誘集植物香根草對(duì)二化螟幼蟲致死的作用機(jī)制

魯艷輝，高廣春，鄭許松，呂仲賢

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州 310021；2嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江嘉興 314001）

誘集植物香根草對(duì)二化螟幼蟲致死的作用機(jī)制

魯艷輝1，高廣春2，鄭許松1，呂仲賢1

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州 310021；2嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江嘉興 314001）

【目的】香根草(Vetiveria zizanioides)能夠有效誘集水稻害蟲二化螟（Chilo suppressalis）雌成蟲在其上產(chǎn)卵，但孵化出的幼蟲在香根草上不能完成生活史。本研究旨在明確香根草對(duì)二化螟幼蟲致死的作用機(jī)制，為開發(fā)以香根草為基礎(chǔ)的水稻螟蟲可持續(xù)控制新技術(shù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^有機(jī)溶劑萃取和硅膠柱層析方法提取香根草有毒活性物質(zhì)，并利用飼料混毒法測(cè)定各提取組分對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性，同時(shí)利用生物化學(xué)方法測(cè)定水稻和香根草中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量以及二化螟3齡幼蟲取食水稻和香根草后體內(nèi)相關(guān)解毒酶和消化酶的活性變化?！窘Y(jié)果】香根草石油醚萃取物處理二化螟3齡幼蟲9、12、15 d后，死亡率分別為38.89%、57.41%、85.19%，顯著高于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物等其他提取組分處理二化螟幼蟲后的死亡率。進(jìn)一步從香根草石油醚萃取物中分離獲得組分1（Fr1）和組分5（Fr5）,對(duì)二化螟3齡幼蟲的具有較高毒性，以0.05 g·mL-1濃度混入人工飼料飼喂3 d后死亡率分別為85.00%和67.67%，說明香根草中含有對(duì)二化螟幼蟲具有致死作用的有毒活性物質(zhì)。香根草中總蛋白、纖維素、總糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量分別為9.45 μg、1.61%、1.45%、4.00%，均顯著低于水稻中相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，其中水稻中蛋氨酸含量是香根草中的7.0倍。而香根草中單寧含量則顯著高于水稻中的含量，是水稻中的1.31倍。此外，二化螟取食水稻和香根草3 d后，取食香根草的3齡幼蟲體內(nèi)蛋白酶、淀粉酶、海藻糖酶和蔗糖酶等消化酶的活性顯著低于取食水稻幼蟲體內(nèi)相應(yīng)消化酶的活性；6 d后，取食香根草的3齡幼蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶活性顯著低于取食水稻的幼蟲；9 d后，取食香根草的3齡幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶CarE的活性顯著低于取食水稻的幼蟲。與取食水稻的3齡幼蟲相比，取食香根草的幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GSTs的活性也有所降低，但是兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。【結(jié)論】香根草作為二化螟的致死型誘集植物，對(duì)二化螟幼蟲的致死作用主要表現(xiàn)在兩方面：一是香根草中含有對(duì)二化螟幼蟲具有致死作用的有毒活性物質(zhì)，這些物質(zhì)通過抑制幼蟲體內(nèi)解毒酶CarE和P450酶的活性，使幼蟲逐漸喪失解毒代謝能力，最終死亡；二是香根草相對(duì)水稻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，二化螟幼蟲取食香根草后營(yíng)養(yǎng)不均衡，從而影響體內(nèi)消化酶活性，造成消化功能紊亂，影響其正常生理活動(dòng)，最終死亡。

香根草；二化螟；致死作用；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；解毒酶；消化酶

0 引言

【研究意義】二化螟（Chilo suppressalis）是危害水稻最重要的害蟲之一，廣泛分布于亞歐大陸。二化螟在苗期危害水稻可造成枯鞘、枯心和蟲傷株，在孕穗期和穗期危害可造成枯孕穗和白穗等，嚴(yán)重影響水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量[1-3]。近年來(lái)，種植結(jié)構(gòu)和耕作制度調(diào)整，雜交稻面積逐年增加[4]，使越冬代有效蟲源面積擴(kuò)大，更加劇了二化螟的危害[5-6]。目前，多采用化學(xué)藥劑對(duì)二化螟進(jìn)行防治[7]。但是，化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，導(dǎo)致二化螟抗藥性不斷提高，加大了二化螟的猖獗危害。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問題也日益突出。這些不利因素促使人們迫切尋求環(huán)境友好的作物保護(hù)方式[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】香根草（Vetiveria zizanioides）又名巖蘭草，是一種多年生草本植物，常用于生態(tài)環(huán)境治理、水土保持等方面。已有研究報(bào)道，香根草可以作為玉米田誘集植物引誘玉米禾螟（Chilo partellus），從而降低其對(duì)玉米的危害[9]。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，香根草具有引誘稻螟雌成蟲產(chǎn)卵的特性，二化螟在香根草上的產(chǎn)卵量是水稻上的4倍左右[10-11]。田間防控效果調(diào)查發(fā)現(xiàn)，種植香根草的小區(qū)稻螟造成的枯心率比對(duì)照區(qū)降低了50%以上[10]。此外，田埂種植香根草除了可誘集二化螟成蟲在其上產(chǎn)卵外，且孵化后的幼蟲在香根草上不能完成生活史，僅有極少數(shù)的幼蟲能存活至2齡、3齡，從而顯著降低了二化螟種群數(shù)量，減少了其對(duì)水稻的危害[11]。因此，香根草作為誘集植物防治稻螟已成為水稻害蟲綠色防控的重要措施之一，具有很大的開發(fā)潛力[12-14]。誘集植物根據(jù)其不同特征可分為傳統(tǒng)型誘集植物、致死型誘集植物和基因工程誘集植物[15]。致死型誘集植物是指該誘集植物對(duì)害蟲極具吸引力，害蟲一旦取食或者在其上產(chǎn)卵，害蟲及其后代將無(wú)法生存[16]。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)二化螟而言，香根草屬于典型的致死型誘集植物，但香根草對(duì)二化螟幼蟲的致死作用機(jī)制尚未見報(bào)道。為更好地建立以香根草為基礎(chǔ)的水稻螟蟲綠色防控新技術(shù)，明確其對(duì)二化螟幼蟲的致死作用機(jī)制尤為重要[8]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過測(cè)定香根草提取物組分對(duì)二化螟幼蟲的生物活性，比較香根草和水稻中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)解毒酶和消化酶活性的變化，從毒理學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)兩方面揭示香根草對(duì)二化螟幼蟲致死的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入了解其致死作用機(jī)制及建立稻螟綠色防控新技術(shù)提供重要的理論依據(jù)，為化學(xué)農(nóng)藥的減施、水稻害蟲的可持續(xù)治理及水稻的安全生產(chǎn)提供有力保障。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院完成。

1.1 供試植物

水稻品種浙優(yōu) 12號(hào)購(gòu)自浙江省農(nóng)科種業(yè)有限公司。播種于溫室塑料槽內(nèi)，約30 d后移栽至直徑為12 cm的塑料盆中，至45 d分蘗期時(shí)剪取莖稈以供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)定及二化螟3齡幼蟲的飼喂試驗(yàn)。

香根草種苗購(gòu)自深圳市鑫淼森園林草坪有限公司。將香根草種苗種于溫室，以分蘗苗作為繁殖體，待香根草分蘗較多時(shí)剪取莖稈供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)定及二化螟3齡幼蟲的飼喂試驗(yàn)。

1.2 供試?yán)ハx

二化螟種群于2015年5月采自杭州市蕭山區(qū)義橋鎮(zhèn)（30°04′ N，120°12′ E）水稻田，室內(nèi)建立并維持種群，幼蟲采用人工飼料飼養(yǎng)，飼料配方由中國(guó)水稻研究所提供[17]，置于溫度（27±2）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期16L﹕8D的智能人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng)。待二化螟化蛹后將蛹收集起來(lái)，放置在干凈的養(yǎng)蟲籠中，保濕，讓其繼續(xù)發(fā)育羽化，對(duì)羽化后的成蟲以10%的蜂蜜水提供營(yíng)養(yǎng)。

選取第1代二化螟3齡幼蟲用于香根草活性物質(zhì)的生物測(cè)定及水稻和香根草的飼喂試驗(yàn)。

1.3 香根草活性物質(zhì)的制備及其對(duì)二化螟幼蟲的生物活性測(cè)定

香根草活性物質(zhì)的制備：稱取0.5 kg香根草莖稈，陰干后用剪刀剪為長(zhǎng)約2 cm的小節(jié)，置于多功能提取濃縮罐中，加80%的工業(yè)乙醇12 L室溫浸泡20 h后，80℃恒溫提取8 h，濃縮后得到乙醇提取物。將殘?jiān)糜谥兴幖逅帣C(jī)，加蒸餾水6 L煎煮1.5 h，得水提取液。合并提取液，過濾濃縮蒸干得浸膏。試驗(yàn)重復(fù)兩次，合并得總提取物36.6 g。取24.4 g浸膏制成1 L混懸液，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 3次，分別濃縮得到石油醚萃取物6.0 g，乙酸乙酯萃取物4.3 g，正丁醇萃取物5.0 g和萃取后母液蒸干得到的水部位8.6 g，分別用于測(cè)定其對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性。

石油醚萃取物的硅膠柱層析：按上述方法稱取1 kg香根草莖稈制備石油醚萃取物8.0 g，利用硅膠（100—200目）柱層析，分別以石油醚、石油醚：三氯甲烷（2﹕1）、石油醚：三氯甲烷（1﹕4）、三氯甲烷、乙酸乙酯各3 L梯度洗脫，分別收集流份減壓濃縮干燥，獲得5部分組合物，編號(hào)為Fr1—Fr5，分別測(cè)定其對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性。

香根草提取物的生物活性測(cè)定：采用飼料混毒法[18]。利用丙酮將香根草各提取物進(jìn)行超聲溶解，然后加入到人工飼料中配制成濃度為0.05 g·mL-1的含樣品飼料，將飼料切成大小形狀一致的小塊，放入無(wú)菌的6孔培養(yǎng)板中，每孔接入5頭3齡幼蟲，覆蓋吸水紙及蓋子防止試蟲逃逸。每板為1個(gè)重復(fù)，共重復(fù)3次，總計(jì)90頭試蟲。對(duì)照采用混入相應(yīng)比例丙酮的常規(guī)人工飼料。所有處理均置于人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng)（條件設(shè)置同試蟲飼養(yǎng)），每3 d記錄試蟲死亡情況，共記錄15 d，以毛筆輕觸不動(dòng)的幼蟲記為死亡，其中Fr1—Fr5記錄3 d的死亡率。

1.4 水稻和香根草中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量測(cè)定

將剪取的水稻和香根草莖稈自然陰干，分別磨成粉末狀。

水溶性蛋白含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[19]。每個(gè)樣品稱取100 mg，加入1 mL pH 7.0的磷酸緩沖液（PBS），充分勻漿后，50℃振蕩2 h，然后在4℃，12 000 ×g條件下離心15 min，取40 μL上清液，利用酶標(biāo)儀（Infinite M200，Tecan）在595 nm下測(cè)定水稻和香根草樣品中的蛋白含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中蛋白含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

纖維素含量測(cè)定：采用比色法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品粉末 100 mg，加入 100 mL預(yù)冷的 60%的硫酸（H2SO4），在冰上消化處理30 min，過濾。取濾液2 mL于15 mL的玻璃試管中，加0.5 mL 2%蒽酮試劑和5 mL濃H2SO4，蓋上塞子，沸水浴中加熱10 min，取出冷卻。取250 μL反應(yīng)液在620 nm下測(cè)定OD值，以纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的纖維素含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

總糖含量測(cè)定：采用容量分析法測(cè)定。稱取樣品干粉100 mg，送至農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心完成（杭州），每個(gè)處理重復(fù)3次。

氨基酸含量測(cè)定：采用離子交換色譜法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品300 mg，送至農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心完成（杭州），每個(gè)處理重復(fù)3次。

單寧含量測(cè)定：采用單寧含量試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）按說明書測(cè)定。分別稱取水稻和香根草樣品粉末100 mg，加入1 mL蒸餾水，充分勻漿后，80℃水浴提取30 min，然后在25℃，8 000×g條件下離心10 min，取15 μL上清液，利用酶標(biāo)儀分別測(cè)定兩個(gè)樣品在760 nm下的吸光度，根據(jù)說明書計(jì)算單寧含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)解毒酶活性測(cè)定

利用水稻和香根草莖稈飼喂二化螟3齡幼蟲，分別于飼喂3、6、9、12和15 d后取樣，幼蟲饑餓3 h后，在液氮中速凍并立即轉(zhuǎn)置-80℃冰箱中保存，供后續(xù)酶活性測(cè)定試驗(yàn)用。每處理收集幼蟲5頭，共3次重復(fù)。

羧酸酯酶（CarE）活性測(cè)定：參照LU等[20]的方法稍加改進(jìn)。用0.1 mol·L-1，pH 7.0的PBS制備酶液。每個(gè)樣品稱取100 mg，加入pH 7.0的PBS 1 mL，充分勻漿后，在4℃，12 000×g條件下離心15 min，取40 μL上清液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL底物與顯色劑的混合液（用0.2 mol·L-1、pH 6.0的PBS，配制含10 mmol α-乙酸萘酯和1 mmol固藍(lán)RR鹽，混合后經(jīng)過濾得到的濾液即為底物與顯色劑的混合液）。然后加入5 μL酶液和45 μL 0.1 mol·L-1、pH 7.6的PBS，利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD450值變化，以反應(yīng)速度表示酶活力（mol·min-1·mg-1protein）。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性測(cè)定：參照HABIG等[21]的方法稍加改進(jìn)。用0.1 mol·L-1，pH 6.5的PBS制備酶夜，在96孔酶標(biāo)板中每孔依次加入45 μL 0.1 mol·L-1、pH 7.6的磷酸緩沖液（PBS）、5 μL酶液（制備方法同蛋白酶）、50 μL 1.2 mmol·L-1的1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）和50 μL 6 mmol·L-1的還原型谷胱甘肽（GSH）。利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD340值變化，以反應(yīng)速度表示酶活力（nmol·min-1·mg-1protein）。

細(xì)胞色素P450酶活性測(cè)定：參考ROSE等[22]的方法稍加改進(jìn)。利用0.1 mol·L-1、pH 7.6的PBS（含1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1苯基硫，1 mmol·L-1PMSF）制備酶液。在96孔酶標(biāo)板中依次加入2 μmol·L-1對(duì)硝基苯甲醚（溶解于0.1 mol·L-1pH 7.8的磷酸緩沖液）50 μL，9.6 mmol·L-1的NADPH 5 μL和45 μL制備好的酶液。利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi) OD405值變化，以反應(yīng)速度表示酶活力（nmol·min-1·mg-1protein）。

1.6 取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)消化酶活性測(cè)定

樣品處理及收集同1.5。

蛋白酶活力的測(cè)定：參考曹揮等的方法測(cè)定[23-24]。將收集的二化螟幼蟲轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的組織研磨器中，加入1 mL pH 7.0 PBS（含0.3%的Triton X-100）研磨，在4℃，12 000×g條件下離心15 min，取上清液作為酶源。取20 μL酶液，在37℃放置5 min，加入50 μL 37℃預(yù)熱的 0.5%酪蛋白溶液，混勻后 37℃放置 15 min，然后加入50 μL 10%的三氯乙酸，混合后離心（10 000×g，4℃，15 min），取上清液20 μL，放入酶標(biāo)板內(nèi)，加入100 μL 0.55 mol·L-1Na2CO3，20 μL Folin-酚試劑，室溫放置30 min，利用酶標(biāo)儀在680 nm下測(cè)定OD值。以酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白酶活性。

淀粉酶活力測(cè)定：參照張炬紅等[24]的方法測(cè)定。取10 μL 2%的淀粉，20 μL 0.2 mol·L-1PBS（pH 6.0），10 μL酶液（制備方法同蛋白酶），依次加入1.5 mL的離心管內(nèi)，室溫下反應(yīng)10 min后，37℃水浴60 min，加250 μL 3,5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，然后沸水浴5 min，自然冷卻后，從中取出250 μL樣品加在酶標(biāo)板內(nèi)，用酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。以麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算淀粉酶活性。

海藻糖酶活力測(cè)定：參考張炬紅等[24]的方法。取10 μL 3%的海藻糖、20 μL 0.2 mol·L-1PBS（pH 5.5）和10 μL酶液（制備方法同蛋白酶），依次加入1.5 mL的離心管內(nèi)，室溫下反應(yīng)10 min后，37℃中水浴60 min，加入250 μL 3,5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，然后在沸水浴中放置5 min，自然冷卻后從中取出250 μL樣品加在酶標(biāo)板內(nèi)，在酶標(biāo)儀550 nm下測(cè)定OD值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算海藻糖酶活性。

蔗糖酶活力測(cè)定：參考張炬紅等[24]的方法。取10 μL 4%的蔗糖、20 μL 0.2 mol·L-1PBS（pH 5.5）和10 μL酶液（制備方法同蛋白酶），依次加入1.5 mL的離心管內(nèi)，室溫下反應(yīng)10 min后，37℃中水浴60 min，隨后加入250 μL 3,5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，然后沸水浴持續(xù)5 min，自然冷卻后從中取出250 μL樣品加在酶標(biāo)板內(nèi)，用酶標(biāo)儀在550 nm下測(cè)定OD值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔗糖酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)，采用DPS 14.50軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P≤0.05）[25]。

2 結(jié)果

2.1 香根草活性物質(zhì)提取及對(duì)二化螟 3齡幼蟲的生物活性測(cè)定

香根草總提取物、水部位、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物5種組分對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性測(cè)定結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物處理二化螟3齡幼蟲15 d后，死亡率為1.85%，與對(duì)照無(wú)顯著差異；香根草粗提物、水部位和正丁醇萃取物處理后隨時(shí)間延長(zhǎng)，二化螟死亡率逐漸升高，但直至處理15 d后，死亡率均低于20%；石油醚萃取物處理9、12、15 d后，二化螟死亡率分別為38.89%、57.41%、85.19%（圖1）。

進(jìn)一步將石油醚萃取物通過硅膠柱層析，獲得編號(hào)為Fr1—Fr5的5個(gè)組分。生測(cè)結(jié)果表明，處理3 d后，F(xiàn)r1對(duì)二化螟的死亡率為85.00%，顯著高于其他組分。Fr3和Fr5對(duì)二化螟幼蟲的死亡率分別為48.33%和66.67%，二者無(wú)顯著差異；Fr2對(duì)二化螟幼蟲的死亡率為30.00%，與Fr3無(wú)顯著差異；Fr4對(duì)二化螟幼蟲的死亡率最低，僅為8.33%（圖2）。

圖1 香根草提取物對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性Fig. 1 Bioassay of vetiver extracts against the 3rd instar larvae of C. suppressalis

圖2 香根草石油醚萃取物中不同組分對(duì)二化螟3齡幼蟲的生物活性Fig. 2 Bioassay of sherwood oil extracts of vetiver against the 3rd instar larvae of C. suppressalis

2.2 水稻和香根草莖稈中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量

除單寧外，水稻中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均顯著高于香根草中的含量。其中水稻和香根草中總蛋白的含量分別為13.26和9.45 μg，纖維素含量分別為2.92%和1.61%，總糖含量分別為9.60%和1.45%（圖3）。而單寧在香根草中的含量是水稻中含量的 1.31倍（圖3）。此外，從水稻和香根草中均鑒定出17種氨基酸，總含量分別為14.23%和4.00%，且這17種氨基酸在水稻中的含量為香根草中含量的2.5—7.0倍。其中水稻中蛋氨酸含量是香根草中的7.0倍（表1）。說明除單寧外，水稻中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均比香根草中豐富。

2.3 取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)解毒酶活

性

對(duì)取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)解毒酶活性測(cè)定結(jié)果表明，取食不同寄主植物9、12、15 d后，取食水稻的幼蟲體內(nèi) CarE活性顯著高于取食香根草的幼蟲體內(nèi)CarE活性；GSTs在取食水稻和香根草的幼蟲體內(nèi)無(wú)顯著差異；細(xì)胞色素 P450酶活性則在取食不同寄主植物6—15 d，二者均呈現(xiàn)顯著差異（圖4）。

圖3 水稻和香根草中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量Fig. 3 Nutrient contents in rice and vetiver

表1 水稻和香根草莖稈中氨基酸種類和含量Table 1 Amino acid compositions and contents in rice and vetiver stem

圖4 二化螟3齡幼蟲取食水稻和香根草后體內(nèi)解毒酶活性變化Fig. 4 Activity changes of detoxifying enzymes after the 3rd instar larvae feeding on rice and vetiver stems

2.4 取食水稻和香根草后二化螟幼蟲體內(nèi)消化酶活性比較

分別取食不同寄主植物3、6、9、12、15 d后，取食香根草的二化螟幼蟲體內(nèi)蛋白酶、淀粉酶、海藻糖酶和蔗糖酶活性均顯著低于取食水稻的二化螟幼蟲體內(nèi)相應(yīng)酶的活性（圖5）。

圖5 二化螟3齡幼蟲取食水稻和香根草后體內(nèi)消化酶活性變化Fig. 5 Activity changes of digestive enzymes in the 3rd instar larvae after fed on rice and vetiver stems

3 討論

香根草作為誘集植物防治二化螟已成為稻螟綠色防控的重要措施之一，具有很大的開發(fā)潛力[12,14,26-27]。筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，香根草能誘集二化螟雌成蟲在其上大量產(chǎn)卵，但孵化出的幼蟲在香根草上不能存活[11]，因此香根草對(duì)二化螟而言屬于典型的致死誘集型植物。如果能夠開發(fā)鑒定出香根草中的殺蟲活性物質(zhì)，明確其對(duì)二化螟幼蟲致死的作用機(jī)制，將為以香根草為基礎(chǔ)的稻螟綠色防控新技術(shù)提供更充分的理論依據(jù)。

本研究從解毒代謝和營(yíng)養(yǎng)代謝兩方面揭示了香根草對(duì)二化螟幼蟲的致死作用機(jī)制。首先，發(fā)現(xiàn)香根草的石油醚萃取物對(duì)二化螟幼蟲具有很強(qiáng)的毒殺作用，15 d后幼蟲死亡率高達(dá)85.19%，說明香根草中含有對(duì)二化螟幼蟲具有毒殺作用的活性成分，且存在于石油醚萃取物中；進(jìn)一步對(duì)石油醚萃取物進(jìn)行分離，在獲得的5種組分中，F(xiàn)r1和Fr5對(duì)二化螟幼蟲具有較高的致死作用，死亡率分別為85%和67%。筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，香根草石油醚提取物對(duì)二化螟初孵幼蟲的毒性較高，3 d后死亡率高達(dá)84%左右[13]。這均說明香根草中的殺蟲活性物質(zhì)主要存在于 Fr1和 Fr5組分中，這些有毒物質(zhì)進(jìn)入二化螟體內(nèi)后可能通過抑制其解毒代謝酶活性而降低了對(duì)有毒物質(zhì)的代謝能力，最終引起昆蟲中毒死亡。研究還表明，昆蟲取食不同寄主植物后對(duì)其解毒代謝酶及相關(guān)代謝能力的影響不同[28]。昆蟲體內(nèi)參與外來(lái)物質(zhì)代謝的解毒酶主要包括CarE、GSTs和細(xì)胞色素P450酶等酶系。本研究表明，香根草中含有對(duì)二化螟幼蟲具殺蟲活性的有毒物質(zhì)，二化螟取食后，幼蟲體內(nèi)CarE和細(xì)胞色素P450酶活性受到顯著抑制，導(dǎo)致其對(duì)香根草有毒物質(zhì)的解毒代謝能力下降，引起昆蟲死亡。但Fr1和Fr5只是活性成分的粗提物，究竟是哪些活性物質(zhì)發(fā)揮了殺蟲作用目前還不能確定，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

此外，香根草中營(yíng)養(yǎng)成分匱乏可能是二化螟幼蟲不能存活的另一重要因素。本研究表明，香根草中總蛋白、纖維素、總糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量均顯著低于水稻中相應(yīng)物質(zhì)的含量，而這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是二化螟生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。一般來(lái)講，植食性昆蟲通過取食寄主植物獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足其生長(zhǎng)發(fā)育的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素等。其中糖類主要為昆蟲的生命活動(dòng)提供能量需求，纖維素是昆蟲的主要碳水化合物[29-30]；蛋白質(zhì)和氨基酸的利用會(huì)影響昆蟲取食、生長(zhǎng)和繁殖[30-31]。香根草中單寧含量高可能是二化螟取食后營(yíng)養(yǎng)吸收受阻的一個(gè)重要因素。單寧對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育具有強(qiáng)烈抑制作用，是常見的植物抗蟲物質(zhì)。單寧與消化酶結(jié)合，可抑制消化酶活性，影響其正常生理功能，進(jìn)而阻礙昆蟲對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收[32]。所以，取食香根草的二化螟幼蟲可能由于取食植物中的有毒物質(zhì)或無(wú)法利用植物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，結(jié)合有毒物質(zhì)的毒殺作用，最終導(dǎo)致其死亡。

4 結(jié)論

香根草中有毒物質(zhì)抑制了二化螟體內(nèi) CarE和細(xì)胞色素 P450酶的活性；香根草內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失，單寧含量高，從而影響二化螟體內(nèi)消化酶活性的變化，這些可能是二化螟幼蟲取食香根草后致死的兩大重要因素。研究結(jié)果可為開發(fā)以香根草為基礎(chǔ)的稻螟綠色防控新技術(shù)提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

The Lethal Mechanism of Trap Plant Vetiveria zizanioides Against the Larvae of Chilo suppressalis

LU YanHui1, GAO GuangChun2, ZHENG XuSong1, Lü ZhongXian1
(1State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Plant Protection and Microbiology of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021;2Department of Pharmacy, School of Medicine Science, Jiaxing University, Jiaxing 314001, Zhejiang)

【Objective】 Vetiver grass (Vetiveria zizanioides) can effectively attract female adults of Chilo suppressalis to layeggs, while the larvae can not complete their life cycles by feeding on vetiver. The objective of this study is to illuminate the lethal mechanism of trap plant-vetiver against the larvae of C. suppressalis and provide a theoretical basis for the development of sustainable control technology for C. suppressalis based on the application of trap plant vetiver in rice based ecosystem. 【Method】The toxic substances were extracted from vetiver by the methods of extraction and silica gel column chromatography, and the biological activities of these extracts against 3rd instar larvae of C. suppressalis were determined by mixing them in the artificial diet. The nutrient contents of rice and vetiver, and the detoxifying and digestive enzymes activities of C. suppressalis larvae fed on rice and vetiver were analyzed using biochemical methods. 【Result】 The mortalities of the C. suppressalis 3rd instar larvae after 9, 12, 15 days treated by sherwood oil extract of vetiver were 38.89%, 57.41%, and 85.19%, respectively, which were significantly higher than the mortalities of larvae treated by ethyl acetate extract, n-butyl alcohol extract and other fractions. The fraction 1 (Fr1) and fraction 5 (Fr5) were isolated and obtained from sherwood oil extract of vetiver, and the mortalities of C. suppressalis the 3rd instar larvae to Fr1 and Fr5 (0.05 g·mL-1) were 85.00% and 67.67% after 3 days treatment, respectively. These results indicated that vetiver contains toxic substances, which have lethal effect on C. suppressalis larvae. Results of nutrient contents determination showed that the contents of total protein, cellulose, total sugar and amino acids in vetiver were 9.45 μg, 1.61%, 1.45%, 4.00%, respectively, significantly lower than those in rice, and the methionine (MET) content in rice was 7-fold higher than that in the vetiver. However, the content of tannin was 1.31-fold higher than that in rice. In addition, the protease, amylase, trehalase and sucrase enzyme activities of C. suppressalis larvae on 3rd day after fed (DAF) on vetiver were significantly lower than those in the larvae fed on rice; and on the 6th DAF, the activity of P450 enzyme in the larvae fed on vetiver was significantly lower than that in the larvae fed on rice; and the esterase activity of C. suppressalis larvae on the 9th DAF on vetiver was significantly lower than that in the larvae fed on rice. Compared to glutathione S-transferase (GSTs) activity of the 3rd instar larvae feeding on rice, the enzyme activity of the larvae feeding on vetiver was also decreased, however, there was no significant difference by statistical analysis. 【Conclusion】 Vetiver as a dead-end trap plant of C. suppressalis, there were probably two lethal mechanisms of vetiver against C. suppressalis. Firstly, vetiver contains toxic substances, which have lethal effect on C. suppressalis and these substances inhibited the esterase and cytochrome P450 enzyme activities, leading to the function loss of larvae in detoxification and metabolism. Secondly, compared to rice, lack of nutrients in vetiver can not meet the demand of the larvae, and led to digestive function and physiological activity disorder and ultimately death.

vetiver; Chilo suppressalis; lethal effect; nutrient; detoxifying enzyme; digestive enzyme

2016-07-21；接受日期：2016-11-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200800）、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（2010DS700124-ZZ1601）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303017）

聯(lián)系方式：魯艷輝，E-mail：luyanhui4321@126.com。通信作者呂仲賢，E-mail：luzxmh@163.com