蘋果異三聚體G蛋白α亞基基因MdGPA1的克隆及功能鑒定

李睿，安建平，由春香，王小非，郝玉金

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山東泰安 271018）

蘋果異三聚體G蛋白α亞基基因MdGPA1的克隆及功能鑒定

李睿，安建平，由春香，王小非，郝玉金

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】異三聚體G蛋白（Heterotrimeric G protein）作為植物生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，在感受外界環(huán)境刺激、參與植物抗逆反應(yīng)和跨膜信號轉(zhuǎn)導等方面發(fā)揮著重要作用?？寺‘惾垠wG蛋白α亞基基因MdGPA1，并在煙草中過量表達MdGPA1，對其進行生物學功能鑒定和生理指標分析，為多年生木本植物響應(yīng)環(huán)境因子信號轉(zhuǎn)導過程中的分子機理研究提供參考?！痉椒ā勘狙芯恳浴吕O果（Malus × domestica ‘Royal Gala’）為研究試材，利用同源序列比對和PCR技術(shù)，克隆獲得MdGPA1。使用MEGA5.0構(gòu)建GPA1物種間系統(tǒng)進化樹；利用qRT-PCR方法檢測該基因在蘋果受非生物脅迫誘導表達及組織特異性表達情況。構(gòu)建MdGPA1植物過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草葉片，比較干旱脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的表型與生理指標，驗證MdGPA1在植物干旱脅迫條件下的生物學功能?！窘Y(jié)果】克隆得到蘋果異三聚體G蛋白α亞基基因MdGPA1（基因序列號：MDP0000881842），該基因長為1 173 bp，編碼390個氨基酸。進化樹分析表明MdGPA1與白梨PbGPA1親緣關(guān)系最近，同源性最高?；虮磉_分析顯示MdGPA1主要在葉片中表達，在根系中的表達量次之，在莖和果實中的表達量較低。定量分析表明，該基因參與干旱、低溫和鹽等非生物逆境脅迫響應(yīng)，在150 mmol·L-1NaCl、150 mmol·L-1甘露醇、10% PEG和4℃脅迫條件下表達量明顯下調(diào)，在5% H2O2脅迫處理下表達量明顯上調(diào)。在煙草中過量表達MdGPA1，發(fā)現(xiàn)MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對干旱敏感的表型特征，其葉片鮮重、葉綠素含量以及脯氨酸含量明顯低于野生型煙草。在地下部，MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草同樣表現(xiàn)出對干旱敏感的表型特征；其根系形態(tài)相比于野生型較小，干重也明顯低于野生型?！窘Y(jié)論】MdGPA1參與了植物感受外界環(huán)境刺激的過程，對干旱、低溫和鹽等非生物逆境脅迫都存在著不同程度的響應(yīng)。在煙草中異源表達MdGPA1后，提高了煙草對干旱的敏感性，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出不耐干旱的表型，受干旱脅迫比野生型煙草更為嚴重，說明MdGPA1在響應(yīng)植物抗旱脅迫中起著負調(diào)控作用。

蘋果；異三聚體G蛋白；MdGPA1；表達分析；功能鑒定

0 引言

【研究意義】異三聚體 GTP結(jié)合蛋白（Heterotrimeric GTP binding proteins），又名G蛋白，是細胞質(zhì)膜信號傳遞組分中重要的組成部分，在跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑起著非常重要的作用[1]。因此，研究G蛋白有助于了解植物響應(yīng)外界環(huán)境的分子機制，為果樹基因工程遺傳改良、獲得抗逆新品種提供參考?！厩叭搜芯窟M展】G蛋白由Gα、Gβ、Gγ三個亞基構(gòu)成[2]，其中 G蛋白 α亞基在信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮主導作用，且G蛋白α亞基基因GPA1最先在擬南芥中被克隆[3]。在植物中，G蛋白參與的跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑是一種保守且常見的作用機制[4]。G蛋白的主要作用是轉(zhuǎn)導胞外信號并產(chǎn)生第二信使激活下游的效應(yīng)器，形成跨質(zhì)膜的胞內(nèi)信使系統(tǒng)[5]。研究表明，G蛋白可以影響K+通道和ABA信號。WANG等[6]發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥中常見的由ABA抑制K+內(nèi)流的效應(yīng)在Gα亞基基因缺失突變體GPA1中消失，表明K+通道可能與有活性的G蛋白相關(guān)聯(lián)。PANDEY等[7]用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)Gα與GCR1可以在體外結(jié)合，提示Gα和GCR1的結(jié)合可能參與了ABA調(diào)控氣孔運動的信號傳遞過程。進一步研究表明 G蛋白參與了植物體內(nèi)許多信號轉(zhuǎn)導過程，包括調(diào)節(jié)根系發(fā)育[8]，影響氣孔運動[9]，參與植物光信號反應(yīng)[10]，調(diào)控細胞周期[11]，參與激素應(yīng)答等[12]。這些都對植物的生長、發(fā)育、分化和抗逆等方面起著重要作用。此外，植物 G蛋白信號轉(zhuǎn)導的基本模式也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物類似，都是通過調(diào)節(jié)與Gα亞基結(jié)合的鳥苷酸分子的狀態(tài)來調(diào)節(jié)G蛋白的活性[13]。相關(guān)研究表明，Gα幾乎在植物所有組織中都有表達，只是在不同組織或發(fā)育階段有所差異[14]。Gα在導管和篩管中大量表達，這表明Gα有可能參與了物質(zhì)攝取過程的信號轉(zhuǎn)導。進一步說明了 G蛋白在植物生長發(fā)育中具有十分廣泛的功能。有關(guān)G蛋白的研究開始較早，在G蛋白結(jié)構(gòu)、受體及其效應(yīng)器之間的作用機制等方面取得了許多研究結(jié)果。但是由于植物細胞中廣泛存在信號之間的串擾，使得專一研究 G蛋白系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導過程變得較為困難[15]。所以，植物 G蛋白信號轉(zhuǎn)導的一般規(guī)律仍需進一步研究?！颈狙芯壳腥朦c】雖然目前關(guān)于 G蛋白已有大量研究，但主要集中在擬南芥、水稻[16]、番茄等植物。在多年生木本果樹中的相關(guān)研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘嘎啦’蘋果（Malus×domestica‘Royal Gala’）為材料，通過基因克隆獲得蘋果異三聚體 G蛋白 α亞基基因MdGPA1，并對其進行生物信息學和轉(zhuǎn)基因分析，運用分子生物學手段驗證MdGPA1在蘋果響應(yīng)環(huán)境因子過程中的重要作用。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院進行。

1.1 材料收集與處理

本試驗所用到的植物材料有嘎拉（Malus× domestica‘Royal Gala’），野生型煙草NC89（Nicotiana tabaccum L. cv. ‘NC89’）。10年生‘嘎啦’蘋果種植在山東果樹科學研究所的果樹試驗田（山東泰安）。2015年4月開始，分別對‘嘎啦’蘋果當年新生長的根、幼莖、新生葉、初花時的花和花后30 d的幼果取樣，取樣后用液氮速凍保存。分別用低溫（4℃）、NaCl（150 mmol·L-1）、甘露醇（150 mmol·L-1）、10% PEG、5% H2O2處理生長兩周、長勢一致的‘嘎啦’組培苗，以正常生長的‘嘎啦’組培苗作為對照，6 h后取樣，用液氮冷凍備用。

1.2 MdGPA1的克隆與同源性分析

根據(jù)在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到的序列設(shè)計引物（表1），以‘嘎拉’組培苗的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃預變性10 min，95℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，34次循環(huán)，72℃后延伸2 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳并回收目的條帶，連接到 pMD18-T克隆載體進行測序。根據(jù)擴增到的DNA序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）中檢索并下載對應(yīng)的其他物種的核酸和蛋白序列。通過MEGA5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 總RNA的提取以及實時熒光定量PCR分析

蘋果各組織的RNA以及轉(zhuǎn)基因煙草的RNA提取采用康為世紀科技有限公司的全能型植物 RNA提取試劑盒（DNase I）。以提取的總RNA為模板，利用Clontech SMARTTM Library反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第 1鏈。選取 MdActin（GenBank accession number CN938024）為內(nèi)參基因。用Ultra SYBR Mixture（with ROX）試劑盒（康為世紀）進行實時熒光定量 PCR分析。熒光定量PCR使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR反應(yīng)都設(shè)3次重復。PCR反應(yīng)體系為：2× UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 1.0 μL。加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，65℃延伸10 s，40個循環(huán)；每次循環(huán)第2步進行熒光采集。最后采用2-ΔΔCT法進行定量數(shù)據(jù)分析。

1.4 載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化和鑒定

轉(zhuǎn)基因煙草通過侵染煙草葉片的方法獲得。將野生型煙草切成小塊，放置在預培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA）上培養(yǎng)1—2 d。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化侵染煙草葉片；隨后，將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+100 mg·L-1潮霉素+500 mg·L-1頭孢霉素）。PCR檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，收取種子，播種后選擇長勢一致的植株進行表型觀察。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理及生理指標測定

1.5.1 轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理與表型觀察 選擇 3周左右、生長狀態(tài)一致的野生型和MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草進行干旱處理。連續(xù)干旱處理20 d后，觀察植株生長狀態(tài)，復水3 d后，觀察植株生長狀況并拍照。

1.5.2 轉(zhuǎn)基因煙草生理指標測定

1.5.2.1 煙草葉片葉綠體色素提取 稱取剪碎的煙草葉片，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2—3 mL 96%乙醇研成勻漿。用濾紙過濾勻漿到棕色容量瓶中，并用乙醇定容。以96%乙醇為空白，在波長652 nm下測定提取液光密度。利用公式計算葉綠體色素含量。

葉綠素總量濃度CT=（D625×1000）/34.5

葉綠體色素含量=（CT×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重

1.5.2.2 煙草葉片脯氨酸含量測定 脯氨酸含量測定采用橫基水楊酸比色法：取50—100 mg剪碎的煙草葉片，置于10 mL EP管中，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min。冷卻至室溫后吸取上清液2 mL，加入2 mL冰乙酸，3 mL 2.5%酸性茚三酮溶液顯色液（冰乙酸和6 mol·L-1磷酸以3﹕2比例配制，兩日內(nèi)有效）。振蕩均勻后沸水浴40 min，加入5 mL甲苯萃取紅色物質(zhì)，測定520 nm波長處的吸光度。將吸光度代入標準曲線，即可計算樣品提取液中的脯氨酸濃度。利用公式計算樣品中脯氨酸含量百分數(shù)。

脯氨酸（μg·g-1FW）=提取液中脯氨酸濃度×提取液總體積/（測定時所吸取體積×樣品重）

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件，進行單因素ANOVA方差分析比較葉片鮮重、葉綠素含量、脯氨酸含量和根系干重。當差異P＜0.05和P＜0.01時，有統(tǒng)計學意義。所有試驗均重復3次。

2 結(jié)果

2.1 蘋果MdGPA1克隆及進化樹分析

以‘嘎拉’組培苗的cDNA為模板，RT-PCR克隆到一條大約1 000 bp的條帶。對克隆得到的片段進行回收測序分析。分析結(jié)果表明，目的基因片段含有一個完整的開放閱讀框，長度為1 173 bp。該基因編碼390個氨基酸，命名為MdGPA1。這是從蘋果中分離到的第一個G蛋白α亞基基因。

將蘋果MdGPA1氨基酸序列與白梨、梅、桃、擬南芥、煙草等16種不同植物的GPA1氨基酸序列比對構(gòu)建進化樹。進化樹分析結(jié)果表明，蘋果MdGPA1與白梨PbGPA1親緣關(guān)系最近，同源性最高（圖1）。

2.2 蘋果MdGPA1的表達分析

qRT-PCR分析MdGPA1在10年生‘嘎啦’蘋果不同器官中的表達情況。結(jié)果表明，MdGPA1在蘋果葉片中的表達量最高，在根中的表達量次之，在莖與果實中的表達量相對較低（圖2）。

圖1 MdGPA1與其他植物GPA1蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree constructed using MdGPA1 and GPA1 proteins of other plants

分別用 NaCl（150 mmol·L-1）、甘露醇（150 mmol·L-1）、10% PEG、5% H2O2、低溫（4℃）處理‘嘎啦’組培苗6 h，檢測植株中MdGPA1的相對表達量。結(jié)果表明，在 NaCl、甘露醇、PEG、4℃脅迫條件下，MdGPA1的表達量明顯下調(diào)，其中在NaCl脅迫條件下MdGPA1下調(diào)最明顯，甘露醇脅迫次之。在H2O2脅迫處理下，MdGPA1表達量明顯上調(diào)（圖3）。

2.3 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

用Pst I和BamH I限制性內(nèi)切酶分別對pMD18-T中間載體和pCAMBIA-1300表達載體進行酶切反應(yīng)，將酶切產(chǎn)物回收后在16℃進行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。成功篩選到陽性克隆，獲得MdGPA1-pCAMBIA-1300植物過表達載體（圖4）。

將構(gòu)建的 MdGPA1過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，進而用篩選到的陽性農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，通過PCR鑒定MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草（圖5-A），并通過半定量RT-PCR檢測MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草表達水平（圖5-B）。獲得L1、L3和L4三個轉(zhuǎn)基因株系（圖5）。

圖2 MdGPA1在蘋果不同器官中的相對表達量Fig. 2 Relative expression of MdGPA1 in different organs of apple

圖3 MdGPA1在不同逆境條件下的相對表達量Fig. 3 Relative expression of MdGPA1 in response to various stresses

圖4 MdGPA1-pCAMBIA-1300結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the MdGPA1-pCAMBIA-1300 structure

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定（A）及MdGPA1表達水平檢測（B）Fig. 5 Identification of transgenic tobacco (A) and detection of MdGPA1 expression in transgenic tobacco (B)

2.4 過量表達MdGPA1基因提高煙草對干旱的敏感性

同時干旱處理野生型煙草和MdGPA1 T1代轉(zhuǎn)基因煙草。20 d后轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出更為嚴重的萎蔫，而野生型煙草僅出現(xiàn)部分萎蔫性狀（圖 6）。對干旱處理的煙草進行復水，3 d后，野生型煙草恢復正常生長狀態(tài)，而MdGPA1過量表達的煙草仍然保持萎蔫狀態(tài)，無法恢復。為了進一步分析，對復水處理后煙草的鮮重、葉綠素含量以及脯氨酸含量進行了統(tǒng)計。結(jié)果顯示，干旱處理后的MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草的葉片鮮重、葉綠素含量以及脯氨酸含量均顯著低于野生型（圖 6）。同時，對根系的觀察結(jié)果表明干旱處理后MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草根系的形態(tài)與干重（圖 7）都顯著小于野生型。以上結(jié)果說明MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫更加敏感，過量表達MdGPA1基因降低了煙草的抗旱能力。

3 討論

植物所生長的環(huán)境是動態(tài)變化的，所以植物必須能夠感受外界環(huán)境刺激，并對外界環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)。G蛋白是細胞質(zhì)膜上重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導分子，將胞外信號轉(zhuǎn)導為胞內(nèi)信號，并激活下游相應(yīng)的效應(yīng)器。雖然其在植物體內(nèi)的編碼基因相對于動物較少，但它卻在植物體內(nèi)發(fā)揮了重要作用[12]。對于G蛋白已有大量較為深入的研究。前人研究結(jié)果表明，G蛋白參與植物多個信號轉(zhuǎn)導過程，包括響應(yīng)植物體內(nèi)的激素信號與糖信號[11]；參與調(diào)控氣孔運動和離子通道[17]；參與植物對病原體的防衛(wèi)[18]；參與植物光信號轉(zhuǎn)導[19]等。G蛋白同樣可以調(diào)控植物的形態(tài)發(fā)育，包括影響植物側(cè)根的生長[20]，花和果莢的形成[21]，花粉管的發(fā)育[22]，葉片的形態(tài)[23]和下胚軸的長度[24]。

圖6 野生型和MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理（A）及其葉片鮮重（B）、葉綠素含量（C）、脯氨酸含量測定（D）Fig. 6 Drought treatment of wild type and transgenic tobacco (A) and the measurement on fresh weight (B), chlorophyll content (C) and proline content (D) of wild type and transgenic tobacco

圖7 野生型和MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理后根系形態(tài)（A）和根系干重（B）Fig.7 Root morphology (A) and dry weight (B) of wild type and transgenic tobacco after drought treatment

G蛋白α亞基作為最先被克隆出來的G蛋白亞基，在G蛋白參與的信號轉(zhuǎn)導過程中起到了關(guān)鍵作用，在植物體內(nèi)幾乎所有組織中都有表達。CHOUDHURY等[25]研究發(fā)現(xiàn)G蛋白α亞基基因GPA1影響植物節(jié)間發(fā)育。ULLAH等[26]在擬南芥中過量表達GPA1，增強了擬南芥對GA的敏感性，推測GPA1可能參與GA信號轉(zhuǎn)導途徑進而影響種子萌發(fā)。WARPEHA等[27]發(fā)現(xiàn)GCR1、GPA1、PRN1、NF-Y信號鏈能夠參與植物的藍光響應(yīng)。ZHANG等[28]發(fā)現(xiàn)激活GPA1能夠通過葉綠體蛋白酶 FtsH抑制葉綠體的形成。NILSON等[29]通過試驗驗證了 GPA1能夠調(diào)控植物的蒸騰效率。CHAKRABORTY等[30]最近研究結(jié)果表明GPA1調(diào)控的基因參與了多達79個生物學過程，包含了生物與非生物脅迫[31]、植物發(fā)育、類黃酮的生物合成、硝酸鹽和磷酸鹽響應(yīng)等過程。結(jié)合本研究結(jié)果表明，G蛋白作為植物體內(nèi)非常重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導蛋白，在將胞外信號轉(zhuǎn)為胞內(nèi)信號過程中扮演著極其關(guān)鍵的角色。GPA1的過量表達，會導致植物對干旱脅迫的過度響應(yīng)。

4 結(jié)論

克隆獲得了MdGPA1，該基因編碼390個氨基酸。進化樹分析表明蘋果MdGPA1與白梨PbGPA1親緣關(guān)系最近。定量表達分析結(jié)果顯示MdGPA1在蘋果根、莖、葉、花和果實中均有表達，并且在葉中表達量最高；MdGPA1受多種脅迫響應(yīng)，在NaCl、甘露醇、PEG、4℃脅迫條件下表達量明顯下調(diào)，在H2O2脅迫處理下表達量明顯上調(diào)；MdGPA1轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對干旱敏感的表型特征，表明MdGPA1在響應(yīng)植物抗旱脅迫中發(fā)揮著重要的負調(diào)控作用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Molecular Cloning and Functional Characterization of the α-Subunit of Heterotrimeric G Protein Gene MdGPA1 of Apple

LI Rui, AN JianPing, YOU ChunXiang, WANG XiaoFei, HAO YuJin
（College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and Germplasm Innovation, Tai’an 271018, Shandong）

【Objective】As an important signal transduction molecule in plant biology, heterotrimeric G protein plays an important role in the stimulation of the external environment, the functions in regulation of responses to biotic and abiotic stresses and transmembrane signal transduction. A α-subunit of the apple heterotrimeric G protein named MdGPA1 was cloned from Malus ×domestica ‘Royal Gala’. Its basic biological functions were identified in transgenic tobacco. It provides a reference for the study of the molecular mechanism of perennial woody plants in response to environmental factor signal transduction. 【Method】MdGPA1gene was cloned by homology sequence alignment and PCR technique. The phylogenetic tree of GPA1 homologous species was constructed using MEGA5.0. The induced expression and tissue-specific expression profiles of MdGPA1 gene in apple with abiotic stress were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR). A plant over-expression vector of MdGPA1 was constructed and used to transform tobacco by Agrobacterium-mediated method. The phenotypic and physiological performance of the transformants were characterized under drought stresses to investigate the function of MdGPA1 on stress resistance in tobacco.【Result】A α-subunit of the apple heterotrimeric G protein named MdGPA1 (MDP0000309677) was cloned from Malus ×domestic‘Royal Gala’. Sequence analysis showed that the length of MdGPA1 gene is 1 173 bp, which encoded 390 amino acids. A phylogenetic tree indicated that the apple MdGPA1 exhibited the highest sequence similarity to Pyrus bretschneideri PbGPA1. The qRT-PCR analysis indicated that MdGPA1 has the highest expression levels of expression in apple leaves and response to drought stress, low temperature and salt abiotic stress. Expression levels were significantly down regulated at 150 mmol·L-1NaCl, 150 mmol·L-1mannitol, 10% PEG and 4℃ abiotic stress, and the expression level was significantly increased under 5% H2O2stress treatment. The MdGPA1 transgenic tobacco showed a drought sensitive phenotype. The fresh weight, chlorophyll content of the leaves and proline content of MdGPA1 transgenic tobacco were significantly lower than that of the wild type tobacco. Compared to the wild type, the root morphology of MdGPA1 transgenic tobacco was lower than that of the wild type, and the dry weight was significantly lower than that of the wild type.【Conclusion】The MdGPA1 is involved in the process of plant environment stimulation, and has different responses to abiotic stresses such as drought, low temperature and salt. Transgenic tobacco was more sensitive to drought stress than the wild type tobacco. The experimental results indicate that MdGPA1 plays a negative role in response to drought stress in plants.

apple; heterotrimeric G protein; MdGPA1; expression analysis; functional identification

2016-05-27；接受日期：2016-09-12

國家自然科學基金（31430074）、教育部創(chuàng)新團隊支持計劃（IRT15R42）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-06-03）

聯(lián)系方式：李睿，E-mail：liruisdau@163.com。通信作者王小非，E-mail：xfwang2004@163.com。通信作者郝玉金，E-mail：haoyujin@sdau.edu.cn