鴨源彎曲菌的分離鑒定及其耐藥性、毒力基因分析

曾 杭，彭峻烽，黃 靜，嚴(yán)唯瑋，陳 朋，周 康,3，鄒立扣，黃 勇，韓新鋒，劉書(shū)亮,3

鴨源彎曲菌的分離鑒定及其耐藥性、毒力基因分析

曾 杭1，彭峻烽1，黃 靜1，嚴(yán)唯瑋1，陳 朋1，周 康1,3，鄒立扣4，黃 勇2，韓新鋒2，劉書(shū)亮1,3

目的 了解鴨肉生產(chǎn)鏈中彎曲菌的污染情況及其耐藥性和毒力基因分布情況。方法 根據(jù)GB 4789.9-2014，從肉鴨屠宰鏈中分離疑似彎曲菌，采用三重PCR方法，對(duì)疑似菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定；采用微量肉湯稀釋法，對(duì)彎曲菌分離菌株進(jìn)行8種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，參考NARMS標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果；利用PCR檢測(cè)與彎曲菌致病相關(guān)的4個(gè)毒力基因。結(jié)果 根據(jù)形態(tài)特征、生化指標(biāo)及PCR鑒定結(jié)果，從489份樣品中，鑒定出空腸彎曲菌100株、結(jié)腸彎曲菌79株，其他彎曲菌8株，彎曲菌的總體分離率為38.24%，肉鴨屠宰前、脫毛環(huán)節(jié)、掏膛環(huán)節(jié)、屠宰后樣品彎曲菌分離率分別為76.33%、5.62%、24.00%、0%；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明彎曲菌對(duì)TET(95.72%)、CLI(90.91%)的耐藥率較高，對(duì)AZI(63.64%)耐藥率居中，對(duì)CIP(31.02%)、GEN(34.76%)、NAL(37.43%)、ERY(41.18%)、CHL(41.18%)的耐藥率相對(duì)較低，所分離菌株多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，多重耐藥率達(dá)72.19%。彎曲菌分離株對(duì)黏附相關(guān)基因cadF、鞭毛基因flaA、侵襲蛋白基因iamA、毒素調(diào)節(jié)基因cdtB的攜帶率分別為100%、80.75%、71.12%、94.65%。結(jié)論 肉鴨屠宰過(guò)程中存在不同程度的彎曲菌污染，且其耐藥情況較為嚴(yán)重，毒力相關(guān)基因廣泛存在于彎曲菌中，應(yīng)該加強(qiáng)衛(wèi)生管理和抗菌藥物使用監(jiān)督。

肉鴨屠宰鏈；空腸彎曲菌；結(jié)腸彎曲菌；耐藥性；毒力基因

彎曲菌(Campylobacterspp.)是一種重要的人獸共患病原菌和食源性病原菌，包括24個(gè)種，其中空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobactercoli，C.coli)是導(dǎo)致人類細(xì)菌性腸胃炎的主要原因，還可并發(fā)關(guān)節(jié)炎、敗血癥和格林-巴利綜合癥(GBS)等疾病[1]。

大多數(shù)溫血?jiǎng)游锒紨y帶有彎曲菌，以家禽、家畜和野禽中的帶菌量最多，并能夠通過(guò)食物鏈傳遞給人類，引起人類發(fā)病。在美國(guó)每年每10萬(wàn)人中有14人被確診為彎曲菌感染，超過(guò)130萬(wàn)人受彎曲菌病的影響[2]，嚴(yán)重威脅著人類健康。被彎曲菌感染的動(dòng)物通常不表現(xiàn)臨床癥狀，卻可長(zhǎng)期攜帶該菌并通過(guò)排泄污染環(huán)境、食物和水源，動(dòng)物在屠宰加工過(guò)程中，若衛(wèi)生監(jiān)控不規(guī)范可能使其肉產(chǎn)品受到污染，而食用受到污染的食物及其制品是人類感染彎曲菌的主要途徑，因而加強(qiáng)畜禽特別是畜禽屠宰鏈彎曲菌流行狀況調(diào)查對(duì)防止人感染該菌具有重要意義。

近年來(lái)，隨著抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中的大量使用，彎曲菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，且其耐藥性可能通過(guò)食物鏈傳播到人群，使彎曲菌感染的治療難度加大[3-4]，給人類健康帶來(lái)重大的安全隱患。動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)與控制成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，各國(guó)相關(guān)部門(mén)紛紛對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。彎曲桿菌感染的具體致病機(jī)理尚不明確，但就目前國(guó)內(nèi)外對(duì)彎曲菌的潛在致病因素的研究來(lái)看，彎曲菌主要是通過(guò)黏附、定植、侵入、產(chǎn)毒素等機(jī)制感染機(jī)體導(dǎo)致疾病，多種毒力基因在這一過(guò)程中參與表達(dá)毒力因子并發(fā)揮作用[5]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于禽類彎曲菌研究主要集中在肉雞上，對(duì)肉鴨的研究甚少，且大部分學(xué)者研究對(duì)象是鴨糞，對(duì)肉鴨屠宰生產(chǎn)鏈中彎曲菌的污染和耐藥性分析方面的研究鮮有報(bào)道。本研究調(diào)查了肉鴨屠宰鏈中彎曲菌的污染分布情況以及耐藥狀況，并對(duì)其部分毒力基因分布進(jìn)行了分析，為研究彎曲菌在肉鴨屠宰加工過(guò)程中的流行和傳播提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源及取樣方法 樣品采集于四川省成都市某肉鴨加工公司，所屠宰肉鴨為6周齡櫻桃谷肉鴨。取樣方法如下：用無(wú)菌剪刀剪取屠宰后的盲腸2～4 cm，置于保鮮袋中，代表屠宰前糞樣；屠宰過(guò)程中，用2～3根無(wú)菌棉簽蘸取Bolton肉湯充分擦拭肉鴨胴體表面，放入肉湯增菌液中；無(wú)菌采集沖淋水樣和肉樣于滅菌容器中。所有樣品編號(hào)后在4 h內(nèi)低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。

1.1.2 菌株 空腸彎曲菌(C.jejuni)ATCC 33560、結(jié)腸彎曲菌(C.coli)ATCC33559由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑和儀器 Bolton肉湯，改良Skirrow氏瓊脂基礎(chǔ)，改良CCD瓊脂，哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；M-H培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；培養(yǎng)基均按照國(guó)標(biāo)GB4789.9-2014[6]配制；脫纖維綿羊血，新生級(jí)小牛血清，購(gòu)自平睿生物科技(北京)有限公司。DL-2000 DNA Marker、GoldviewTM核酸染料、Taq PCR Mastermix、瓊脂糖購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；氧化酶試紙片購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫等為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。BSC—1300ⅡA2 型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；3131 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Bio-Rad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；Bio-Rad C1000梯度PCR擴(kuò)增儀等。

1.1.4 引物 三重PCR鑒定引物(針對(duì)彎曲菌屬的16SrRNA基因、空腸彎曲菌的hipO基因和結(jié)腸彎曲菌的ceuE基因)，毒力基因(黏附相關(guān)基因cadF、鞭毛蛋白基因flaA、侵襲蛋白基因iamA、毒素調(diào)節(jié)基因cdtB)引物，均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.1.5 抗菌藥物 氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin，GEN)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(Erythromycin，ERY)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)；林可酰胺類：克林霉素(Clindamycin，CLI)；氯霉素類：氯霉素(Chloramphenicol，CHL)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline，TET)；喹諾酮類：萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)。以上抗菌藥物均為原粉，GEN、ERY、TET、NAL、CHL購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，CLI、CIP、AZI購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 用無(wú)菌接種環(huán)挑取盲腸內(nèi)容物接種于Skirrow血瓊脂培養(yǎng)基上，于42 ℃微需氧條件下(85% N2，10% CO2，5% O2)培養(yǎng)48 h；將樣品增菌液于37 ℃微需氧培養(yǎng)4h后，混勻按照1∶9 的比例加入到新鮮Bolton增菌肉湯中，置于42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，而后劃線于Skirrow血平板、CCDA平板，置于42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，參照GB 4789.9-2014[6]，挑取可疑菌落劃線于哥倫比亞血平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。水樣和肉樣按照GB/T 4789.9-2014[6]方法處理后進(jìn)行增菌、分離純化。

1.2.2 生化鑒定 對(duì)分離得到的疑似彎曲菌菌株，按照GB/T 4789.9-2014[6]方法，進(jìn)行革蘭氏鏡檢、氧化酶、過(guò)氧化氫酶和生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.2.3 三重PCR鑒定 參照朱冬梅[7]建立的三重PCR方法，利用合成的引物對(duì)平板上分離的彎曲菌疑似菌株進(jìn)行三重PCR鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以空腸彎曲菌(ATCC 33560)作為質(zhì)控菌株。記錄彎曲菌對(duì)各類藥物的最低抑菌濃度值(MIC值)，根據(jù)美國(guó)NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)標(biāo)準(zhǔn)(表1)[9]，對(duì)彎曲菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.5 毒力基因檢測(cè)flaA[5]、cadF[10]、cdtB[11]、iamA[5]基因引物序列、片段大小和PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系：2×PCR premix 12.5 μL、DNA模板1 μL、毒力基因上下引物各1 μL，加入超純水使最終反應(yīng)體系為25 μL。

表1 彎曲菌的藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)
Tab.1 Breakpoints applied for the interpretation of antimicrobial susceptibility test ofCampylobacterspp.

AntimicrobialagentsMICbreakpoints(μg/mL)Range(μg/mL)GEN≥80.06-64ERY≥320.25-256AZI≥80.03-32CLI≥80.03-32CHL≥320.5-512TET≥160.12-128NAL≥640.5-512CIP≥40.03-32

表2 毒力基因引物名稱、序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小和PCR條件
Tab.2 Primer sequences, amplicon sizes and PCR conditions for amplification of virulence genes

TargegenePrimersequences(5'-3')Length/bpPCRconditionflaAATGGGATTTCGTATTAACACCTGTAGTAATCTTAAAACATTTTG171395℃1min,(95℃30s,45℃1min,72℃1min)35cycles,72℃,5mincadFTTGAAGGTAATTTAGATATGCTAATACCTAAAGTTGAAAC40094℃1min,(94℃1min,45℃1min,72℃3min)30cycles,72℃,5mincdtBGTTAAAATCCCCTGCTATCAACCAGTTGGCACTTGGAATTTGCAAGGC49594℃1min,(94℃1min,42℃2min,72℃3min)30cycles,72℃,5miniamAGCACAAAATATATCATTACAATTCACGACTACTATGAGG51895℃1min,(95℃30s,52℃1min,72℃1min)35cycles,72℃,5min

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離及鑒定 鏡檢觀察到典型的彎曲菌為G-菌，菌體彎曲如小逗點(diǎn)狀，兩菌體的末端相接時(shí)呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。陽(yáng)性分離株在25 ℃微需氧條件及42 ℃有氧條件下均不生長(zhǎng)，結(jié)合氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性的結(jié)果，從489份樣品中，分離、純化得到187株彎曲菌疑似菌株。

M：DL 2000 DNA Marker; 1：negative control; 2-12，15-24：part of samples; 13：C. coli ATCC33559; 14：Campylobacter jejuni ATCC33560圖1 部分彎曲菌疑似菌株三重PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis of triplex PCR amplified products from part of the isolated Campylobacter spp.

根據(jù)三重PCR結(jié)果，187株疑似菌株中，鑒定出空腸彎曲菌100株、結(jié)腸彎曲菌79株，其他彎曲

菌8株(圖1)。能同時(shí)擴(kuò)增出857 bp(16SrRNA)和462 bp(ceuE)兩條帶的為結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性(如泳道4-8)，同時(shí)擴(kuò)增出857 bp和600 bp(hipO)兩條帶的為空腸彎曲菌陽(yáng)性(如泳道11、12)；圖中3號(hào)泳道只擴(kuò)增出了一條857 bp大小的條帶，并未擴(kuò)增出ceuE基因或hipO基因的片段大小，為彎曲菌屬的其他種類。

2.3 彎曲菌分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 彎曲菌分離菌株耐藥率 本研究中187株彎曲菌對(duì)8種抗生素的耐藥率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2。彎曲菌對(duì)TET的耐藥率最高，為95.72%，CLI次之為90.91%，對(duì)CIP、GEN、NAL、ERY、CHL的耐藥率相對(duì)較低，分別為31.02%、34.76%、37.43%、41.18%、41.18%；對(duì)AZI(63.64%)耐藥率中等偏高?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對(duì)CLI和TET的耐藥率均很高，總體而言，結(jié)腸彎曲菌對(duì)抗生素的耐藥率明顯高于空腸彎曲菌。

表3 肉鴨屠宰鏈彎曲菌分離率
Tab.3 Prevalence ofCampylobacterspp. from the duck slaughter chain

SourceSampleNCampylobacterspp.(%)C.jejuni(%)C.coli(%)Other(%)屠宰前盲腸糞便207158(76.33%)71(34.30%)79(38.16%)8(3.86%)脫毛環(huán)節(jié)體表拭子、水樣895(5.62%)5(5.62%)0(0.00%)0(0.00%)掏膛環(huán)節(jié)體表拭子、水樣10024(24.00%)24(24.00%)0(0.00%)0(0.00%)屠宰后鴨腳、鴨翅930(0.00%)0(0.00%)0(0.00%)0(0.00%)合計(jì)489187(38.24%)100(20.45%)79(16.16%)8(1.64%)

圖2 肉鴨源彎曲菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率Fig.2 Resistance rates of duck originated Campylobacter spp. against 8 antimicrobial agents

屠宰環(huán)節(jié)彎曲菌對(duì)8種抗生素呈現(xiàn)出了不同的耐藥表現(xiàn)(表4)，總體來(lái)說(shuō)，對(duì)CLI和TET都有很高的耐藥率，在脫毛環(huán)節(jié)對(duì)這兩種抗生素耐藥率甚至達(dá)到了100%。對(duì)其余6種抗生素，屠宰前彎曲菌對(duì)其的耐藥率高于脫毛環(huán)節(jié)和掏膛環(huán)節(jié)。

表4 肉鴨屠宰鏈彎曲菌分離菌株對(duì)不同抗生素的耐藥率
Tab. 4 Resistance rates ofCampylobacterspp. from the duck slaughterhouse against 8 antimicrobial agents

Caecalsample(n=158)Depilationstage(n=5)Eviscerationstage(n=24)Carcasses(n=0)CIP33.54%20.00%16.67%0.00%GEN40.51%0.00%4.17%0.00%NAL39.24%0.00%33.33%0.00%ERY44.30%20.00%25.00%0.00%CHL43.67%40.00%25.00%0.00%AZI68.99%20.00%37.50%0.00%CLI90.51%100.00%91.67%0.00%TET96.20%100.00%91.67%0.00%

2.3.2 彎曲菌分離株的耐藥譜及多重耐藥率 187株彎曲菌對(duì)8 種抗菌藥物共產(chǎn)生了45種耐藥譜，其中CLI-TET；AZI-CLI-TET和CIP-ERY-AZI-GEN-CLI-TET-NAL-CHL為優(yōu)勢(shì)耐藥譜，分別占19.25%(36/187)、12.83%(24/187)、19.79%(37/187)?？漳c彎曲菌產(chǎn)生了33種耐藥譜，優(yōu)勢(shì)耐藥譜為CLI-TET(23%)和AZI-CLI-TET(19%)；結(jié)腸彎曲菌產(chǎn)生了24種耐藥譜，ERY-AZI-GEN-CLI-TET-NAL-CHL(35.90%)為優(yōu)勢(shì)耐藥譜。在屠宰生產(chǎn)鏈，屠宰前一共產(chǎn)生了39種耐藥譜，CLI-TET；AZI-CLI-TET和CIP-ERY-AZI-GEN-CLI-TET-NAL-CHL為優(yōu)勢(shì)耐藥譜。脫毛、掏膛環(huán)節(jié)分別產(chǎn)生了4種和13種耐藥譜，其中優(yōu)勢(shì)耐藥譜均為CIP-ERY-AZI-GEN-CLI-TET-NAL-CHL。

彎曲菌多重耐藥菌株(耐3種及以上藥物)占72.19%，其中耐3種、4種以及8種抗生素的菌株較多，分別占了17.65%、15.51%、19.79%(圖3)?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重耐藥率分別為70%和73.42%，其中空腸彎曲菌主要集中在3、4、5重耐藥，分別為25%、21%、12%，而結(jié)腸彎曲菌主要集中在4重耐藥和8重耐藥，分別占10.13%和35.44%。屠宰鏈中，屠宰前多重耐藥率為75.32%，脫毛環(huán)節(jié)多重耐藥率為60%，掏膛環(huán)節(jié)多重耐藥率為54.17%。

圖3 肉鴨源彎曲菌的多重耐藥分布情況Fig.3 Multi-drug resistance distribution of Campylobacter isolates of duck origin

2.4 彎曲菌分離株毒力基因分布情況 彎曲菌分離株對(duì)cadF基因的攜帶率為100%，對(duì)flaA基因、iamA基因、cdtB基因的攜帶率均較高，其中空腸彎曲菌對(duì)flaA、cdtB和iamA基因的攜帶率均高于結(jié)腸彎曲菌。在屠宰環(huán)節(jié)，脫毛環(huán)節(jié)和掏膛環(huán)節(jié)對(duì)4個(gè)毒力基因的攜帶率均為100%。

表5 鴨源彎曲菌毒力相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果
Tab.5 Results of virulence-associated genes inCampylobacterspp. of duck origin

Genus(No.)flaAgenecadFgenecdtBgeneiamAgene彎曲菌空腸彎曲菌(n=100)85.00%100.00%96.00%95.00%結(jié)腸彎曲菌(n=79)78.48%100.00%94.94%43.04%其他彎曲菌(n=8)50.00%100.00%75.00%75.00%總計(jì)80.75%100.00%94.65%71.12%屠宰鏈條屠宰前(n=158)78.48%100.00%93.67%65.82%脫毛(n=5)100.00%100.00%100.00%100.00%掏膛(n=24)100.00%100.00%100.00%100.00%屠宰后(n=0)0.00%0.00%0.00%0.00%

3 討 論

本研究彎曲菌總體分離率為38.24%，空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌分離率占彎曲菌分離菌株的95.72%，與Adzitey F等[12](96.97%)、朱冬梅等[7](96.35%)研究較為一致。結(jié)腸彎曲菌占彎曲菌分離株的42.25%，低于Kovalenko K[13]等的研究(60.8%)，高于Wei B等[14](16.1%)的報(bào)道，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能與采樣方式、采樣季節(jié)、分菌方法等有關(guān)，也可能是不同地區(qū)彎曲菌的流行情況存在差異。

從屠宰前到屠宰后彎曲菌的污染率總體呈下降趨勢(shì)，這一結(jié)果同朱冬梅[7]、Torralbo等[15]報(bào)道一致。彎曲菌是禽類腸道內(nèi)的一種正常共生菌，因此在屠宰前彎曲菌分離率最高為76.33%；脫毛環(huán)節(jié)，彎曲菌分離率急速下降至5.62%，可能是在熱燙過(guò)程中彎曲菌因?yàn)闊嶂滤阑蛘哌M(jìn)入了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)導(dǎo)致；而在后續(xù)掏取內(nèi)臟的過(guò)程中，腸道內(nèi)容物的溢出可能會(huì)污染鴨肉表面，因此掏膛環(huán)節(jié)彎曲菌分離率大幅提升為24.00%。在屠宰后的鴨翅和鴨腳中未檢出彎曲菌，這是由于掏膛后經(jīng)過(guò)沖淋、預(yù)冷等工序，彎曲菌可能發(fā)生死亡或進(jìn)入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，從而不能檢出。此外也與分離方法有關(guān)，樣品經(jīng)增菌培養(yǎng)后某些雜菌隨之生長(zhǎng)，隨后在Skirrow血平板和CCDA平板上劃線時(shí)出現(xiàn)彎曲菌與雜菌同時(shí)生長(zhǎng)，而雜菌生長(zhǎng)更快，致使彎曲菌難以被分離純化。Boonmar S等[16]分別采用了PCR和傳統(tǒng)分離方法，檢測(cè)樣品中彎曲菌的攜帶率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，用傳統(tǒng)分離方法僅能從其中部分陽(yáng)性樣品中分離純化得到彎曲菌，說(shuō)明傳統(tǒng)分離方法存在一定的局限性，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)其加以改進(jìn)。

鴨源彎曲菌對(duì)抗生素的耐藥狀況比較嚴(yán)重，多重耐藥現(xiàn)象也較為普遍，這與國(guó)內(nèi)外關(guān)于彎曲菌耐藥狀況較為一致[7,12,14,17-19]。本研究中彎曲菌對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生了很高的耐藥性，這與近年來(lái)我國(guó)大量使用四環(huán)素類藥物治療家禽的腹瀉等疾病有關(guān)。彎曲菌對(duì)紅霉素的耐藥率相對(duì)較低，與Kovalenko K等[13]報(bào)道較為一致。Chen X等[3]報(bào)道空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對(duì)克林霉素的耐藥率分別為13.9%、100%，對(duì)阿奇霉素的耐藥率分別為8.9%、98.1%，Wei B等[14]報(bào)道空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對(duì)克林霉素的耐藥率分別為6.7%、10%，對(duì)阿奇霉素的耐藥率分別為22.2%、30.0%；Jamali H等[17]報(bào)道彎曲菌對(duì)氯霉素的耐藥率為4.4%，對(duì)慶大霉素的耐藥率分別為0%，Ma LC等[18]報(bào)道空腸彎曲菌對(duì)慶大霉素耐藥率為53.77%，而結(jié)腸彎曲菌對(duì)慶大霉素的耐藥為93.46%，與本研究的耐藥性試驗(yàn)結(jié)果差異較大，造成這種現(xiàn)象的原因可能是不同國(guó)家、地區(qū)治療動(dòng)物疾病或在飼料中添加的抗生素的種類和用量標(biāo)準(zhǔn)不同。此外，本研究中彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星和萘啶酸耐藥率相對(duì)較低，與部分文獻(xiàn)[12,14,17-18]報(bào)道的彎曲菌對(duì)喹諾酮類藥物的強(qiáng)耐藥性相反，這可能是由于喹諾酮類藥物沒(méi)有大量用于本地區(qū)鴨源疾病的治療當(dāng)中。

Monteville等[20]研究表明cadF基因編碼的纖連結(jié)合蛋白在彎曲菌黏附宿主細(xì)胞中具有重要作用；cdtB基因參與編碼細(xì)胞致死性膨脹毒素的CdtB多肽，CdtB多肽可以切斷宿主細(xì)胞DNA的雙鏈[21]；而flaA基因?qū)澢掣?、侵襲腸上皮細(xì)胞以及輸出分泌毒力蛋白功能等方面都有重要影響。本研究中彎曲菌對(duì)cadF基因的攜帶率為100%，與Muller J 等[5]、Bang DD等[11]報(bào)道一致，對(duì)flaA基因、cdtB基因、iamA基因攜帶率低于Muller J 等[5]、Bang DD等[11]的研究，而對(duì)cadF基因、cdtB基因、iamA基因攜帶率高于Zhong X等[19]的研究。本研究中空腸彎曲菌毒力基因的攜帶率普遍高于結(jié)腸彎曲菌，可能是不同來(lái)源菌株之間存在著差異。本研究還發(fā)現(xiàn)脫毛環(huán)節(jié)和掏膛環(huán)節(jié)的彎曲菌對(duì)四種毒力基因攜帶率達(dá)到了100%，這對(duì)食品安全具有潛在的威脅。

本研究彎曲菌中毒力基因攜帶率很高，但其對(duì)宿主并沒(méi)有致病，說(shuō)明其致病性受多種因素影響。但是如果人類食用了被彎曲菌污染的食品，且在加工過(guò)程中未完全加工成熟，很容易造成彎曲菌感染；另一方面，彎曲菌耐藥性可能通過(guò)食物鏈傳播到人群，對(duì)食物安全和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。本研究選擇了肉鴨作為研究對(duì)象，明確了其屠宰生產(chǎn)鏈中彎曲菌的污染分布情況以及其耐藥狀況、毒力基因分布，為研究彎曲菌在肉鴨屠宰加工過(guò)程中的流行和傳播提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Isolation, antimicrobial resistance profile and virulence gene analysis ofCampylobacterspp. originated from duck

ZENG Hang1, PENG Jun-feng1, HUANG Jing1, YAN Wei-wei1, CHEN Peng1, ZHOU Kang1, 3, ZOU Li-kou4, HUANG Yong2, HAN Xin-feng2, LIU Shu-liang1, 3

(1.CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an625014,China；
2.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China；
3.KeyLaboratoryofAgriculturalProductsProcessingandPreservationEngineeringofSichuanProvince,Ya'an625014,China；
4.LaboratoryofMicrobiologyofDujiangyanCampus,SichuanAgriculturalUniversity,
Dujiangyan611830,China)

To investigate the contamination conditions ofCampylobacterspp. in duck production chain and its antimicrobial resistance, virulence gene distribution, samples were collected at the duck slaughterhouse according to GB 4789.9-2014. Triplex PCR assay was applied to identify the species ofCampylobacterand the recoveredCampylobacterstrains were tested for the antimicrobial susceptibility against 8 kinds of antimicrobial agents using a broth microdilution method, the susceptibility results were determined according to the NARMS criteria (2011). Subsequently, 4 virulence genes were detected by PCR method. The result showed that 187Campylobacterisolates were obtained from 489 samples, including 160C.jejuni, 130C.coliand10 unidentifiedCampylobacterisolates. The total isolation rate ofCampylobacterwas 38.24%. The prevalence ofCampylobacterbefore slaughtering, at depilation stage, evisceration stage and duck products was 76.33%, 5.62%, 24.00%, and 0%, respectively. TheCampylobacterisolates were most frequently resistant to tetracycline (95.72%), followed by resistance to clindamycin(90.91%), the resistance rate of azithromycin (63.64%) was in the middle, the resistance rates of ciprofloxacin(31.02%), gentamicin(34.76%), nalidixic acid(37.43%), erythromycin(41.18%), chloramphenicol (41.18%) were relatively low. The multi-drug resistance was common amongCampylobacterisolates with a rate of 72.19%. The prevalence of adhesion-associated genecadF, flagellin geneflaA, invasion associated protein geneiamA, toxin regulation genecdtBwas 100%, 80.75%, 71.12% and 94.65%, respectively. The results indicated that theCampylobactercontamination occurred in the slaughtering procedures of duck, and the antimicrobial resistance ofCampylobacterisolates was relatively serious. In addition, the virulence-associated genes were detected widely amongCampylobacterisolates. Therefore, the supervision of antimicrobial agents using at rearing stage should be strengthened, along with health management in duck production chain.

duck slaughter chain;Campylobacterjejuni;Campylobactercoli; antimicrobial resistance; virulence genes

Han Xin-feng，Email: hanxinf@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.003

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31400066)、公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)子課題(No.200903055)聯(lián)合資助

韓新鋒，Email: hanxinf@163.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130； 3.農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，都江堰 611830

S855.1

A

1002-2694(2017)01-0015-07

2016-08-29 編輯：王曉歡

Supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (No.31400066) and the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.200903055)