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    響應(yīng)面試驗優(yōu)化Lipozyme TLIM催化制備共軛亞油酸結(jié)構(gòu)脂工藝

    2017-02-08 07:42:56王曉雅劉文強朱雯婷朱雪梅胡蔣寧
    食品科學 2017年2期
    關(guān)鍵詞:鍵入?;?/a>活度

    王曉雅,劉文強,朱雯婷,增 凱,朱雪梅,*,熊 華,胡蔣寧

    響應(yīng)面試驗優(yōu)化Lipozyme TLIM催化制備共軛亞油酸結(jié)構(gòu)脂工藝

    王曉雅1,劉文強1,朱雯婷1,增 凱2,朱雪梅1,*,熊 華1,胡蔣寧1

    (1.南昌大學食品學院,食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.南昌市食品質(zhì)量衛(wèi)生安全監(jiān)督檢驗中心,江西 南昌 330012)

    以Lipozyme TLIM催化茶油和共軛亞油酸乙酯制備共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)結(jié)構(gòu)脂,并調(diào)控?;w移反應(yīng)以制備Sn-2位含CLA的結(jié)構(gòu)脂。通過響應(yīng)面法研究反應(yīng)溫度、水分活度、反應(yīng)時間和底物物質(zhì)的量比對總CLA鍵入量和?;w移的影響,并優(yōu)化反應(yīng)條件。本實驗得到的結(jié)構(gòu)脂中含有36.97%的總CLA,其中12.54%的CLA分布在Sn-2位,所得總CLA及Sn-2位的CLA鍵入量均高于文獻報道。

    Lipozyme TLIM;CLA;結(jié)構(gòu)脂;?;w移

    結(jié)構(gòu)脂是通過酶法或化學方法改變脂質(zhì)的脂肪酸組成及其在甘油骨架上的位置分布,以增強營養(yǎng)治療功效或改變其物理性質(zhì)。與化學法相比,脂肪酶法具有高選擇性、反應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡單、低純化成本和環(huán)境友好等優(yōu)勢。因?qū)R恍灾久妇哂芯傻奈恢锰禺愋院土Ⅲw結(jié)構(gòu)專一性等特點,可根據(jù)需要對目標產(chǎn)品實現(xiàn)精準控制,并可以設(shè)計特定脂肪酸組成及特定結(jié)構(gòu)的油脂,因此被廣泛用于結(jié)構(gòu)脂的制備,包括中鏈-長鏈-中鏈(MLM)型結(jié)構(gòu)脂、類可可脂、母乳替代脂、低反式脂肪酸脂肪等[1-5]。

    然而隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)專一性脂酶合成結(jié)構(gòu)脂并不是專一性的,如在利用Sn-1,3專一性脂酶催化酸解法和轉(zhuǎn)酯交換法制備MLM型結(jié)構(gòu)脂時發(fā)現(xiàn)有中鏈-中鏈-長鏈(MML)型異構(gòu)體[6],在Sn-1,3專一性脂酶催化制備Sn-1,3-甘油二酯(diacylglycerol,DAG)時檢測到Sn-1,2-DAG和甘油三酯(triglyceride,TAG)[7],在用Sn-1,3專一性脂酶催化天然植物油脂制備低反式脂肪酸的固態(tài)脂肪發(fā)現(xiàn)得到Sn-2位不飽和脂肪酸減少[8]。所有結(jié)果說明專一性脂酶催化制備結(jié)構(gòu)脂的反應(yīng)過程中存在副反應(yīng)-?;w移。酰基遷移是指TAG中Sn-2位脂肪酸遷移至Sn-1,3位,或反之。國外研究指出影響?;w移的因素主要有反應(yīng)時間、溫度、有無添加溶劑、添加劑種類、反應(yīng)器的類型等[9-11],但是反應(yīng)因素影響酰基遷移的機制尚不清晰,更沒有對能否積極利用?;w移進行嘗試。由于國內(nèi)在結(jié)構(gòu)脂研究上起步較晚,分析檢測技術(shù)受到限制,對專一性脂酶催化制備結(jié)構(gòu)脂中的?;w移研究較少。

    共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是天然存在的具有抗炎、抗癌作用和提高記憶力、減肥、治療腸道疾病等多種生理活性的多不飽和脂肪酸[12]。國內(nèi)外市場上的CLA原料主要是以富含亞油酸的植物油為原料,采用化學或生物方法進行異構(gòu)化得到的CLA游離脂肪酸,而游離脂肪酸易氧化產(chǎn)生對人體有害的過氧化物且有酸味,不能作為食品添加劑直接添加到食品中。CLA甘油酯在保持其生理和營養(yǎng)功能的同時,氣味平和、更易被人體和動物吸收,是補充CLA的理想脂質(zhì)。Martinez等[13]采用專一性脂酶催化CLA游離脂肪酸和TAG制備含CLA的結(jié)構(gòu)脂,但是結(jié)果顯示CLA主要?;赥AG的Sn-1,3位。而根據(jù)脂肪代謝的研究發(fā)現(xiàn),TAG分子中Sn-2位的脂肪酸被優(yōu)先代謝吸收[14]。

    因此,本實驗以制備CLA結(jié)構(gòu)脂為模型,通過響應(yīng)面法研究三角瓶-搖床式制備CLA結(jié)構(gòu)脂的最佳條件,探討各反應(yīng)因素影響?;w移的機制。并嘗試有效利用酰基遷移副反應(yīng),通過控制反應(yīng)條件以增強酰基遷移,進而增加Sn-2位CLA的鍵入量,提高功能性CLA的吸收利用度。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    CLA(純度93%) 大連醫(yī)諾生物公司;茶油(食用一級) 江西天玉油脂公司;Lipozyme TLIM 丹麥諾維信有限公司;胰脂酶、三氟化硼甲醇溶液、牛膽鹽、Supelco 37脂肪酸甲酯混合標準品 美國Sigma公司;甲醇、乙醇、氯化鈣、鹽酸、乙酸、石油醚、KOH(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;正己烷(色譜純) 美國天地試劑公司。

    6890N氣相色譜儀 美國Agilent公司;GF254薄層層析板 青島海洋化工廠分廠;BS 224S型電子天平北京賽多利斯科學儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 共軛亞油酸乙酯(conjugated linoleic acid ethyl ester,CLAEE)的制備

    將CLA加入連有冷凝管的圓底燒瓶,預熱至70 ℃后,將預先調(diào)配好的KOH-乙醇溶液(催化劑KOH用量為CLA質(zhì)量的1.4%,醇油物質(zhì)的量比為6∶1)加入燒瓶中開始反應(yīng)。攪拌條件下反應(yīng)2~3 h,冷卻除去多余的乙醇和甘油相,剩余物經(jīng)鹽酸溶液中和,飽和氯化鈉溶液洗滌至中性,再過無水硫酸鈉柱子,即得CLAEE。反應(yīng)方程式如下:

    1.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    本實驗重點考察反應(yīng)溫度(X1)、水分活度(X2)、反應(yīng)時間(X3)、底物(CLAEE-茶油)物質(zhì)的量比(X4) 4個因素對反應(yīng)中總CLA鍵入量(Y1)和?;w移(Sn-2位CLA鍵入量Y2)的影響,根據(jù)已有實驗基礎(chǔ)[15-17],響應(yīng)面法中心組合試驗設(shè)計(central composite design,CCD)因素及水平,CCD的二項式原理如下:

    式中:Y為預測響應(yīng)值;Xi為獨立編碼變量;β0為截距;βi為線性系數(shù);βii為平方系數(shù);βij為交互作用系數(shù)。

    1.2.3 CLA-茶油結(jié)構(gòu)脂的合成

    由不同飽和鹽溶液制備得到不同水分活度,將Lipozyme TLIM、CLAEE、茶油分別置于裝有CH3COOK(水分活度為0.2)、K2CO3(水分活度為0.5)和(NH4)2SO4(水分活度為0.8)飽和鹽溶液的干燥器內(nèi),至少放置48 h,得到相應(yīng)水分活度的Lipozyme TLIM和反應(yīng)底物。按比例稱取不同水分活度的茶油、CLAEE和Lipozyme TLIM于150 mL錐形瓶中,通入氮氣以防止氧化,加入占底物質(zhì)量10%的脂酶,轉(zhuǎn)速為200 r/min。反應(yīng)結(jié)束后,過濾混合物以除去脂酶得到CLA-茶油結(jié)構(gòu)脂。

    1.2.4 Sn-2脂肪酸的制備

    稱取約10 mg樣品,加入10 mg胰脂酶、1 mL 2.2%的CaCl2溶液、2.5 mL 0.05%膽鹽溶液和10 mL Tris-HCl緩沖液,充分混勻,在37 ℃條件下水浴3 min,取出劇烈振蕩30 s,以上步驟重復3 次后加入4 mL乙醚,提取上層乙醚液并脫水濃縮用于薄層層析分離,展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比50∶50∶1),刮下2-MAG條帶,甲酯化供氣相色譜分析。

    1.2.5 脂肪酸的甲酯化及氣相色譜分析條件

    稱取2 mg油脂樣品或刮板的Sn-2 MAG置于螺口試管中。加入1.5 mL 0.5 mol/L的NaOH-MeOH溶液并充分振蕩,沸水浴加熱5 min,冷卻后加入2 mL BF3-MeOH溶液再加熱3 min后,加入2 mL正己烷和1 mL飽和NaCl溶液充分混勻,取上清液經(jīng)無水Na2SO4柱子脫水,用0.45 μm濾膜過濾用于氣相色譜分析[18]。

    采用氣相色譜分析脂肪酸甲酯,氫火焰離子檢測器,CP-Sil88石英毛細管柱(100 m×12.5 mm);載氣為H2;進樣口溫度為250 ℃;升溫程序:在45 ℃的條件下保持4 min,以13 ℃/min的速度升溫至175 ℃,保持27 min,然后再以4 ℃/min的速度升溫至215 ℃,保持35 min。利用面積歸一法得到各脂肪酸的相對百分含量。本研究中?;w移程度以Sn-2位CLA的含量為根據(jù)。

    響應(yīng)面模型的數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6方差分析,評估各因素對響應(yīng)面的影響及因素間的相互作用,并對二項式方程進行回歸分析,得出Y1和Y2最大值的反應(yīng)條件即為最佳條件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    響應(yīng)面試驗結(jié)果見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 Central composite experimental design with experimental response

    2.2 模型評價

    表2 方差分析Table2 Analysis of variance

    用軟件Design-Expert 8.0.6對表1的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析(表2)。模型P值均小于0.000 1可知回歸模型極顯著;失擬項P值均大于0.05,表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的,即回歸模型無失擬因素存在,該模型可信度高;響應(yīng)面試驗中總CLA鍵入量Y1與Sn-2位CLA鍵入量Y2的預測值與實際檢測值一致,其中Y1的回歸系數(shù)R2(0.996 6)與校正系數(shù)R2Adj(0.992 7)相近且均大于0.9,Y2回歸方程R2(0.956 9)與校正系數(shù)R2Adj(0.906 6)比較相近,表明Y1與Y2的試驗值與預測值有較好的擬合度,此模型可用于結(jié)果的預測。以上結(jié)果均表明該模型不失擬且可有效說明各因素對響應(yīng)值的影響及因素間的相互作用關(guān)系,可有效優(yōu)化響應(yīng)值。

    表2的各項回歸系數(shù)表明,一次項模型多項式各因素中對于Y1和Y2影響的P值皆小于0.05,說明所選各單因素對響應(yīng)值有顯著影響,且X3、X4對Y1和Y2影響的比較一致,根據(jù)P值小于0.000 1表示其對Y1和Y2有極顯著的影響。在Y1的二次項中,X1X3和X3X4對Y1有顯著的相互作用。而對Y2而言,X1與X4、X2與X3、X3與X4之間的相互作用顯著(P<0.05)。

    2.3 各因素及交互作用對總CLA鍵入量的影響

    由圖1可以看出,溫度在50~60 ℃范圍內(nèi)總CLA鍵入量緩慢增加;而溫度在60~70 ℃時,總CLA鍵入量又緩慢下降,結(jié)果表明:適當提高反應(yīng)溫度可以提高酶活性(Lipozyme TLIM的最適反應(yīng)溫度為55~70 ℃),并能降低反應(yīng)體系的黏度,加速底物分子的熱運動,有利于反應(yīng)進行;但過高的溫度對酶的空間結(jié)構(gòu)影響較大,酶的使用壽命減少,同時會減緩反應(yīng)速度[11]。

    反應(yīng)時間對CLA鍵入量的影響與溫度截然相反,即隨著反應(yīng)時間的延長總CLA的鍵入量先緩慢減少后增加,可能因為專一性脂酶TLIM催化CLA脂肪酸與茶油Sn-1,3位的酸解反應(yīng)在2 h內(nèi)已達到平衡狀態(tài),隨著反應(yīng)時間繼續(xù)延長,副反應(yīng)酰基遷移增加,部分CLA轉(zhuǎn)移至甘油骨架的Sn-2位,導致總CLA繼續(xù)增加。

    水分活度為0.2~0.5時對總CLA鍵入量的影響幅度不大,而當水分活度大于0.5時可顯著增加總CLA鍵入量。這個結(jié)果表明水是影響脂酶催化活性的重要因素。脂酶是大分子蛋白質(zhì),水分子直接或間接地通過氫鍵、靜電作用、疏水鍵、范德華力等分子力維持著酶分子的活性構(gòu)象。但是在水溶液中不是所有的水分子都與酶的催化活性構(gòu)象有關(guān),只有那些與脂酶分子緊密結(jié)合的一層單分子水化層會影響酶的催化活性構(gòu)象,所以維持酶催化活性構(gòu)象的這一層“緊密結(jié)合的水”被稱為酶的“必須水”,只要有“必須水”的存在,即使是無水環(huán)境脂酶仍可以維持催化活性構(gòu)象并具有催化活性,這也是我們這里測水分活度而不是水分含量的原因。然而,脂酶的最佳水分活度尚不清楚,本實驗發(fā)現(xiàn)只有水分活度大于0.5時,對總CLA鍵入量才有顯著影響,說明只有水分活度高于0.5才能維持脂酶的催化活性構(gòu)象。

    各影響因素中底物物質(zhì)的量比對總CLA鍵入量的影響最大??侰LA鍵入量隨底物物質(zhì)的量比的增加而增加,但是CLA質(zhì)量濃度越大,CLA鍵入量的增加量越小。這是因為甘油三酯有3 個?;擟LAEE與茶油物質(zhì)的量比為1∶1時,底物中CLA占總脂肪酸的1/4,但是Sn-1,3-專一性脂酶只能水解和酯化甘油三酯的1,3位,即底物中1 mol CLA與2 mol甘油酯的脂肪酸發(fā)生碰撞進行交換,所以脂酶可利用的CLA占1/3,反應(yīng)后Sn-1,3位的CLA含量的理想值為1/3,而在總甘油三酯中CLA的含量為1/3×2/3=22%;依次類推當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比是2∶1時,總CLA鍵入量的理論值為33%,底物物質(zhì)的量比為3∶1時,總CLA鍵入量理論值為40%,即底物物質(zhì)的量比越高甘油三酯內(nèi)CLA增加量越少。

    2.4 各因素及交互作用對Sn-2位CLA鍵入量的影響

    圖2 各因素對Sn-2位CLA鍵入量的影響Fig. 2 Effects of reaction temperature (X1), time (X2), water activity (X3) and molar ratio of substrates (X4) on Sn-2 positional CLA content

    整個轉(zhuǎn)酯交換反應(yīng)都是動態(tài)變化的,反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、水分活度和底物物質(zhì)的量比對總CLA鍵入量的影響非常復雜,而總CLA鍵入量又會影響Sn-2位CLA或被Sn-2位CLA正影響。各因素的復雜影響在Sn-2位CLA鍵入量中完全表現(xiàn)出來,如圖2所示,在溫度為50~54 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高Sn-2位CLA鍵入量緩慢降低,因為在這個溫度范圍內(nèi)Sn-1,3專一性脂酶TLIM的催化活性逐漸增強,脂酶的活性越強其空間選擇性越強,發(fā)生酰基遷移副反應(yīng)的幾率越小,因此Sn-2位CLA鍵入量是減少的趨勢。Sn-2位CLA鍵入量在54~60 ℃內(nèi)緩慢增加,當反應(yīng)溫度超過60 ℃時,隨著溫度升高Sn-2位CLA鍵入量迅速增加,說明溫度越高,體系的酰基遷移程度越高,可能原因是反應(yīng)體系中分子熱運動過快使酰基遷移增加,且溫度過高會影響脂酶的空間構(gòu)象及其催化選擇性進而也會增加?;w移程度。

    水分活度(0.2~0.8)對Sn-2位CLA鍵入量是線性正相關(guān)的影響。Oda等[19]的研究也得到了相似的結(jié)論??赡茉蚴牵只疃仍降?,Sn-1,3專一性脂酶的催化活性越弱,當水解一分子甘油三酯中的一個脂肪酸(α位)后,生成的中間產(chǎn)物(Sn-1,2(或2,3)-DAG)需要酯化另一分子的脂肪酸等待時間越長,其反應(yīng)中間體的停留時間越長,所以即使脂酶催化活性很弱也會發(fā)生?;w移;另一方面,因為高活性的脂酶催化會產(chǎn)生大量含有CLA 的中間體即Sn-1,2(或2,3)-DAG,為?;w移提供了足夠的前體化合物,也會使?;w移增加。再者如果水分活性過高,多余水分子的羥基帶有孤電子對,對中間產(chǎn)物甘油二酯酶復合物的仲羰基碳原子形成親核攻擊,造成?;w移程度加深[20]。

    反應(yīng)時間對Sn-2位CLA鍵入量的影響也趨近于線性正相關(guān),但是反應(yīng)時間的影響極顯著,其遠遠強于反應(yīng)溫度和水分活度的影響。如圖2所示,當其他因素處于中心點時(0水平),反應(yīng)時間從2 h延長至10 h使得Sn-2位CLA鍵入量從3.54%增加至8.50%。這個結(jié)果表明增強?;w移最簡單的辦法即為延長反應(yīng)時間,反之如抑制?;w移則需縮短反應(yīng)時間[10,21]。

    除了反應(yīng)時間,底物物質(zhì)的量比對Sn-2位CLA鍵入量的影響也極顯著。在1∶1~2∶1范圍內(nèi)隨著底物中CLA物質(zhì)的量的增加,Sn-2位CLA鍵入量也增加,但是當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比大于2∶1以后Sn-2位CLA鍵入量增速緩慢,當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比達到2.7∶1后Sn-2位CLA鍵入量不再增加達到最大化。底物物質(zhì)的量比對?;w移的影響歸因于對總CLA鍵入量的影響,如圖1、2所示,底物物質(zhì)的量比對總CLA和Sn-2位CLA的影響趨勢完全一致。

    反應(yīng)溫度與底物物質(zhì)的量比、水分活度與反應(yīng)時間、反應(yīng)時間與底物物質(zhì)的量比兩兩間相互作用對Sn-2位CLA均有顯著影響,各因素在本研究所選的水平范圍內(nèi)皆是正影響,馮永方等[22]在棕櫚酸的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。

    2.5 模型優(yōu)化及驗證實驗

    對試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸分析,得到回歸方程如下:

    用Design-Expert軟件對模型進行優(yōu)化,取Y1和Y2的最大值,得出最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度69.6 ℃、水分活度0.8、反應(yīng)時間10 h、底物物質(zhì)的量比3∶1,此時Y1和Y2分別為36.9%和12.8%。

    在優(yōu)化條件下進行驗證實驗,實際得到的結(jié)構(gòu)脂中總CLA含量為36.97%,Sn-2位CLA含量為12.54%,與理想接近,此模型優(yōu)化得到的合成條件準確可靠。本實驗在最優(yōu)條件下得到的CLA結(jié)構(gòu)脂高于已有文獻報道。如Goli等[23]用7% TLIM在55 ℃條件下催化CLA(質(zhì)量分數(shù)40%)和葵花籽油反應(yīng)48 h得到的結(jié)構(gòu)脂中含有26.6%的CLA。惠菊[24]用非專一性脂酶Novozyme 435催化CLA和葵花籽油,在底物物質(zhì)的量比3.55∶1、脂酶用量13.7%、反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時間37 h的條件下得到結(jié)構(gòu)脂中含有17.1%的總CLA和2.89%的Sn-2位CLA;惠菊用的是非專一性脂酶但是Sn-2位CLA也僅有2.89%,也就是說CLA并不是均一分布在甘油骨架上。盡管本研究用的是專一性脂酶,但是經(jīng)過促進?;w移使Sn-2位CLA含量達到了12%。

    3 討 論

    Sn-1,3專一性脂酶只能水解或酯化Sn-1,3位脂肪酸,而水分活度不同明顯影響?;w移,可能機理如下:在本反應(yīng)中底物是茶油(以三油酸甘油酯為主)和CLAEE,Sn-1,3專一性脂酶Lipozyme TLIM催化反應(yīng)的第一步是甘油三酯上的Sn-1(3)脂肪酸水解,生成游離脂肪酸和中間體Sn-2,3(1,2)-DAG,而在熱反應(yīng)體系下,體系的能量較高,Sn-1,2-DAG易?;w移生成Sn-1,3-DAG;反之也會有少量的Sn-1,3-DAG發(fā)生?;w移生成Sn-1,2(2,3)-DAG。但Sn-1,3專一性脂酶不能將Sn-1,3-DAG結(jié)構(gòu)中Sn-2上的羥基酯化合成甘油三酯,卻可以水解Sn-1,3-DAG生成游離脂肪酸和甘油單酯等副產(chǎn)物,所以即使在酯內(nèi)交換和轉(zhuǎn)酯交換的反應(yīng)中也會產(chǎn)生副產(chǎn)物游離脂肪酸和單甘脂[25]。多數(shù)學者認為?;w移屬于SN2親核取代反應(yīng)體系[20,26](圖3),Sn-2,3(1,2)-甘油二酯中羥基上氧的孤立電子對進攻臨位的羰基碳,形成一個過渡態(tài)中間體-5原子酯環(huán),過渡態(tài)中間體不穩(wěn)定,原酯的碳氧單鍵斷裂生成?;w移產(chǎn)物Sn-1,3-甘油二酯,Sn-2位脂肪酸遷移至Sn-1位。然而過渡態(tài)中間體很難捕捉且不穩(wěn)定,難以進一步從理論和實驗中加以證實。

    圖3 酰基遷移的SN2親核取代反應(yīng)機理Fig. 3 SN2 nucleophile substitution reaction mechanism of acyl migration

    文獻報道指出反應(yīng)溫度和時間是影響?;w移最主要的兩個因素,本研究組也在實驗中發(fā)現(xiàn)這兩個因素顯著影響?;w移。此外,本實驗也發(fā)現(xiàn)?;w移與反應(yīng)時間正相關(guān),說明?;w移過程是熱力學且非酶參與過程。同理,根據(jù)阿倫尼烏斯方程,溫度越高,底物的黏度越小,物質(zhì)間傳質(zhì)越快,反應(yīng)速度越快,副反應(yīng)如?;w移的速度也越快。但是在實驗中發(fā)現(xiàn)當溫度低于脂酶最佳催化溫度時反而會增加?;w移程度,在54~60 ℃時對?;w移的影響較小;而溫度大于60 ℃時酰基遷移會迅速增加,因為低溫時脂酶催化活性和選擇性較差,這個結(jié)果證明,?;w移與脂酶的活性有一定關(guān)系。另外,水分含量影響脂酶的構(gòu)象進而影響脂酶的催化活性和選擇性,說明?;w移與脂酶的選擇性相關(guān)。所以酰基遷移副反應(yīng)是一個熱力學和脂酶催化選擇性共同影響的結(jié)果。

    酰基遷移在專一性脂酶催化制備結(jié)構(gòu)脂的反應(yīng)中不可避免,但是可以調(diào)控。在已有文獻報道中,?;w移都是不理想的副反應(yīng),主要研究如何抑制?;w移,即在保證主反應(yīng)最大化的同時盡量縮短反應(yīng)時間和降低反應(yīng)溫度[11]、選擇合適的反應(yīng)器[27]、底物類型[10]和水分活度[17]。然而本實驗發(fā)現(xiàn)在一定情況下酰基遷移是有益的,如在專一性脂酶催化條件下可以利用?;w移把功能性脂肪酸(如本實驗的CLA)目的性地轉(zhuǎn)移到Sn-2位,一方面Sn-2位功能性脂肪酸的生物利用率比Sn-1,3位更高[28],且最新報道指出多不飽和脂肪酸位于Sn-2位可增強其氧化穩(wěn)定性[29]。另一方面目標脂肪酸鍵入到Sn-2位降低了反應(yīng)體系中CLA的平衡濃度。此外,本實驗中隨著底物物質(zhì)的量比的增加,總CLA的鍵入量并不是按比例增加的,比例越高總CLA鍵入量增加的越少,換言之,擴大反應(yīng)體系達到平衡的“容量”,降低反應(yīng)平衡的瓶頸值,可以促進CLA的鍵入。假設(shè)?;w移最大化即Sn-2位CLA鍵入幾率與Sn-1,3位的幾率一致,可以推斷當CLAEE與茶油物質(zhì)的量比為1∶1時,底物中1 mol CLA與3 mol甘油酯的脂肪酸發(fā)生碰撞進行交換,反應(yīng)后甘油三酯中CLA理論值為25%;依次類推當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比為2∶1時,總CLA的理論值為40%;底物物質(zhì)的量比為3∶1時,總CLA的理論值為50%;分別高于未發(fā)生?;w移的22%、33%和40%。因此,在本反應(yīng)中可以利用這一機理有效增加目標脂肪酸的鍵入量。

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    Optimization of Production of Structured Lipids Containing Conjugated Linoleic Acid by Lipozyme TLIM Catalysis

    WANG Xiaoya1, LIU Wenqiang1, ZHU Wenting1, ZENG Kai2, ZHU Xuemei1,*, XIONG Hua1, HU Jiangning1
    (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Scicence and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Nanchang Food Quality Health Safety Supervision and Inspection Center, Nanchang 330012, China)

    In this study, structured lipids containing conjugated linoleic acid (CLA) were produced from the reaction between camellia seed oil and CLA ethyl ester catalyzed by Lipozyme TLIM, where Sn-2 positional CLA was obtained by enhancing acyl migration. Four reaction parameters, namely temperature, water activity, reaction time and molar ratio of substrates, were optimized by response surface methodology (RSM) for improved total CLA incorporation and acyl migration. In the synthesized structured lipids, total and Sn-2 positional CLA were up to 36.97% and 12.54% when acyl migration was maximized. The incorporation ratios of total CLA and Sn-2 positional CLA were both higher than the published data.

    Lipozyme TLIM; CLA; structured lipid; acyl migration

    10.7506/spkx1002-6630-201702034

    TQ645

    A

    1002-6630(2017)02-0214-06

    王曉雅, 劉文強, 朱雯婷, 等. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化Lipozyme TLIM催化制備共軛亞油酸結(jié)構(gòu)脂工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 214-219. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702034. http://www.spkx.net.cn

    WANG Xiaoya, LIU Wenqiang, ZHU Wenting, et al. Optimization of production of structured lipids containing conjugated linoleic acid by Lipozyme TLIM catalysis[J]. Food Science, 2017, 38(2): 214-219. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201702034. http://www.spkx.net.cn

    2016-04-11

    國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(31460427);國家自然科學基金面上項目(31571870);食品科學與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助課題(SKLF-ZZB-201510)

    王曉雅(1993—),女,碩士研究生,研究方向為糧食油脂與蛋白質(zhì)工程。E-mail:765502833@qq.com

    *通信作者:朱雪梅(1982—),女,副教授,博士,研究方向為糧食油脂與蛋白質(zhì)工程。E-mail:zhuxuemei@ncu.edu.cn

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