所有血清型中，2013年Echo 7占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，達(dá)43.9%，Echo 6為第二優(yōu)勢(shì)株(14.3%)；2014年Echo 6(占66.9%)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)株；脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)共43株，經(jīng)鑒定均為疫苗相關(guān)病毒株，其中以PV2為優(yōu)勢(shì)，占55.8%(表1)，這與福建省往年AFP病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)結(jié)果相符[8]。

圖1 2013-2014年福州污水病毒株分離時(shí)間的分布情況Fig.1 Time distribution of sewage isolates from 2013 to 2014 in Fuzhou

2.2 病毒株分離季節(jié)分布特點(diǎn) 2013-2014年污水中EV分離高峰期為2-7月(圖1)，優(yōu)勢(shì)血清型Echo 6在全年都有檢出，Echo 7在1-10月持續(xù)檢出；PV除5月和10月外，其他每個(gè)月均有檢出，以3、11和12月檢出率高，分別占30.4%、66.7%和85.7%，主要與實(shí)施脊灰疫苗查漏補(bǔ)種和強(qiáng)化免疫活動(dòng)相關(guān)。

表1 福州污水中監(jiān)測(cè)到病毒株的型別和采樣點(diǎn)分布
Tab.1 Serotype and site distribution of sewage isolates

YearStrainsEV-BEV-CIsolationpointsEcho6Echo7CVBOthertypesPV1PV2PV3CVA24XiangbanYangli20131331958326316807063201413585532508816669Total26810463651324161136132

2.3 優(yōu)勢(shì)血清型VP1序列特征分析

2.3.1 Echo 6 2013-2014年福州污水共分離到104株Echo 6，占所有分離株38.81%，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型。搜索了同時(shí)期福建省AFP和手足口病監(jiān)測(cè)病例的分離株，發(fā)現(xiàn)AFP病例中，2012年39株NPEV中4株(10.26%)為Echo 6，2014年27株NPEV中有3株(11.11%)，其他年份未監(jiān)測(cè)到；手足口病例中，除2012年鑒定出1株為Echo 6外，其他年份也未鑒定出。為了解污水監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)結(jié)果相關(guān)性，將此8株病例分離株和兩污水監(jiān)測(cè)點(diǎn)分離株中隨機(jī)抽取8株進(jìn)行VP1序列分析。

參照文獻(xiàn)[8]方法對(duì)福建病例和污水分離株進(jìn)行遺傳樹(shù)圖構(gòu)建(圖2)，從樹(shù)圖可見(jiàn)，除P12-190屬于D基因型外，其他福建株均分別聚類(lèi)于C2基因亞型的L1和L2兩個(gè)分支下；污水株和病例株沒(méi)有顯著的差別，L1分支下，2014年的病例株和污水株高度同源(核苷酸和氨基酸平均同源性分別為96.32%和99.77%)；2013年和2014年污水中監(jiān)測(cè)到C2基因亞型的兩個(gè)分支，而同一年度病例株僅監(jiān)測(cè)到L1分支，提示污水比病例檢出敏感性高。2012年病例檢出D基因型未在2013年和2014年污水中檢出，可能此基因型已停止循環(huán)，也可能因未對(duì)污水全部分離株(104株中隨機(jī)選取8株)進(jìn)行序列分析而偏差。

● isolates from patients during 2010 to 2014 in Fujian province○ isolates from sewage during 2013 to 2014 in Fuzhou city圖2 Echo 6 VP1序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Echo 6 based on VP1 gene

● isolates from patients in Fujian province, 2012 to 2013○ isolates from sewage in Fuzhou city, 2013 to 2014圖3 Echo 7 VP1序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Echo 7 based on VP1 gene

2.3.2 Echo 7 2013-2014年福州污水分離株中25.37%(63/268)為Echo 7，從中隨機(jī)抽取9株與福建省2012年2例病毒性腦炎分離株(CSF-LY54、67)和1例手足口病分離株(ND2012-400)、2例2013年AFP病例分離株(P13-61、64)進(jìn)行VP1序列分析。從遺傳樹(shù)圖可見(jiàn)，2013年和2014年污水中監(jiān)測(cè)出福州市存在至少B1和B3兩個(gè)基因亞型共同傳播，而同一時(shí)期的病例中僅監(jiān)測(cè)到B3基因亞型。在B3亞型的分支下，污水株和病例株高度同源，核苷酸和氨基酸同源性分別為96.33%～97.89%和98.95%～99.81%。B1和B3福建分離株間核苷酸和氨基酸同源性分別為62.17%～74.29%和92.51%～97.01%。

3 討 論

國(guó)內(nèi)外已研究報(bào)道，在發(fā)現(xiàn)人群中PV循環(huán)之前，環(huán)境污水中已監(jiān)測(cè)到PV野病毒和VDPV，且兩者具有相關(guān)性,因此WHO在全球消滅脊灰新策略中，已將環(huán)境PV監(jiān)測(cè)納入[9-10]。通過(guò)污水監(jiān)測(cè)其他腸道病毒，也有相關(guān)報(bào)道[11]。本研究在福州市兩個(gè)污水處理廠設(shè)立HEV監(jiān)測(cè)點(diǎn)，一是探索建立應(yīng)用環(huán)境污水開(kāi)展病毒監(jiān)測(cè)的方法，為后期監(jiān)測(cè)工作奠定基礎(chǔ)；二可補(bǔ)充AFP、HFMD及病毒性腦炎等腸道病毒臨床病例監(jiān)測(cè)的結(jié)果，提高腸道病毒監(jiān)測(cè)的敏感性；三可更為全面地闡釋福建省腸道病毒流行的規(guī)律，以更有效地防控相關(guān)疾病的發(fā)生。

在應(yīng)用WHO推薦的污水中腸道病毒的濃縮及分離方法開(kāi)展初步監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，93.4%(226/242)陽(yáng)性分離物鑒定為單型病毒株，這可能與這兩年污水中分別以Echo 6和Echo 7呈絕對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型有關(guān)，優(yōu)勢(shì)病毒濃度高且對(duì)所應(yīng)用細(xì)胞系敏感，其在細(xì)胞上的生長(zhǎng)可能會(huì)掩蓋或抑制其他非優(yōu)勢(shì)病毒的生長(zhǎng)而導(dǎo)致非優(yōu)勢(shì)病毒難以監(jiān)測(cè)出來(lái)，如在同期HFMD監(jiān)測(cè)中以含EV71和CVA16在內(nèi)EV-A組為主要病原體[12]，在污水監(jiān)測(cè)中卻未檢出，因此有必要在目前建立的監(jiān)測(cè)方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)和完善。

污水中HEV的陽(yáng)性分離率為2-7月份為高峰，與福建省的HFMD(雙峰，第1次高峰為4-7月，第2次小高峰為9-10月)、病毒性腦炎(4-7月)及AFP(4-9月)監(jiān)測(cè)病例的發(fā)病高峰為相吻合且略為提早2個(gè)月，這也提示污水監(jiān)測(cè)結(jié)果具有早期預(yù)警的作用。PV檢出與疫苗使用量相關(guān)，說(shuō)明在目前污水監(jiān)測(cè)方法能客觀反映人群PV的感染情況，可繼續(xù)應(yīng)用此監(jiān)測(cè)方法監(jiān)測(cè)從活疫苗轉(zhuǎn)化為滅活疫苗過(guò)程中，人群的PV感染情況以及評(píng)估人群免疫對(duì)病毒傳播的阻斷效果。

Echo 6是美國(guó)1970-2005年間監(jiān)測(cè)的第5位最常見(jiàn)的HEV，主要感染1歲以下兒童，病死率為5.6%[13]。Echo 6感染可引起多種疾病，對(duì)于兒童住院病例，由Echo 6感染引起的最主要的疾病是無(wú)菌性腦膜炎，其次為假性腦膜炎、上呼吸道感染、肺炎和皰疹性咽峽炎，因此，對(duì)Echo 6的分子流行病學(xué)研究和防控工作十分重要。本研究中污水分離株與病例分離株的核苷酸和氨基酸同源性較高(分別為92.7%～99.3%和98.6%～100%)，遺傳進(jìn)化樹(shù)也顯示相同的結(jié)果，說(shuō)明污水分離株與病例分離株為同一傳播鏈，且污水分離株監(jiān)測(cè)的范圍更廣，能夠通過(guò)污水監(jiān)測(cè)系統(tǒng)來(lái)補(bǔ)充常規(guī)的病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，更全面的闡述福建省腸道病毒的流行規(guī)律。進(jìn)化樹(shù)中顯示雖然8株污水分離株同屬C2基因亞型，但形成兩個(gè)獨(dú)立小分支，說(shuō)明2010-2012年與2014年的腦炎病例分離株基因亞型雖然同屬于C2基因亞型，但還是發(fā)生顯著變異。福建分離株與2005年安徽腦炎病例分離株關(guān)系較遠(yuǎn)，而與山東分離株關(guān)系密切，為同一傳播鏈流行。

一般認(rèn)為Echo 7病毒在兒童中僅引起輕度發(fā)熱、出疹性疾病。但近年也有引起嚴(yán)重疾病的報(bào)道，如2000年馬來(lái)西亞手足口病暴發(fā)期間，在1例3歲兒童腦脊液中分離到1株Echo 7病毒 (AY036578)[14]。2005年日本在1例致死性腸道病毒感染的新生兒中分離到1株Echo 7病毒 (DQ227458)[15]。因此，對(duì)Echo 7病毒的監(jiān)測(cè)顯得越來(lái)越重要。福建省的Echo7污水分離株分布于B1和B3基因亞型中，其中2012-2013年病例分離株均為B3基因亞型，且與日本分離株關(guān)系密切，說(shuō)明該傳播鏈在福建持續(xù)流行，可能與福建日本僑民較多，交往密切有關(guān)。污水中還存在B1基因亞型的傳播流行，該基因亞型與云南、山東分離株親緣性高，且云南有相關(guān)病例報(bào)道，所幸該病毒循環(huán)未在福建省內(nèi)引起危害嚴(yán)重疾病流行的報(bào)道，但需要引起足夠重視。

2014年美國(guó)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)EV-D68的檢出率遠(yuǎn)高于往年，且能引起嚴(yán)重的呼吸道疾病[16]。福建省在AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上初步建立了病毒性腦炎、手足口病等相關(guān)疾病的腸道病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，2013年開(kāi)展的污水監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能進(jìn)一步提高HEV的監(jiān)測(cè)敏感性和完整性。病例監(jiān)測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)相結(jié)合模式一方面可以幫助我們摸清HEV的長(zhǎng)期流行規(guī)律，另一方面可以幫助我們明確優(yōu)勢(shì)血清型與疾病流行之間的關(guān)系，從而預(yù)測(cè)相關(guān)疾病的流行趨勢(shì)。

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Enterovirus distribution in environmental sewage in Fuzhou City, 2013-2014

YANG Xiu-hui1,2, ZHU Wang-feng1,3, CAI Shao-jian1,2, ZHOU Yong1,2, YAN Yan-sheng1,2

(1.FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonosisResearch/FujianProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China;2.TeachingBaseofPublicHealthSchoolofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

In order to explore the significance of enterovirus environmental surveillance of sewage, two sewage treatment plants in Fuzhou City were selected as sentinel surveillance sites. One sewage sample was collected from entrance of each plant every month, and total 48 samples were studied from 2013 to 2014 in Fuzhou City. Using the RD, L20B and Hep-2 cell lines to isolate the viruses, 44 of the 48 sewage samples (91.67%) were positive, 268 strains were isolated which covered at least 22 enterovirus serotypes. The peak season of virus isolation from sewage was in February and July which was two months earlier than patient surveillance. Echovirus type 7 (Echo 7) was the predominant serotype in 2013 with 58 isolations (43.61%), and in 2014 echovirus type 6 (ECHO 6) became the predominant serotype with 85 isolates (62.96%), among the strains isolated from sewage sample. Phylogenetic analysis found that the predominant serotype Echo 6 and Echo 7 isolated from sewage were more diversified than that from clinical cases during the same period, and were high homology with isolates form patients which belong to same branch in phylogenetic tree. In conclusion, enterovirus environmental sewage surveillance is an effective approach, and could be more sensitive than patient surveillance.

sewage; enterovirus; surveillance; phylogenetic characteristic

Yan Yan-sheng, Email: yysh@fjcdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.005

嚴(yán)延生, Email: yysh@fjcdc.com.cn

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001; 2.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教學(xué)基地，福州 350001; 3.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福州 350001

R373.2

A

1002-2694(2017)01-0027-05

2016-09-05 編輯：張智芳

福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013-ZQN-ZD-10)

Supported by the Medical Elite Cultivation Program of Fujian(No.2013-ZQN-ZD-10)