異丙腎上腺素預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

趙 慧，王 雄，魏曉倩

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異丙腎上腺素預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

趙 慧，王 雄，魏曉倩

目的 探討異丙腎上腺素預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響，闡述相關(guān)保護(hù)機(jī)制。方法 將32只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、異丙腎上腺素預(yù)處理組(ISO組)和選擇性β2腎上腺素能受體拮抗劑ICI118551+ISO-I/R組(ICI組)，每組8只。通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30 min再灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。用蘇木素伊紅染色法觀察大鼠心肌組織形態(tài)，蛋白印記法測定磷酸化絲/蘇氨酸激酶(P-Akt)的表達(dá)水平，原位末端標(biāo)記法及免疫組化法分別檢測心肌細(xì)胞凋亡率及心肌凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，黃嘌呤氧化酶法測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)濃度。結(jié)果 與I/R組比較，ISO組大鼠心肌損傷程度明顯減輕，P-Akt的表達(dá)明顯增多、心肌細(xì)胞凋亡率減低、Caspase-3表達(dá)減低、血清SOD活性增高、MDA濃度減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ICI118551可阻斷ISO的作用，與ISO組相比，ICI組大鼠心肌損傷程度重，P-Akt的表達(dá)明顯減少、心肌細(xì)胞凋亡率增高、Caspase-3表達(dá)增高、血清SOD活性減低、MDA濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 異丙腎上腺素對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激動(dòng)β2腎上腺素能受體，啟動(dòng)PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)。

心肌缺血再灌注損傷；異丙腎上腺素；腎上腺素受體；PI3K-Akt信號(hào)通路

隨著冠脈介入術(shù)在急性冠脈綜合征領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reper fusion injury，MIRI)成為心肌血運(yùn)重建術(shù)相關(guān)研究的焦點(diǎn)。近年來，有研究表明：異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)對大鼠MIRI有顯著的保護(hù)作用[1]，但具體機(jī)制鮮有報(bào)道。ISO作為兒茶酚胺類經(jīng)典藥物，可同時(shí)作用于β1腎上腺素受體(β1-adrenergic recepter，β1-AR)和β2腎上腺素受體(β2-adrenergic recepter，β2-AR)[2]。β1-AR和β2-AR是參與心臟功能活動(dòng)最重要的腎上腺素能受體，生理情況下交感神經(jīng)激動(dòng)主要經(jīng)β1-AR受體介導(dǎo)；在心力衰竭等病理?xiàng)l件下則更依賴β2-AR受體參與心功能調(diào)節(jié)[3-4]。本研究通過建立大鼠心肌MIRI模型，觀察ISO對大鼠MIRI的影響，并初步探討β2-AR及磷脂酰肌醇3激酶-絲/蘇氨酸激酶(phosphateidylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt)信號(hào)通路在其中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 成年雄性SD大鼠32只，體重(225±20)g，由中國食品藥品檢定研究院提供。異丙腎上腺素及選擇性β2腎上腺素能受體拮抗劑ICI118551購自美國Sigma公司。蛋白印記(Western blot)用兔抗鼠磷酸化絲/蘇氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase，P-Akt)單克隆抗體(美國abcam公司)，β-actin抗體(bioswamp公司)。原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立 SD大鼠稱重后，20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，以針形電極置于四肢皮下，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管，連接呼吸機(jī)。沿胸骨左緣3～4肋間開口，暴露心臟，于左心耳根部下方2 cm處肺動(dòng)脈圓錐旁以6-0無創(chuàng)縫合線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，用套管夾閉法阻斷其血流。血管結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)：心電圖ST-T抬高(≥0.15 mV)，放松后ST-T回落50%以上。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 用隨機(jī)數(shù)字法將32只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、異丙腎上腺素預(yù)處理組(ISO組)和選擇性β2腎上腺素能受體拮抗劑ICI118551+ISO-I/R組(ICI組)，每組8只。Sham組只穿線不結(jié)扎，麻醉150 min；I/R組缺血30 min，再灌注2 h；ISO組制備心肌缺血再灌注模型1 h前腹腔注射ISO 10 mg/kg；ICI組腹腔注射ICI118551 0.5 mg/kg，30 min后腹腔注射ISO 10 mg/kg，1 h后制備心肌缺血再灌注模型。Sham組和I/R組均腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.4 心肌組織病理 取心肌組織于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，脫蠟后，蘇木素伊紅(HE)染色，脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot法檢測P-Akt的表達(dá) 將左心室缺血區(qū)心肌組織于裂解液中提取組織蛋白，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，每孔10 μg蛋白并加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min，離心后上樣。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)儀將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，兔抗鼠P-Akt單克隆抗體4 ℃孵育過夜。次日用HRP標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)(UVP)行灰度值分析，以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值反映P-Akt表達(dá)情況。

1.6 TUNEL法檢測凋亡心肌細(xì)胞 取缺血區(qū)心肌組織，10%中性福爾馬林4 h以上，石蠟包埋，切片。按TUNEL試劑盒要求檢測細(xì)胞凋亡，經(jīng)DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染后，光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈深淺不一的棕黃色，每張切片在400高倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI=(凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/所有心肌細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 免疫組織化學(xué)法測定 Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)水平 取左心室心肌組織，石蠟切片，按試劑盒說明書SABC法染色，一抗為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)1∶60稀釋的Caspase-3抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。在400倍光鏡下觀察，細(xì)胞漿呈棕黃色為Caspase-3蛋白陽性表達(dá)，采用BI-200圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值(A值)。

1.8 SOD活性和MDA濃度的測定 于再灌注2 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA濃度。將動(dòng)脈血離心后，取血清-20 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟，用分光光度計(jì)檢測A值，據(jù)公式計(jì)算SOD活性、MDA濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)的檢測結(jié)果 Sham組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞無水腫，間質(zhì)未見異常。I/R組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)水腫。與I/R組相比，ISO組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂程度較輕，間質(zhì)未見明顯異常。與ISO組比較，ICI組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂程度加重，部分可見壞死，間質(zhì)水腫、增寬，可見炎性細(xì)胞浸潤。詳見圖1。

Sham組 I/R組 ISO組 ICI組圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化的蘇木素伊紅染色結(jié)果(×400)

2.2 各組大鼠心肌組織中P-Akt表達(dá)情況 與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中P-Akt明顯增多(P<0.05)。與I/R組比較，ISO組大鼠心肌組織中P-Akt表達(dá)明顯增多(P<0.05)。與ISO組相比，ICI組P-Akt表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

注：1為Sham組；2為I/R組；3為ISO組；4為ICI組。

注：a為Sham組；b為I/R組；c為ISO組；d為ICI組;與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，**P<0.05；與ISO組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果 與Sham組相比，I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)。與I/R組相比，ISO組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.05)。與ISO組相比，ICI組心肌細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)。詳見圖4。

Sham組 I/R組 ISO組 ICI組

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá) 與Sham組相比，I/R組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與I/R組相比，ISO組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，與ISO組相比，ICI組Caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見圖5、表1。

Sham組 I/R組 ISO組 ICI組

2.5 各組大鼠血清SOD活性和MDA濃度的測定 與Sham組相比，I/R組大鼠血清SOD活性降低、MDA濃度升高(P<0.05)；與I/R組相比，ISO組大鼠血清SOD活性升高、MDA濃度降低(P<0.05)；與ISO組相比，ICI組血清SOD活性降低，MDA濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別nSOD(U/mL)MDA(mmol/L)Sham組8269.82±3.91 2.48±0.19I/R組8190.07±3.631)8.04±0.201)ISO組8230.72±2.392)4.65±0.162)ICI組8160.22±2.503)12.00±0.183) 與Sham組比較,1)P<0.05;與I/R組比較,2)P<0.05;與ISO組比較,3)P<0.05。

3 討 論

目前，關(guān)于ISO對缺血再灌注心肌作用的具體機(jī)制仍存在較大爭議。國內(nèi)有研究證明預(yù)處理方式腹腔注射ISO 10 mg/kg可對抗大鼠MIRI；國外學(xué)者Tong等[5]在大鼠離體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)ISO 在10 nmol/L濃度下可誘發(fā)如缺血預(yù)處理樣的心臟保護(hù)作用，縮小心肌梗死面積。然而，Tang等[6]發(fā)現(xiàn)皮下注射ISO 2.5 mg/(kg· d)持續(xù)7 d可通過氧化應(yīng)激、增加Cx43蛋白表達(dá)等誘導(dǎo)心肌病理性肥厚，加重MIRI，因此在基礎(chǔ)研究中常被用作誘導(dǎo)心肌損傷模型。

本實(shí)驗(yàn)以10 mg/kg劑量給大鼠腹腔注射ISO 1 h后，再制備大鼠MIRI模型，結(jié)扎前降支動(dòng)脈30 min，再灌注2 h。通過比較阻斷β2-AR前后發(fā)現(xiàn)，與應(yīng)用高選擇性β2-AR拮抗劑ICI118551相比，ISO組的心肌組織形態(tài)較規(guī)整，心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)明顯優(yōu)于ICI組(P<0.05)。這提示激活β2-AR可使缺血再灌注心肌細(xì)胞獲益。既往有關(guān)β-AR與MIRI的大量研究表明：β-AR激活既可介導(dǎo)心肌保護(hù)作用，也可引發(fā)心肌損傷。其中，β1-AR通過激活蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)，抑制細(xì)胞色素-C氧化酶活性，加重再灌注期心肌梗死損傷[7]；而β2-AR則通過PI3K/AKT/eNOS/NO途徑[8]對抗MIRI。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)中通過測定P-Akt的表達(dá)水平、心肌細(xì)胞凋亡率及Caspase-3蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，分別與I/R組、ICI組比較，ISO組P-Akt的表達(dá)水平增高至2～3倍，心肌細(xì)胞凋亡率及Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯減低(P<0.05)。從而證明，ISO可能通過激活PI3K-Akt通路，抑制心肌凋亡，進(jìn)而對MIRI產(chǎn)生保護(hù)作用。這與最新研究硫化氫后處理對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制相類似[9]。PI3K-Akt通路作為再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號(hào)系統(tǒng)最為重要的信號(hào)通路之一[10]，其最顯著的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。該信號(hào)通路下游的Caspase家族，被視為凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共有途徑，是一組含半胱氨酸的天冬氨酸特異性水解酶。其中，Caspase-3是該家族細(xì)胞凋亡的終末執(zhí)行因子。可在多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)下，激活核內(nèi)核酸酶，裂解DNA片段及細(xì)胞蛋白，從而觸發(fā)凋亡[11-13]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R組相比，ISO組的SOD活性明顯增高，MDA濃度減低；與ICI組比較，ISO組的氧化應(yīng)激水平更為顯著地減低(P<0.05)。這提示ISO可通過激活β2-AR抑制氧化應(yīng)激，以對抗大鼠MIRI。近年來，人們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[14-15]是MIRI發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。SOD作為防御氧自由基損傷的第一道屏障，能夠催化還原氧自由基，生成H2O2[16]。在過氧化氫酶的作用下進(jìn)一步還原成對人體無害的水和氧[17]。MDA即膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可反映心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷程度。

綜上所述，ISO可有效保護(hù)MIRI，其可能機(jī)制是通過興奮β2-AR，進(jìn)一步激活PI3K-Akt途徑，以抑制凋亡和對抗氧化應(yīng)激。但由于ISO在應(yīng)用過程中存在致心律失常、心肌損傷[18-19]等不良反應(yīng)，針對PI3K-Akt途徑上游及下游分子機(jī)制探討尚待深入，ISO臨床應(yīng)用于MIRI治療仍需大量的理論依據(jù)及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

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(本文編輯郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

王雄，E-mail：sxwangxiong@163.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.010

1672-1349(2017)01-0036-05

2016-08-21)

引用信息：趙慧，王雄，魏曉倩.異丙腎上腺素預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(1)：36-40.