CAV1在人肺動脈成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用

王昌國 曾大雄 雷偉 黃建安

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CAV1在人肺動脈成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用

王昌國 曾大雄 雷偉 黃建安

目的 研究小窩蛋白1(CAV1)在缺氧相關(guān)肺動脈成纖維細(xì)胞(PAFs)增殖調(diào)控中的作用。方法 將體外培養(yǎng)的人PAFs分為：對照組(C：21%O2)；10%氧濃度組(10%O2)；5%氧濃度組(5%O2)及2%氧濃度組(2%O2)進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗，選取細(xì)胞增殖最明顯組為缺氧組(H)進(jìn)行后續(xù)實驗。并構(gòu)建CAV1高表達(dá)質(zhì)粒(pCAV1)，然后再將PAFs分為對照組(C：21%O2)，缺氧組(H)，空白對照組(NC：缺氧+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和CAV1高表達(dá)組(pCAV1:缺氧+ pCAV1轉(zhuǎn)染組)，采用Western-blot法檢測各組細(xì)胞中CAV1、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)和細(xì)胞凋亡抑制蛋白2(c-IAP2)含量，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 缺氧能刺激PAFs增殖，并呈濃度依賴性，于2%氧濃度刺激48小時PAFs增殖達(dá)峰值，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.20+0.02vs0.54+0.04,P<0.01);缺氧組PAFs中CAV1表達(dá)下調(diào)(1.23±0.04vs0.90±0.02,P<0.01),cyclinD1 (0.19±0.03vs1.15±0.06,P<0.01)和c-IAP2(0.63±0.04vs0.78±0.09,P<0.01) 表達(dá)上調(diào),細(xì)胞增殖增加(MTT：0.78±0.04vs1.20±0.02,P<0.01；PCNA：0.29±0.03vs0.54±0.03，P<0.01);CAV1在PAFs中高表達(dá)后(0.55±0.03vs0.90±0.03,P<0.01)，cyclinD1 (0.88±0.02vs0.52±0.02,P<0.01)和c-IAP2 (0.87±0.02vs0.72±0.02,P<0.01) 表達(dá)下調(diào)，PAFs增殖減少(MTT：1.20±0.02vs1.00±0.06,P<0.01；PCNA：0.52±0.03vs0.38±0.03,P<0.01)。結(jié)論 缺氧能通過下調(diào)CAV-1在PAFs中的表達(dá)，促進(jìn)PAFs的增殖、抑制其凋亡。cyclinD1和c-IAP2可能是CAV1調(diào)控PAFs增殖和凋亡的下游靶點。

缺氧；PAH；小窩蛋白1；肺動脈成纖維細(xì)胞

缺氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是臨床常見疾病，可導(dǎo)致右心功能衰竭甚至死亡，目前尚缺乏有效治療手段。肺動脈重構(gòu)是HPH的特征性改變，也是造成HPH不可逆的主要病理基礎(chǔ)。肺動脈重構(gòu)過程中多種細(xì)胞組分參與其中，包括肺動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞以及外膜成纖維細(xì)胞等均在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、基質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞因子分泌等方面發(fā)生明顯變化。這些變化導(dǎo)致肺動脈內(nèi)膜纖維性增厚、中膜增殖肥厚、外膜膠原沉積和纖維組織增多等多種解剖性改變[1-2]。但至今為止，HPH的相關(guān)研究主要集中在肺動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞的功能變化方面，而對肺動脈外膜的相關(guān)研究甚少[3]。小窩蛋白-1(caveolin1, CAV1)為小窩表面標(biāo)記蛋白， CAV1可綁定多種信號分子如 Src 家族酪氨酸激酶，G 蛋白,生長因子受體，G蛋白偶聯(lián)受體和內(nèi)皮一氧化氮合酶等而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng),參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CAV1在特發(fā)性HPH的形成中發(fā)揮保護(hù)性作用，機(jī)制主要與CAV1調(diào)控肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能、平滑肌細(xì)胞功能、氧化應(yīng)激、NO合酶等途徑有關(guān)[5-7]。但CAV1在低氧性HPH中的作用研究甚少，且存在爭議。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們提出如下假設(shè)：在HPH形成過程中CAV1能通過調(diào)控肺動脈成纖維細(xì)胞(pulmonary artery fibroblasts, PAFs)的增殖參與肺動脈外膜的重構(gòu)。為驗證假說，我們分別在缺氧及CAV1高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況下檢測PAFs的增殖以及CAV1、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)和細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis protein, c-IAP2)在PAFs中的表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系，初步探討CAV1參與細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，以期為HPH的治療提供新的潛在靶點。

資料與方法

一、主要材料

人PAFs購自上海生科院細(xì)胞庫；胰酶、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)、CAV1、cyclinD1、c-IAP2抗體均購自美國Santa Cruz公司；PAFs培養(yǎng)基購自美國Sciencell公司；CAV1高表達(dá)質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

將生長狀態(tài)良好的3-10代人PAFs置于含10%胎牛血清的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4天傳代一次，每次細(xì)胞處理前進(jìn)行細(xì)胞周期同步化，然后進(jìn)行后續(xù)處理。分組設(shè)計：首先將人PAFs分為：對照組(C：21%O2)；10%氧濃度組(10%O2)；5%氧濃度組(5%O2)及2%氧濃度組(2%O2)進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗，選取細(xì)胞增殖最明顯組為缺氧組(H)，然后再將PAFs分為對照組(C：21%O2)，缺氧組(H)，空白對照組(NC：缺氧+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和CAV1高表達(dá)組(pCAV1:缺氧+ pCAV1轉(zhuǎn)染組)進(jìn)行后續(xù)實驗。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染選用試劑脂質(zhì)體2000，將PAFs接種至培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%左右時更換成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(無血清、無雙抗)，待轉(zhuǎn)染。按照試劑盒說明書，將重組pCAV1質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000混合后加入PAFs中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，后續(xù)細(xì)胞同步化及分組處理同前述。

四、細(xì)胞增殖檢測(四甲基偶氮唑藍(lán)，MTT法)

將PAFs接種于96孔板，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞周期同步化。然后按上述實驗分組處理后，在每孔中加入MTT孵育4 h棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)，并于酶標(biāo)儀上讀吸光度值(OD值)。每組增殖實驗重復(fù)3次。

五、細(xì)胞增殖檢測(PCNA免疫組化法)

將PAFs接種于預(yù)置玻片的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)及細(xì)胞周期同步化，然后按上述實驗分組處理后制成細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組化。以鼠PCNA多克隆抗體為一抗(1 ∶200倍稀釋)，采用SP法，按照試劑盒說明操作，DAB顯色液顯色。細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色為PCNA陽性表達(dá)。用PCNA陽性細(xì)胞比例反應(yīng)細(xì)胞增殖。每組實驗重復(fù)3次。

六、Western-Blot檢測

Western-Blot法檢測目的蛋白的表達(dá)量。將PAFs細(xì)胞按上述分組處理后，收集細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒說明提取PAFs蛋白。用Bradford 法測定各樣品的總蛋白濃度。取各蛋白樣品30ug上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。分別以山羊抗CAV1單克隆抗體(1 ∶200倍稀釋)，兔抗cyclinD1多克隆抗體(1 ∶500倍稀釋)，兔抗c-IAP2多克隆抗體(1 ∶500倍稀釋)為一抗，以加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊或羊抗兔IgG為二抗(1 ∶5000倍稀釋)，孵育后按照ECL試劑盒的說明書步驟，加入化學(xué)發(fā)光底物ECL，于暗室內(nèi)進(jìn)行膠片的曝光、顯影、定影。采用Quantity One 1.0 軟件對各個條帶的灰度值進(jìn)行分析，以目的基因/相應(yīng)的內(nèi)參β-actin條帶的灰度值來表示該目的基因的相對表達(dá)量。每組實驗重復(fù)3次。

七、數(shù)據(jù)處理

SPSS16軟件計算各組數(shù)據(jù)的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果以±s表示，t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、缺氧對PAFs增殖的影響

隨著氧濃度的下降及缺氧刺激時間的延長，PAFs增殖逐步增加，PAFs增殖峰值出現(xiàn)在2%氧濃度刺激48小時，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.20+0.02vs0.54+0.04,P<0.01)，(見圖1)。

圖1 缺氧對PAFs增殖的影響

A：不同氧濃度及缺氧暴露時間下PAFs的增殖情況；B：常氧情況下PAFs生長情況；C：低氧條件下PAFs生長情況；*表示與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.01

二、缺氧對PAFs中CAV1、cyclinD1、c-IAP2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果，選取2%氧濃度組為缺氧組，細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，分別檢測缺氧組及常氧組PAFs中CAV1、cyclinD1及c-IAP2的表達(dá)，結(jié)果：缺氧組PAFs中CAV1表達(dá)下調(diào)(1.23±0.04vs0.90±0.02,P<0.01),cyclinD1 (0.19±0.03vs1.15±0.06,P<0.01)和c-IAP2(0.63±0.04vs0.78±0.09,P<0.01) 表達(dá)上調(diào),細(xì)胞增殖增加(MTT：0.78±0.04vs1.20±0.02,P<0.01；PCNA：0.29±0.03vs0.54±0.03，P<0.01)，(見圖2)。

圖2 缺氧對PAFs中CAV1、CyclinD1、c-IAP2及細(xì)胞增殖的影響

A、B：對照組與缺氧組PAFs中CAV1、CyclinD1、c-IAP2的蛋白表達(dá)量；C：對照組及缺氧組PAFs的PCN免疫組化陽性表達(dá)情況；D、E：PCNA免疫組化法、MTT法檢測對照組及缺氧組細(xì)胞增殖情況。*表示與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01

三、高表達(dá)CAV1對PAFs中cyclinD1、c-IAP2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

采用脂質(zhì)體2000將CAV1高表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入pCAV1及NC組PAFs中，并于2%氧濃度下培養(yǎng)48小時，檢測兩組PAFs中CAV1、cyclinD1及c-IAP2的表達(dá)，以及細(xì)胞增殖情況，結(jié)果: pCAV1組CAV1表達(dá)明顯上調(diào)(0.55±0.03vs0.90±0.03,P<0.01)，而cyclinD1(0.88±0.02vs0.52±0.02,P<0.01)和c-IAP2(0.87±0.02vs0.72±0.02,P<0.01) 表達(dá)下調(diào)，PAFs增殖減少(MTT：1.20±0.02vs1.00±0.06,P<0.01；PCNA：0.52±0.03vs0.38±0.03,P<0.01)，(見圖3)。

討 論

肺動脈重構(gòu)是HPH的特征性改變，也是HPH不可逆的主要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)肺動脈外膜的重構(gòu)是HPH早期而顯著的變化，肺動脈外膜的重構(gòu)主要包括外膜PAFs的異常增殖、遷徙、向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積[1,3]。因此，本研究中我們選取PAFs作為研究對象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下，PAFs的增殖較正常氧濃度下明顯增加，并呈濃度依賴性，說明缺氧能夠通過調(diào)控PAFs的增殖參與肺動脈重構(gòu)及HPH的形成。

圖3 CAV1高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對PAFs中CAV1、CyclinD1、c-IAP2及細(xì)胞增殖的影響

A、B：空白對照組與pCAV1組PAFs中CAV1、CyclinD1、c-IAP2的蛋白表達(dá)量；C：空白組對照組與pCAV1組PAFs的PCNA免疫組化陽性表達(dá)情況；D、E：PCNA免疫組化法、MTT法檢測空白對照組與pCAV1組細(xì)胞增殖情況。*表示與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01

CAV1為小窩表面標(biāo)記蛋白，主要參與脂質(zhì)的形成、胞吞和胞內(nèi)物質(zhì)運輸、信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[8-9]。近來研究發(fā)現(xiàn)CAV1在肺組織及肺血管的多種細(xì)胞組分中均有表達(dá)，并參與多種肺部疾病，比如急性肺損傷、肺間質(zhì)纖維化、肺癌等的發(fā)生發(fā)展[10]。但迄今為止， CAV1在HPH中的研究甚少，且存在爭議。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺動脈高壓患者外周血中CAV1表達(dá)明顯下降，而在慢阻肺相關(guān)肺動脈高壓患者外周血中CAV1表達(dá)量較正常對照組有所下降，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異[11]。提示CAV1可能僅參與了特發(fā)性肺動脈高壓的形成，而與HPH的相關(guān)性不大。而Cruz等研究發(fā)現(xiàn)，將CAV1基因敲除小鼠暴露于缺氧環(huán)境三周后，小鼠右室壓力下降并伴隨心輸出量下降、右室肥厚、右室間質(zhì)纖維化以及右心功能的下降，提示CAV1在HPH的形成中同樣發(fā)揮重要作用[12]。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠刺激PAFs的增殖，并伴隨CAV1的表達(dá)下降。而采用CAV1高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PAFs，使CAV1在PAFs中高表達(dá)后，PAFs的增殖減少。說明CAV1能夠抑制缺氧引起的PAFs的增殖。因此，我們認(rèn)為CAV1同樣參與HPH的形成，這與Cruz等研究結(jié)果相一致[12]。但CAV1調(diào)控PAFs增殖的具體機(jī)制，目前尚無相關(guān)的研究報道。

眾所周知，細(xì)胞周期蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖的重要因素。細(xì)胞周期由G1，S，G2，M四個期組成。G1期進(jìn)入S期，G2期進(jìn)入M期是整個細(xì)胞周期的2個關(guān)鍵時期，周期蛋白D是細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化的必需蛋白，其中cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白D中最主要的一種。當(dāng)cyclin D1高表達(dá)時細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換加快，引起細(xì)胞增殖[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)CAV1在PAFs中低表達(dá)后， cyclinD1表達(dá)上調(diào)，PAFs增殖增加，而高表達(dá)CAV1后，cyclinD1在PAFs中的表達(dá)隨之下調(diào)，PAFs增殖減少。提示， cyclinD1可能是CAV1調(diào)控PAFs增殖的下游靶點之一。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在HPH形成過程中，除了細(xì)胞增殖外，細(xì)胞凋亡也發(fā)揮重要作用[14-15]。細(xì)胞凋亡抑制蛋白2(c-IAP2)是IAP家族的主要成員之一。 c-IAP2能結(jié)合凋亡相關(guān)分子Caspases-3 、Caspases-7 和Caspase-9，并抑制其活性，也可通過其他多種途徑抑制細(xì)胞的凋亡過程[16]。因此，本研究中，我們選取c-IAP2作為細(xì)胞凋亡檢測的靶點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)CAV1在PAFs中低表達(dá)后， c-IAP2表達(dá)上調(diào)，PAFs增加，而高表達(dá)CAV1后，c-IAP2表達(dá)隨之下調(diào)，PAFs減少。提示， CAV1同樣可以通過對c-IAP2的表達(dá)調(diào)控，影響PAFs的凋亡，進(jìn)而參與肺動脈外膜的重構(gòu)。

綜上所述，我們認(rèn)為，在PAFs中，CAV1能夠通過對下游靶點cyclinD1及c-IAP2的調(diào)控影響細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡過程，抑制細(xì)胞的增殖,進(jìn)而抑制缺氧性肺動脈外膜重構(gòu)及HPH的形成。值得注意的是，CAV1對缺氧的反應(yīng)可能具有細(xì)胞特異性，低氧能促進(jìn)CAV1在人肺腺癌細(xì)胞A549中高表達(dá),并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的粘附、遷徙和侵襲[14]。因此，缺氧狀態(tài)下，CAV1在肺動脈中的總體表達(dá)情況，以及其對HPH形成的具體調(diào)控，需要進(jìn)一步體內(nèi)實驗明確。

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The role of CAV1 in human pulmonary artery fibroblasts proliferation

WANGChang-guo,ZENGDa-xiong,LEIWei,HUANGJian-an

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215006,China

Objective To study the role of CAV1 in hypoxia associated proliferation of human pulmonary artery fibroblasts (PAFs). Methods The PAFs cultured in vitro were divided into four groups, the control group (C: 21%O2), the 10% oxygen group (10%O2), the 5% oxygen group (5%O2) and the 2% oxygen group (2%O2), and then they were given cells proliferation test and the maximal proliferation group was selected as the hypoxia group (H) for further study. The high expression of CAV1 plasmid (pCAV1) was constructed. After that, the PAFs were divided into the control group (C: 21%O2), the hypoxia group (H), the blank control group (NC: hypoxia+null plasmid group) and the high expression of CAV1 plasmid group (pCAV1), and then the cells proliferation was detected by MTT and PCNA immunohistochemistry, and the expression of CAV1, cyclinD1 and c-IAP2 by western-blot in each group respectively. Results Hypoxia induced the proliferation of PAFs in dose dependent manner, and the maximal PAFs proliferation were observed in the 2%O2group within 48 h while compared with the group C (1.20+0.02vs0.54+0.04,P<0.01). In the hypoxia group, the expression of CAV1 decreased (1.23±0.04vs0.90±0.02,P<0.01), while the expression of cyclinD1 (0.19±0.03vs1.15±0.06,P<0.01) and c-IAP2 (0.63±0.04vs0.78±0.09,P<0.01) increased, and PAFs proliferation increased (MTT: 0.78±0.04vs1.20±0.02,P<0.01; PCNA: 0.29±0.03vs0.54±0.03,P<0.01). When CAV1 was high expressed in PAFs (0.55±0.03vs0.90±0.03,P<0.01), the expression of cyclinD1 (0.88±0.02vs0.52±0.02,P<0.01) and c-IAP2 (0.87±0.02vs0.72±0.02,P<0.01) decreased, and PAFs proliferation decreased, too (MTT: 1.20±0.02vs1.00±0.06,P<0.01; PCNA: 0.52±0.03vs0.38±0.03,P<0.01). Conclusion Hypoxia can down-regulate CAV1 expression in PAFs, promote PAFs proliferation and inhibit PAFs apoptosis, and cyclinD1 and c-IAP2 may be the downstream targets of CAV1 in the regulation of PAFs proliferation and apoptosis.

hypoxia; PAH; CAV1; pulmonary artery fibroblasts

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.003

蘇州市科教興衛(wèi)青年科技項目(No KJXW2013006),蘇州市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(應(yīng)用基礎(chǔ)研究)項目(SYS201530)

215006 江蘇 蘇州, 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科及危重癥醫(yī)學(xué)科

黃建安，E-mail:huang_jian_an@163.com

2016-10-21]