橄欖苦苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)效應(yīng)*

胡光強(qiáng),袁 園,杜 曦,李永杰,余 錄△

(西南醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

橄欖苦苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)效應(yīng)*

胡光強(qiáng)1,袁 園1,杜 曦1,李永杰2,余 錄1△

(西南醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

目的 觀察橄欖苦苷對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法 雄性ICR小鼠被分為正常對(duì)照組、LPS組、橄欖苦苷低劑量組(15 mg/kg),橄欖苦苷中劑量組(30 mg/kg)，橄欖苦苷高劑量組(45 mg/kg)及甘利欣組(甘草酸二銨注射液，11.25 mg/kg)。LPS(10 mg/kg)腹腔注射制作急性肝損傷模型，橄欖苦苷及甘利欣均于LPS注射后1 h和3 h尾靜脈給予，正常對(duì)照組給予等量的生理鹽水。6 h后處死所有小鼠，用稱質(zhì)量法計(jì)算肝臟指數(shù)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝組織腫瘤壞死因子(TNF-α)及細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)。結(jié)果 肝臟指數(shù)：橄欖苦苷高劑量組、中劑量組及甘利欣組較LPS組明顯降低(P<0.05)；染色結(jié)果：高劑量和中劑量的橄欖苦苷及甘利欣組減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟病理學(xué)損傷程度。與LPS組比較，橄欖苦苷高劑量組、中劑量組及甘利欣組TNF-α和ICAM-1的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 橄欖苦苷對(duì)LPS所致的小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與阻止肝臟炎性反應(yīng)有關(guān)。

橄欖；肝臟；創(chuàng)傷和損傷；急性?。恢嗵穷?；急性肝損傷；橄欖苦苷

肝臟是人體最大的消化腺，是體內(nèi)新陳代謝的核心場(chǎng)所，也是內(nèi)毒素最易致?lián)p的靶器官之一。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，其主要成分脂多糖(lipopolysacchide,LPS)在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1]。橄欖苦苷，一種在橄欖葉中含量極高并易于分離純化的生物活性物質(zhì)，具有消炎、抗病毒、防癌等多種藥理學(xué)效應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS腹腔注射致小鼠急性肝臟炎癥模型，觀察橄欖苦苷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ICR小鼠，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 橄欖苦苷由成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度：高效液相色譜法(HPLC)≥98%；LPS(from Escherichia coli 0111:B4，Sigma公司)；甘利欣注射液購(gòu)自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。儀器還有梅特勒LE104E電子天平(梅特勒托利多，瑞士)，奧林巴斯BX60顯微鏡(奧林巴斯，日本)，Leica CM 1950冰凍切片機(jī)(徠卡公司，德國(guó))及Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作 小鼠分為正常對(duì)照組、LPS組、橄欖苦苷低劑量組(15 mg/kg)，橄欖苦苷中劑量組(30 mg/kg)，橄欖苦苷高劑量組(45 mg/kg)及甘利欣組。甘利欣組以11.25 mg/kg的劑量給藥(按成人用藥量換算成小鼠等效劑量)，每組13只。LPS(10 mg/kg)腹腔注射給予，橄欖苦苷和甘利欣于LPS注射后1、3 h尾靜脈注射給予，正常對(duì)照組及LPS組給予等量生理鹽水。

1.2.2 肝臟指數(shù)檢測(cè) LPS注射后6 h,每組8只小鼠麻醉后處死，取肝臟用濾紙將表面吸干，電子分析天平稱其濕質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察 將小鼠麻醉后，分別用冰凍磷酸鹽緩沖液(PBS)和多聚甲醛灌流，取肝臟右側(cè)中葉同一部位甲醛固定24 h，置于15%的蔗糖溶液中過(guò)夜，次日標(biāo)本沉底后，換30%的蔗糖溶液浸泡，4 ℃冰箱保存，擇日用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋、冰凍切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 HE染色 切片置于50 ℃烤箱4 h,蒸餾水洗5 min，3次，然后蘇木素染色2 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，蒸餾水洗5 min×3次，伊紅液染色1～3 min，蒸餾水稍洗后80%、95%乙醇及無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，烤干后封片。400倍光鏡下取肝組織同一區(qū)域3個(gè)不同的視野采圖，觀察肝臟病理學(xué)改變情況。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 切片用蒸餾水洗5 min×3次，3%H2O2甲醇液避光孵育20 min，蒸餾水清洗，枸櫞酸緩沖液微波抗原修復(fù)，冷卻后pH7.2的PBS洗5 min×3次，滴加牛血清清蛋白(BSA)，于37 ℃孵育40 min，甩干后滴加稀釋的一抗(TNF-α 1∶100；ICAM-1 1∶200)于濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜，次日取出后置于室溫1 h。PBS沖洗，加羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育1 h，SABC孵育1 h，然后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明及封片。400倍光鏡下取肝組織同一區(qū)域3個(gè)不同的視野采圖，記錄每高倍視野TNF-α陽(yáng)性表達(dá)數(shù)，用Image proplus 6.0軟件計(jì)算ICAM陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值(IOD)與面積的比值。

2 結(jié) 果

2.1 橄欖苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠肝臟指數(shù)的影響 正常對(duì)照組小鼠肝指數(shù)為(4.72±0.35)%，LPS組小鼠肝臟指數(shù)明顯升高，為(5.38±0.38)%，兩組比較，肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而橄欖苦苷高劑量組肝臟指數(shù)為(4.84±0.21)%，甘利欣組肝臟指數(shù)為(4.86±0.20)%，兩組較LPS組小鼠肝臟指數(shù)均有明顯降低(P<0.01)。橄欖苦苷中劑量肝臟指數(shù)為(4.98±0.34)%，較LPS組也有降低(P<0.05)；低劑量橄欖苦苷組肝臟指數(shù)為(5.25±0.39)%，雖然有所降低，但與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 橄欖苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查的影響 在400倍光鏡下，正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間間隙緊密均勻，未見(jiàn)細(xì)胞水腫、變性壞死等病理現(xiàn)象；LPS組小鼠肝臟中央靜脈擴(kuò)張，肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，個(gè)別肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞間間隙變寬、排列紊亂；橄欖苦苷中劑量和高劑量組較LPS組肝細(xì)胞炎性水腫程度減輕，細(xì)胞間間隙變緊密,排列相對(duì)均勻；甘利欣組病理現(xiàn)象也有明顯改善；而橄欖苦苷低劑量組對(duì)LPS導(dǎo)致的肝臟病理?yè)p傷沒(méi)有明顯改善，見(jiàn)圖1。

2.3 橄欖苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠肝臟組織TNF-α和ICAM-1表達(dá)的影響 正常對(duì)照組肝臟幾乎沒(méi)有TNF-α陽(yáng)性表達(dá)，但在LPS誘導(dǎo)組，大鼠肝細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)大量棕褐色TNF-α陽(yáng)性顆粒表達(dá)，肝細(xì)胞呈深染色。橄欖苦苷各組TNF-α陽(yáng)性顆粒較LPS組表達(dá)呈劑量依賴性減少(P<0.05)；甘利欣組TNF-α陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量也明顯減少，且肝細(xì)胞染色變淺，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖2。另外，正常對(duì)照組肝臟僅有極少ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)，但LPS組可見(jiàn)明顯的ICAM-1棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)主要出現(xiàn)在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；橄欖苦苷高劑量和中劑量組中ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)減少，僅有肝竇內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)，且染色程度減輕；甘利欣組肝組織ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)也明顯減輕。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，橄欖苦苷中、高劑量組及甘利欣組小鼠ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的IOD與面積比值與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖3。

A:正常對(duì)照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖1 橄欖苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查的影響(HE，×400)

A:正常對(duì)照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖2 各組小鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)

A:正常對(duì)照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖3 各組小鼠肝臟組織ICAM-1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400) 表1 橄欖苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠肝臟組織 TNF-α和ICAM-1表達(dá)的影響

a：P<0.05，b：P<0.01,與LPS組比較。

3 討 論

肝臟是人體非常重要的器官，承擔(dān)著解毒、代謝及免疫防御等功能[3]。在病毒或內(nèi)毒素刺激的情況下，肝臟細(xì)胞特別是Kupeff細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖，合成并釋放炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子，參與白細(xì)胞-肝竇內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附和跨內(nèi)皮遷移，進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)的病理過(guò)程，從而加重肝損傷[4]。研究表明，LPS與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，激活肝內(nèi)外單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),通過(guò)其上調(diào)核因子κB(NF-κB)、P38及JAK/STAT等炎性信號(hào)通路,增加致炎因子的表達(dá)，形成瀑布級(jí)聯(lián)效應(yīng)從而損傷肝臟[5-7]。

眾所周知，橄欖油因具有強(qiáng)大的抗氧化作用而廣泛運(yùn)用于美容、醫(yī)療界。而隨著研究的不斷深入與發(fā)展，橄欖苦苷作為橄欖葉中含量較多的苯酚類裂環(huán)環(huán)烯醚帖苷化合物，其具有無(wú)毒、易被人體吸收等優(yōu)勢(shì)，其藥理學(xué)效應(yīng)也逐漸被重視[8]。有研究表明，橄欖苦苷對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的表達(dá)呈劑量依賴性抑制作用，且體內(nèi)研究表明其具有抗鴨乙型肝炎病毒(DHBV-DNA)的作用，但其作用機(jī)制尚未明確[9]。這為橄欖苦苷在肝臟疾病的治療研究提供了契機(jī)。

本研究以LPS為誘導(dǎo)制作肝臟急性損傷模型，觀察橄欖苦苷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射LPS導(dǎo)致肝臟的炎性水腫、空泡變性等病理?yè)p傷，且肝臟指數(shù)明顯升高，說(shuō)明LPS成功誘導(dǎo)了肝臟急性損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組也顯示作為炎性標(biāo)志的TNF-α和ICAM-1在肝臟組織中有較高的表達(dá)，說(shuō)明LPS增加了致炎因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致了病理改變。臨床研究證實(shí)，肝炎患者血清中往往存在高水平TNF-α、ICAM-1表達(dá)，而且，在慢性肝病中，ICAM-1在肝組織和血清中表達(dá)呈相關(guān)性增強(qiáng)[10]，這與本研究結(jié)果契合。而本研究給予中劑量和高劑量的橄欖苦苷，不僅在一定程度上減輕了LPS導(dǎo)致的肝臟病理?yè)p傷程度，且肝臟組織切片TNF-α、ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)也有明顯的下調(diào)，說(shuō)明橄欖苦苷對(duì)LPS導(dǎo)致的肝損傷有一定的保護(hù)效應(yīng)，其作用可能是通過(guò)抑制炎性因子及黏附分子的表達(dá)，阻止炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但更深的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

[1]Oh IS,Park SH.Immune-mediated liver injury in hepatitis B virus infection[J].Immune Netw,2015,15(4):191-198.

[2]陳碧瓊，聶詠飛，涂華．中藥青果的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]．廣州化工，2012，40(21)：16-18．

[3]Chisari FV,Isogawa M,Wieland SF.Pathogenesis of hepatitis B virus infection[J].Pathol Biol(Paris),2010,58(4):258-266.

[4]胡澤華，王琳琳．內(nèi)毒素血癥肝損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(7)：1047-1050．

[5]Chen W,Lin YJ,Zhou XY,et al.Protective effect of Salvia miltiorrhiza and Carthamus tinctorius extract against lipopolysaccharide-induced liver injury[J].World J Gastroenterol,2015,21(30):9079-9092.

[6]Tang J,Li L,Li CM,et al.Upregulation of HO-1 with haemin alleviates LPS-stimulated pro-inflammatory responses through downregulation of p38 signalling pathways in rat liver[J].Scand J Immunol,2015,82(5):443-451.

[7]Lv X,Zhang Y,Cui Y,et al.Inhibition of microRNA 155 relieves sepsis induced liver injury through inactivating the JAK/STAT pathway[J].Mol Med Rep,2015,12(4):6013-6018.

[8]Tan HW,Tuck KL,Stupans I,et al.Simultaneous determination of oleuropein and hydroxytyrosol in rat plasma using liquid chromatography with fluorescence detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,785(1):187-191.

[9]Zhao G,Yin Z,Dong J.Antiviral efficacy against hepatitis B virus replication of oleuropein isolated from Jasminum officinale L.var.grandiflorum[J].J Ethnopharmacol,2009,125(2):265-268.

[10]章幼奕，秦剛，姚建國(guó)，等．慢性病毒性肝炎患者血清sICAM-1與肝組織病理變化的相關(guān)性研究[J]．實(shí)用肝臟病雜志，2008，11(3)：159-162．

Protective effects of oleuropein on acute liver injury induced by lipopolysacchide in mice*

HuGuangqiang1,YuanYuan1,DuXi1,LiYongjie2,YuLu1△

(1.CollegeofBasicMedicine;2.ResearchCenterofDrugsandFunctionalFoods,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the protective effects of oleuropein on actue liver injury induced by lipopolysacchide(LPS) in mice.Methods Male ICR mice were divided into the normal control group,LPS group,oleuropein high dose(45 mg/kg),medium dose (30 mg/kg) and low(15 mg/kg) dose groups and Ganlixin (glycyrrhizic acid diammonium injection,11.25 mg/kg) group.Mice were intraperitoneally injected with LPS(10 mg/kg) to establish the model of liver injury,then mice were intravenously given oleuropein and Ganlixin by tail vein at 1,3 h after LPS injection.Subsequently,all mice were sacrificed at 6 h,the liver index was calculated by weighing method,the pathologic changes were observed by HE staining,and the expressions of TNF-α and ICAM-1 were detected by immunohistochemical techniques.Results The liver index:compared with the LPS group,the liver index in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly decreased (P<0.05);the staining results：the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group reduced the liver pathology damage degree induced by LPS;the expression of TNF-α and ICAM-1 in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly down-regulated compared with the LPS group (P<0.05).Conclusion Oleuropein has remarkable protective effect on mice acute liver injury induced by LPS,its mechanism may be associated with blocking the liver inflammatory reaction.

canarium album;liver;wounds and injuries;acute disease;lipopolysaccharides;acute liver injury;oleuropein

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.008

省-市-校聯(lián)合基金項(xiàng)目(14JC0120)；四川省教育廳基金項(xiàng)目(14ZB0152)。 作者簡(jiǎn)介:胡光強(qiáng)(1970-)，副教授，本科，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)方面研究?！?/p>

R575；R966

A

1671-8348(2017)03-0312-03

2016-07-26

2016-10-22)