姜黃素對(duì)H2O2>誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

董 妍,曾維惠△,李文彬

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710004)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

△通訊作者

姜黃素對(duì)H2O2>誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

董 妍1,曾維惠1△,李文彬2

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710004)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

目的：探討姜黃素激活Nrf2對(duì)人黑素細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用。方法：利用不同濃度的H2O2(50、100、200 μmol/L)處理人黑素細(xì)胞24 h,MTT檢測細(xì)胞活性,篩選H2O2體外誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的最適濃度；進(jìn)一步使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理細(xì)胞2 h后,使用最適濃度H2O2刺激24 h。MTT檢測細(xì)胞活性,DCFH-DA流式檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量，Real-time PCR測定Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果：100 μmol/L的H2O2處理人黑素細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性顯著降低,10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,人黑素細(xì)胞活性顯著增強(qiáng),流式檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著降低，Western blot檢測結(jié)果顯示Nrf2蛋白表達(dá)增加,Real-time PCR結(jié)果提示Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。結(jié)論：姜黃素保護(hù)人黑素細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的過程中激活了Nrf2信號(hào)通路,提示Nrf2是白癜風(fēng)氧化應(yīng)激致病機(jī)制中的關(guān)鍵分子,為臨床治療白癜風(fēng)提供了一種思路。

白癜風(fēng)是臨床上常見的一種自身免疫相關(guān)性皮膚病,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,約占人群的1%～2%,好發(fā)于5～30歲兒童和青年。由于色素細(xì)胞受損導(dǎo)致色素脫失使白癜風(fēng)患者皮膚防御外界損傷的能力顯著下降，進(jìn)一步引發(fā)其他皮膚疾病,甚至皮膚癌,嚴(yán)重影響患者身心健康。白癜風(fēng)的病因復(fù)雜,其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,臨床也缺少有效的治療藥物[1]。目前,多種機(jī)制被報(bào)道參與白癜風(fēng)的發(fā)病過程,如自身免疫學(xué)說、黑素細(xì)胞自毀學(xué)說、遺傳學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說等[2]。越來越多的證據(jù)提示氧化應(yīng)激在誘發(fā)黑素細(xì)胞破壞或功能障礙方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量的氧自由基攻擊細(xì)胞,特別是白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞更易于受到損傷,其正常代謝、增殖和分化受到干擾,并可能進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng),形成瀑布式效應(yīng),最終造成黑素細(xì)胞不可逆性損傷。因此,闡明白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞易受到氧化損傷的具體分子機(jī)制,對(duì)指導(dǎo)臨床治療均具有重要的意義。姜黃素是從姜科植物的根莖中獲得的一種天然化合物,具有抑制蛋白質(zhì)的氧化及脂質(zhì)的過氧化等抗氧化作用。本研究旨在探討姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用,從轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路切入,闡明其中可能的氧化應(yīng)激機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 M254基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、DCFH-DA、雙抗(青霉素和鏈霉素)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、姜黃素購自美國Sigma公司；Nrf2、β-actin購自美國Abcam公司；Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat引物由上海生工合成。Real-time PCR試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix、八聯(lián)管購自大連寶生公司；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)和傳代：正常人黑素細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心惠贈(zèng)。細(xì)胞復(fù)蘇成功后,每2天換液一次，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶瓶底80%～90%時(shí)，給與傳代。傳代時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入37 ℃預(yù)溫的0.25%胰酶消化液2 ml,輕搖使消化液流遍細(xì)胞表面,棄液，加入0.25%胰酶消化液0.5 ml，2～5 min后，在倒置顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞皺縮變圓、散開漂浮，則加入培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液加入另外的培養(yǎng)瓶中,每瓶加10 ml培養(yǎng)液，以1∶3傳代。置于37 ℃,5%CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。②MTT法檢測細(xì)胞增殖：將人黑素細(xì)胞以密度5000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入不同濃度H2O2：50、100、200 μmol/L，篩選最適濃度的H2O2；進(jìn)一步使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,使用最適H2O2刺激24 h。同時(shí),設(shè)置空白對(duì)照組。每組6個(gè)復(fù)孔,10 μg/ml的MTT 37 ℃孵育4 h,小心吸取液體,每孔加入200 μl的DMSO,小心振蕩10 min，酶標(biāo)儀492 nm波長下檢測吸光值(A值)。③實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為四組，H2O2組；姜黃素組,姜黃素濃度為10 μmol/L；姜黃素+H2O2組,10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后使用最適H2O2刺激24 h；對(duì)照組,正常培養(yǎng)基。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。④DCFH-DA流式檢測：將人黑素細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入藥物，分組同前，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細(xì)胞融合達(dá)到70%。小心吸取培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。棄去PBS后，每孔加入2 ml濃度為10 μmol/L的DCFH-DA(無血清培養(yǎng)基配置)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h。使用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,每次3 min。加入1 ml的0.25%胰酶約3 min，鏡下觀察細(xì)胞變圓,加入1 ml的含血清培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，輕輕吹打細(xì)胞，暗環(huán)境下收集細(xì)胞懸液，1000 r/min離心機(jī)4 ℃離心10 min,棄上清，加入1 ml的無血清培養(yǎng)基重懸制備成單細(xì)胞懸液，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長流式檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。⑤Western blot檢測：細(xì)胞給藥刺激48 h后收集,每組3個(gè)復(fù)孔。每孔加入100 μl的RIPA裂解液,收集細(xì)胞后4 ℃離心機(jī)1000 r/min離心30 min,取上清。BCA試劑盒定量蛋白濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液，充分混勻后100 ℃變性10 min。每樣本取25 μg,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)電泳約90 min,取PVDF膜置于10%脫脂牛奶中封閉非特異性抗原2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)或β-actin(1∶1000)過夜,TBST洗脫3次,每次15 min。加入二抗(1∶1000)室溫避光孵育2 h,TBST洗脫兩次,每次15 min,最后一次使用TBS洗膜一次，15 min。暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影、曝光,以Nrt2與β-actin條帶吸光度掃描灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白Nrf2蛋白表達(dá)水平。⑥Real-time PCR檢測 ：使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)Nanodrop 2000檢測RNA含量及其純度，260/A280比值均介于1.9～2.1,代表所提取RNA濃度較純。Invitrgen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成細(xì)胞cDNA，以其為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng),引物序列由上海生工合成。Nrf2上游引物：5‘- TCAGCCAGCCCAGCACATCC-3’，下游引物：5‘- TCTGCGCCAAAAGCTGCATGC-3’；血紅素氧合酶-1(Ho-1)上游引物：5‘-GAGTCTAGAATGCAGGCATGCTGGCTCCC-3’，下游引物：5‘-GAGTCTAGACAAGCTACTATCAGACAATGC-3’。過氧化物歧化酶1(Sod1)上游引物：5‘-CCGATGTGTCTATTGAAGATTCTG-3’，下游引物：5‘-TTTCCACCTTTGCCCAAGTC-3’；過氧化氫酶(Cat)上游引物：5‘-TGAGGTTGAACAGATAGC-3’,下游引物：5‘- CACAGGTATATGAAGATAATTG-3’。PCR反應(yīng)體系為SYBR Green PCR Mix 10 μl,上下游引物各1 μl,cDNA模板2 μl,RNase-free ddH2O 6 μl；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后,進(jìn)行循環(huán)，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min擴(kuò)增,共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

結(jié) 果

1 MTT檢測細(xì)胞活性 給予50、100、200 μmol/L的H2O2處理24 h后,人黑素細(xì)胞的活力呈劑量依賴性降低(P<0.05)，選擇100 μmol/L濃度的H2O2為最佳刺激濃度(見圖1)。當(dāng)使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,可以顯著緩解H2O2引起的損傷作用,恢復(fù)細(xì)胞活力(見圖2)。

圖1 MTT檢測不同濃度H2O2對(duì)人黑素細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 MTT檢測10 μmol/L的姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞增殖活性的影響

2 姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 見圖3。與對(duì)照組相比,H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)。10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后能明顯降低細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度(P<0.05)。

圖3 姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞ROS含量的影響

3 姜黃素對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響 見圖4。與對(duì)照組相比,H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度降低。而10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后，姜黃素能顯著增加細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

4 姜黃素對(duì)Nrf2下游抗氧化基因表達(dá)的影響 見圖5。與對(duì)照組相比，H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后能顯著增加細(xì)胞內(nèi)Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表達(dá)(P<0.05)。

圖4 姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖5 姜黃素對(duì)人黑素細(xì)胞Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因表達(dá)的影響

討 論

大量研究報(bào)道氧化應(yīng)激參與白癜風(fēng)的發(fā)展，而且與其病情的活動(dòng)性也具相關(guān)性，甚至有專家認(rèn)為ROS可作為白癜風(fēng)病情活動(dòng)性的指標(biāo)[4]。黑素細(xì)胞在合成黑素過程中產(chǎn)生大量ROS[5]，ROS增加黑素合成中間毒性產(chǎn)物，使得兒茶酚胺釋放增多，從而引起黑素細(xì)胞免疫性損傷[6]。此外，ROS可直接攻擊黑素細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生新的自身抗原或者釋放隱蔽抗原，破壞細(xì)胞免疫耐受，進(jìn)一步引發(fā)免疫反應(yīng)。H2O2為首的ROS可以自由穿過各種細(xì)胞膜，滅活多種抗氧化酶，包括谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶及乙酰膽堿酯酶，引起脂質(zhì)過氧化，對(duì)細(xì)胞危害較大。臨床研究報(bào)道，在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中檢測到H2O2濃度高達(dá)10-3mol/L，高于其生理濃度 (10-7～10-6mol/L)，該研究為氧化應(yīng)激參與白癜風(fēng)發(fā)病提供了最直接的證據(jù)[4]。本研究使用不同濃度的H2O2刺激人黑素細(xì)胞體外構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，通過MTT檢測，最終選擇100 μmol/L的H2O2為最適刺激濃度，為本研究提供了良好的細(xì)胞模型基礎(chǔ)。

近年來，外源性提高皮膚細(xì)胞抗氧化能力，降低細(xì)胞氧化損傷成為減輕白癜風(fēng)發(fā)生的治療方向。因此，具有抗氧化作用的抗氧化物是研究白癜風(fēng)治療方法的熱點(diǎn)之一。Tuula 等[7]研究提示銀杏葉提取物中的銀杏內(nèi)酯和銀杏糖苷B、C、J及M具有抗氧化功能。槲皮素和綠茶提取物對(duì) H2O2誘導(dǎo)的Mel-Ab細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且兩者具有協(xié)同抗氧化作用[8]。Becatti 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒辣素可抑制細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生,提高細(xì)胞抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，抑制 Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而延緩白癜風(fēng)進(jìn)程。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗氧化效應(yīng)[10]。本研究使用MTT法觀察姜黃素對(duì)100 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果顯示10 μmol/L姜黃素預(yù)處理后,OD值顯著增加,提示姜黃素可以增強(qiáng)人黑素細(xì)胞的增殖活力。DCFH-DA法是常用的檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量的方法,其基本原理是DCFH-DA穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),與細(xì)胞內(nèi)ROS反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾腄CF,進(jìn)一步通過儀器接受其熒光信號(hào)。本研究結(jié)果顯示隨著H2O2濃度的增加,DCF強(qiáng)度越大,當(dāng)10 μmol/L姜黃素預(yù)保護(hù)2 h時(shí),DCF強(qiáng)度降低。結(jié)果提示,H2O2刺激人黑素細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖,10 μmol/L姜黃素可減緩H2O2的抑制效應(yīng),這一途徑可能是通過抑制ROS產(chǎn)生或加快ROS清除實(shí)現(xiàn)的。

皮膚暴露在物理、化學(xué)等環(huán)境下，催化產(chǎn)生ROS，皮膚細(xì)胞啟動(dòng)抗氧化機(jī)制抑制ROS的過量生成，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Nrf2/KEAP1信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化防御信號(hào)通路，在細(xì)胞抗氧化防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Nrf2是一種含有亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Cap-n-Colla(rCNC)調(diào)節(jié)蛋白家族，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞中，如肝臟、腎臟、皮膚、肺及消化道等[11]。Nrf2可與胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游一系列II相解毒酶和抗氧化蛋白/酶的表達(dá)。在靜息狀態(tài)下，Nrf2與胞漿內(nèi)Keap1相結(jié)合鉚釘在胞漿中，通過泛素蛋白酶體途徑降解[12]。當(dāng)細(xì)胞遭受一定強(qiáng)度的外界氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核,與核內(nèi)的ARE結(jié)合,啟動(dòng)Ho-1、Sod1、Cat等一系列II相解毒酶和抗氧化基因的表達(dá),維持細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。然而,當(dāng)外界強(qiáng)度過大，超出細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除ROS能力時(shí)，打破氧化-抗氧化平衡,最終引起細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理細(xì)胞2 h，Nrf2的表達(dá)量顯著升高，此外，下游抗氧化基因Ho-1、Sod1、Cat的mRNA水平都顯著升高。結(jié)果提示，H2O2刺激人黑素細(xì)胞抑制Nrf2/KEAP1信號(hào)通路,10 μmol/L的姜黃素可通過上調(diào)Nrf2蛋白及其下游基因表達(dá)，從而啟動(dòng)Nrf2/KEAP1信號(hào)通路，保護(hù)細(xì)胞正常生理功能。

至今,白癜風(fēng)并沒有完全治愈的特效方法，氧化應(yīng)激作為參與白癜風(fēng)發(fā)病的重要因素，通過外源性增加抗氧化劑，防止細(xì)胞內(nèi)ROS的過度產(chǎn)生，對(duì)穩(wěn)定病情有重要意義。本研究證實(shí)姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)，通過抗氧化作用實(shí)現(xiàn)，我們推測Nrf2/KEAP1信號(hào)通路在保護(hù)人黑素細(xì)胞抵抗外界氧化損傷中發(fā)揮重要作用。此外，白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞中Nrf2/KEAP1信號(hào)通路也可能存在異常，使得其對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感。隨著研究的不斷深入，對(duì)姜黃素如何激活Nrf2/KEAP1信號(hào)通路的進(jìn)一步了解，將有助于更加全面理解姜黃素在人黑素細(xì)胞氧化還原平衡維持與調(diào)節(jié)中的作用，為白癜風(fēng)抗氧化防治提供新思路。

[1] 周 暉, 韓建德, 曹光玲, 等. 白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 皮膚病診療學(xué)雜志,2012, 19(2)：111-113.

[2] 牟寬厚,李 盼.白癜風(fēng)皮膚組織角質(zhì)形成細(xì)胞釋放警報(bào)素分子的研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2014,43(10)：1275-1277.

[3] 田 軍, 熊祖明, 張國輝, 等. 氧化應(yīng)激及免疫在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用機(jī)制進(jìn)展[J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志, 2015, 8(6):441-445.

[4] 趙曉菲, 劉國艷. 白癜風(fēng)氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2016, 32(3):189-191.

[5] 田 軍, 朱龍飛, 堅(jiān) 哲, 等. 過氧化氫誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立[J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志, 2014,7(6)：406-410.

[6] 黃海艷, 王 芳, 柯宜均, 等. 特殊部位白癜風(fēng)的治療進(jìn)展[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志, 2013,27( 1)：81-84.

[7] Tuula H, Wilhelm G. Cross matching observations on toxicological and clinical data for the assessment of tolerability and safety of Ginkgo biloba leaf extract [J]. Toxicology, 2015, 327(2) ：95-115.

[8] Fardet A,Chardigny JM. Plant-Based Foods as a Source of Lipotropes for Human Nutrition: A Survey of In Vivo Studies [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2013, 53(6):535-590.

[9] Becatti M, Prignano F, Fiorillo C,etal. The involvement of Smac/DIABLO, p53, NF-kB, and MAPK pathways in apoptosis of keratinocytes from perilesional vitiligo skin: Protective effects of curcumin and capsaicin[J]. Antioxid Redox Signal, 2010, 13(9)：1309-1321.

[10] 苗久旺,張欽德.姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī),2014,35(12)：1692-1694.

[11] 潘曉菲, 譚初兵, 時(shí)麗麗, 等. Nrf2/ARE信號(hào)通路及其相關(guān)藥物研究進(jìn)展[J] . 藥物評(píng)價(jià)研究,2013, 36(1):54-58.

[12] Liu Z,Xiang Y,Sun G. The KCTD family of proteins structure, function, and disease relevance [J]. Cell Biosci, 2013, 3(1)：45-49.

(收稿：2016-08-01)

Curcumin preprotect human melanocytes from oxidative stress induced by H2O2

Dong Yan,Zeng Weihui,Li Wenbin.

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Objective: To investigate the protective effects of curcumin on human melanocytes against oxidative stress induced by H2O2through activation of Nrf2. Methods: 24 h treatment with different concentrations of H2O2(50, 100, 200 μmol/L) on human melanoma cells to select the optimum in vitro induction concentration of H2O2. Moreover, the optimum H2O2stimulation of 24 h was used under the pretreatment with 10 μmol/L curcumin for 2 h. MTT was used to detect the cell viability; intracellular reactive oxygen species(ROS) content was tested by flow cytometry; the expressions of Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat mRNA were detected using Real-time PCR; Western blot was used to test the expression of NRF2. Results: Cell viability decreased significantly after treatment of 100 μmol/L H2O2for 24 h, while strengthened significantly after 10 μmol/L curcumin pretreatment for 2 h. The intracellular ROS content decreased significantly by detection of flow cytometry. Nrf2 increased by detection of Western blot. The Real-time PCR results suggest that Nrf2, Ho-1, Sod1 and Cat mRNA were significantly improved. Conclusion：Curcumin protect human melanoma cells against H2O2induced oxidative stress damage through activation of the Nrf2 signaling pathway. Nrf2 is suggested to be the key molecules in the pathogenesis of vitiligo oxidative stress, which provide a method to the treatment of vitiligo.

Curcumin Melanocytes Oxidative stress NF-E2-related factor 2

姜黃素 黑素細(xì)胞 氧化性應(yīng)激 NF-E2相關(guān)因子2

R758.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.006