葛黃顆粒對酒精性肝病模型大鼠的防治作用*

郎 涵，魏 嵋，汪 靜，米紹平，王曉棟，陳柚伶，李 志

(1.西南醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃內科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽內科，四川瀘州 646000)

論著·基礎研究

葛黃顆粒對酒精性肝病模型大鼠的防治作用*

郎 涵1，2，魏 嵋3，汪 靜3，米紹平3，王曉棟3，陳柚伶1，2，李 志2△

(1.西南醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃內科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽內科，四川瀘州 646000)

目的 通過動物實驗觀察葛黃顆粒對酒精性肝病(ALD)模型大鼠的防治作用。方法 SD大鼠分為6組：正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組，每組18只。除正常組給予蒸餾水和普通飼料外，其余各組均給予40%乙醇(1.0 mL·100 g-1·d-1)灌胃，隔日給予高脂飼料。4周后高、中、低劑量組加用不同劑量的葛黃顆粒，對照組加用美他多辛，持續(xù)8周。用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織的病理形態(tài)學改變，用全自動生化分析儀檢測血清門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)，用比色法測定肝組織的TG、TC；結果 在模型組中，血清AST、ALT、TG、TC水平，肝組織中的TG、TC水平顯著升高(P<0.05)；干預后，上述指標在高劑量組和對照組中的表達明顯降低(P<0.05)；中、低劑量組降低不明顯(P>0.05);高劑量組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；結論 葛黃顆粒對ALD有較好的防治作用。

肝疾病，酒精性；葛花；葛黃顆粒；防治作用

酒精性肝病(ALD)是長期大量飲酒所導致的一系列相關的肝臟疾病，包括輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。ALD在西方發(fā)達國家是導致肝硬化的首要病因[1]，在我國已是繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾患，給個人、家庭及社會帶來了嚴重負擔。現(xiàn)今ALD的治療方法除戒酒外，其他有效的治療方法和藥物較少，因此急需研發(fā)有效治療ALD的新藥。本研究模擬當前人類生活狀況，采用酒精與高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠ALD模型，觀察葛黃顆粒對ALD模型大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠108只，雌雄各半，質量(200±20)g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 葛黃顆粒：由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，處方組成：葛花、趕黃草、虎杖、白術、柴胡、丹參、枳椇子、甘草等，規(guī)格：每袋10.0 g。美他多辛片由山東齊都藥業(yè)有限公司生產，規(guī)格：每顆0.5 g。

1.1.3 主要試劑 無水乙醇，購自成都市科龍化工試劑廠；高脂飼料(2%膽固醇+1%豬油)，購自成都達碩生物科技有限公司；戊巴比妥鈉，購自江西漣水制藥有限公司；蘇木精-伊紅(HE)染液，肝功酶試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；三酰甘油(TG)測試盒，總膽固醇(TC)測試盒,購自浙江東甌診斷產品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥 模型組，高、中、低劑量組和對照組給予40%乙醇灌胃(1.0 mL·100 g-1·d-1)，每天1次，同時，隔天給予高脂飼料，正常組給予相同容積蒸餾水灌胃和普通飼料。每天20：00后禁食，次日上午空腹灌胃后開始進食。每周稱體質量1次，并根據(jù)體質量調整給藥劑量。4周后高、中、低劑量組加用不同劑量的葛黃解酒顆粒，給藥劑量依次為5.300、2.650、1.325 g·kg-1· d-1，對照組加用美他多辛，給藥劑量為0.090 g·kg-1·d-1，單次灌胃體積均為0.5 mL/100 g，每天灌胃1次。持續(xù)給藥8周后，抽取3只模型組大鼠，病理檢查證實ALD已經(jīng)形成，停止給藥。

1.2.2 標本采集 末次給藥后禁食12 h，不禁水，次日上午稱質量后，予以2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心留血清，-20 ℃冰箱保存，用于血清門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、TG、TC檢測。頸椎脫臼處死大鼠迅速剖取肝臟，稱取肝臟濕質量后，從每只大鼠肝臟的相同部位取2 g經(jīng)4%中性甲醛固定，用于HE染色。

1.2.3 觀測指標及方法 肝臟指數(shù)=肝濕質量/末次體質量×100%。肝組織病理學變化：肝臟組織病理學切片，HE染色，光鏡下觀察肝細胞脂肪變性程度。血清各指標檢測:按肝功酶試劑盒及血清試劑盒操作說明測定AST、ALT，血清TG、TC。肝組織各指標的測定:按TG測試盒、TC測試盒說明進行操作。

2 結 果

2.1 肝臟大體解剖學情況 正常組大鼠的肝臟呈紅褐色，包膜光滑，邊緣銳利，質地適中。模型組大鼠腹腔肥大，脂肪組織豐富，肝臟顏色呈磚紅色或黃褐色，體積增大，包膜緊張，切面油膩，可見黃色脂肪泡，呈脂肪肝外觀。4個用藥組介于正常與模型組之間，其中高劑量組與對照組肝臟外觀接近正常組。

2.2 肝臟指數(shù)的比較 與正常組[(2.57±0.15)%]相比，模型組[(2.89±0.24)%]的肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量組[(2.61±0.21)%]和對照組[(2.68±0.21)%]肝臟指數(shù)也均有一定范圍地增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，高、中、低劑量組[低劑量組：(2.80±0.48)%；中劑量組：(2.77±0.45)%]的肝臟指數(shù)均有不同程度的降低，其中高劑量組降低顯著(P<0.05)。高劑量組的肝臟指數(shù)比對照組更低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 大鼠肝組織HE染色結果顯示 正常組：肝細胞結構正常，邊界清楚，沿匯管區(qū)呈放射狀整齊排列。模型組：肝細胞顯著腫大，邊界模糊，細胞質中充滿大小不等的脂肪空泡，少數(shù)細胞核被擠到一邊，肝細胞索紊亂，肝竇及匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤。低劑量組：組織結構恢復不明顯，肝細胞腫大，細胞索紊亂，細胞質中可見明顯脂肪空泡。中劑量組：肝細胞內的脂肪空泡較低劑量組減少，且以小脂肪泡為主，但肝細胞仍有腫大，肝臟總體結構恢復不理想。高劑量組：肝細胞索恢復放射排列，大部分細胞結構已經(jīng)恢復正常，僅少數(shù)細胞輕度腫大，可見少量的微小脂肪空泡。對照組：肝臟結構恢復接近于正常，肝細胞呈放射狀排列，細胞質中基本不見脂肪空泡，見圖1、2。

A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組；F:對照組。

圖1 各組大鼠肝細胞脂肪變性程度(HE，×200)

A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組；F:對照組。

圖2 各組大鼠肝細胞脂肪變性程度(HE，×400)

2.4 大鼠血清各指標比較 模型組的AST、ALT、TG、TC的水平均較正常組顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，高、中、低劑量組AST、ALT、TG、TC的水平呈現(xiàn)出隨著劑量增加而遞減的趨勢，并且4項指標在高劑量組和模型組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高劑量組AST、ALT、TG、TC的水平已接近于正常組；對照組AST、ALT、TG、TC的水平也顯著低于其在模型組的水平(P<0.05)。高劑量組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC 比較

a:P<0.05,與正常組比較；b:P<0.05，與模型組比較。

2.5 大鼠肝組織TG、TC的比較 模型組大鼠TG、TC的水平均顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組相比，對照組大鼠TG、TC的水平均顯著降低(P<0.05)。高、中、低劑量組TG、TC的水平較模型組均不同程度降低，其中高劑量組下降顯著(P<0.05)。各項指標在高劑量組和對照組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，并且兩項指標在兩組的水平與正常組均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肝組織TG、TC比較

a:P<0.05,與正常組比較；b:P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

ALD的致病因子早已明確，即大量飲酒，且飲酒量、飲酒時間與肝臟損傷程度呈正相關[2-3]，大量研究表明無論肝臟損傷嚴重程度如何，ALD患者最基本的治療始終都是戒酒[4]。除此之外，ALD患者需要良好的營養(yǎng)支持，在戒酒的基礎上必須提供高蛋白、低脂飲食，同時補充葉酸及各類維生素也是十分必要的[5]。目前對ALD的治療除戒酒外確切有效的治療方法及藥物較少，所以，急需研究新的防治ALD的藥物及方案。 國內較多實驗證實中醫(yī)藥在治療ALD方面取得了較好的療效，有著廣闊的應用前景[6-12]。西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院全國著名老中醫(yī)、肝病專家孫同郊教授尋求古籍，博采眾家之長，結合現(xiàn)代醫(yī)學對ALD發(fā)病機制的研究成果，認為該病由“酒”所致，而酒性濕熱有毒，易傷肝脾，提出中醫(yī)在治療ALD時“解酒毒”、“護肝脾”是關鍵。經(jīng)過多年的臨床實踐，總結出了“葛黃解酒方”這一治療ALD的有效經(jīng)驗方，現(xiàn)經(jīng)現(xiàn)代工藝制成顆粒劑藥物“葛黃顆?！薄８瘘S顆粒組成藥物有：葛花、趕黃草、虎杖、白術、柴胡、丹參、枳椇子、甘草等。其中，葛花醒脾解酒為君藥；白術健脾利濕，柴胡疏肝為臣藥；丹參活血化瘀散結，虎杖、趕黃草分利大小便、清熱解毒，除煩止渴，枳椇子解酒毒，利大小便，除煩止渴共為佐藥；甘草調和藥性為使藥。全方共同體現(xiàn)“醒酒解毒、健脾疏肝、清熱利濕”之功，完全體現(xiàn)了中醫(yī)“酒毒濕熱致使肝脾腎三臟器功能失調是ALD發(fā)生、發(fā)展的關鍵”的觀點。

本實驗從肝臟指數(shù)、肝臟病理學改變、血清酶學、血脂及肝脂5個方面探討葛黃顆粒對ALD模型大鼠的保護作用。(1)肝臟指數(shù)反映了肝臟受損的情況，ALD模型大鼠的肝臟從肉眼觀察大而軟。實驗結果可以看出葛黃顆粒對肝臟指數(shù)的降低程度為高、中、低的順序，說明其對肝臟指數(shù)的作用在所選取的范圍內存在量效依賴趨勢。(2)從肝組織病理形態(tài)學觀察說明模型復制成功。所有用藥組大鼠肝細胞脂肪變均得到不同程度的改善，說明葛黃顆粒能夠改善ALD模型大鼠的肝臟病理改變。(3)血清酶學方面，乙醇進入體內，其代謝過程可生成活性氧，活性氧既可損傷線粒體又可損傷細胞膜，從而使轉氨酶進入血內，故血中的轉氨酶升高[13]。實驗結果提示葛黃顆粒具有保肝降酶的作用，且在所選劑量范圍內，保肝降酶作用與劑量呈正相關。(4)正常情況下，脂肪是以乳糜微粒(CM)的形式經(jīng)腸系膜吸收進入血液循環(huán)，再運送至肝臟、脂肪組織，形成TG[14]。TC作為血液中所有脂蛋白的膽固醇之和，與脂肪代謝關系密切，能夠反映脂代謝狀況。因此，血清中的TG、TC水平可以反映患ALD的危險度以及病理程度。本實驗結果提示葛黃解酒顆粒具有較好的降血脂作用。最后，肝臟是機體合成TG、TC的主要場所，但正常情況下并不儲存。乙醇及其代謝產物能夠促使TG的合成增加，轉運減少，引起脂肪沉淀于肝細胞內。所以監(jiān)測肝組織中的TG、TC水平較血清TG、TC的水平能更直接、準確地反映肝脂質代謝情況。本實驗結果提示模型組大鼠肝臟已有明顯脂肪堆積，模型復制成功，葛黃顆粒和美他多辛均有較好的降肝脂作用。

綜上所述，本實驗結果顯示葛黃顆?？梢越档虯LD模型大鼠的肝臟指數(shù)、血脂及肝脂，改善肝功能，減輕肝臟損傷，說明其對ALD有防治的作用。

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Preventive and treatment effect of Gehuang granules on ALD model rats*

LangHan1,2，WeiMei3，WangJing3，MiShaoping3，WangXiaodong3，ChenYouling1,2，LiZhi2△

(1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofSpleenandStomachInternalMedicine,AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofHepatobiliaryInternalMedicine,AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the preventive and treatment effect of Gehuang granules(GHG) on alcohol liver disease(ALD) model rats by the animal experiment.Methods SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group,model group,low dose group,middle dose group,high dose group,control group，18 in each group.Except the normal group was given distilled water and common fodder,the rest groups were given 40% alcohol by gavage (1.0 mL·100 g-1·d-1) and supplemented with high fat fodder on every other day.Four weeks later,the low,middle and high doses groups were added with different doses of GHG.The control group was added with metadoxine.The intervention persisted for 8 weeks.The histopathological morphology change of liver tissue was observed by HE staining.Serum AST,ALT,TG and TC were detected by the automatic biochemical analyzer.The TG and TC level in liver tissue was detected by the colorimetric method.Results The model group showed significantly increased levels of serum AST,ALT,TG,TC and levels of TG and TC in liver tissue(P<0.05)；after intervention,the expressions of above indexes in the high dose group and control group were markedly decreased(P<0.05),but the decrease in the middle dose and low dose groups were unapparent (P>0.05); the difference between the high dose and control group had no statistical significance(P>0.05).Conclusion GHG has better preventive and treatment effect on ALD.

liver disease,alcoholic;pueraria flower;Gehuang granules；preventive and treatment effect

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.006

四川省科技廳課題(2013SZ0148)；瀘州市科技局課題(2013LZLY-J24)。 作者簡介：郎涵(1990-)，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病方面研究?！?/p>

R575.1

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1671-8348(2017)03-0305-03

2016-07-19

2016-09-07)