小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的克隆、表達(dá)及重組酶性質(zhì)

劉 光，胡松青，張婷婷，王敬敬，李 琳，侯 軼*

小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的克隆、表達(dá)及重組酶性質(zhì)

劉 光1,2，胡松青1,2，張婷婷1,2，王敬敬1,2，李 琳1,2，侯 軼1,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

目的：克隆小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（wheat protein disulfide isomerase，wPDI）基因，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)并探究其酶學(xué)性質(zhì)。方法：以小麥種子總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增得到wpdi，并以pET-30b為表達(dá)載體、大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬螯合層析純化后進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果：克隆的基因全長(zhǎng)1 548 bp，與“Wyuna”品種小麥wpdi基因相似性達(dá)99%。構(gòu)建了pET-30b-wpdi表達(dá)載體，獲得wPDI的最佳表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度22 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間6 h，誘導(dǎo)劑濃度0.5 mmol/L。該酶含4 個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，分子質(zhì)量約為66.2 kD，具有二硫鍵的還原酶和異構(gòu)酶活性以及分子伴侶活性。結(jié)論：對(duì)重組wPDI的表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究，為wPDI在面制品加工及其他方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶；克??；表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是一種位于真核生物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的巰基/二硫鍵氧化還原酶，對(duì)催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈氧化折疊、維持蛋白以及細(xì)胞功能具有重要作用[1]。PDI主要由4 個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以a、b、b′和a′的順序排列。其中，a和a′含有獨(dú)立的催化巰基/二硫鍵交換的活性位點(diǎn)，不同物種間活性位點(diǎn)高度保守，皆為CXXC基序[2]。PDI具有酶學(xué)活性和分子伴侶活性。酶學(xué)活性包括二硫鍵的氧化、還原和異構(gòu)酶活性；PDI的分子伴侶活性指PDI能幫助新生肽鏈正確折疊并抑制因錯(cuò)誤折疊引起的蛋白凝沉作用[2-3]。

自從Anfinsen發(fā)現(xiàn)PDI以來(lái)，動(dòng)物和真菌來(lái)源PDI的功能和結(jié)構(gòu)得到了較為深入的研究，如人和酵母PDI的立體結(jié)構(gòu)已被解析，相關(guān)生理機(jī)制已被闡明[4-5]。相比之下，植物來(lái)源PDI的研究較局限，主要聚焦于基因序列的克隆、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及細(xì)胞定位等方面[6-8]，對(duì)功能、性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)的研究較缺乏。

小麥PDI（wheat PDI，wPDI）參與了面筋蛋白中二硫鍵的生物合成，因此，其被認(rèn)為是一種潛在的面粉改良劑[9]。Watanabe等[10]的研究指出牛來(lái)源PDI在面粉改良中的作用類似于溴酸鉀。Every等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，小麥PDI在抗壞血酸協(xié)同下能夠提高面包質(zhì)量。因此，鑒于wPDI潛在的面制品工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，臧聞等[12]利用大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)了重組wPDI，但目的蛋白表達(dá)量低且作者未對(duì)重組蛋白做進(jìn)一步研究。

本研究將從小麥幼苗中克隆的wpdi基因連到表達(dá)載體pET-30b上，在大腸桿菌BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的大量可溶表達(dá)。酶活性研究發(fā)現(xiàn)，wPDI具有酶學(xué)活性和分子伴侶活性。這些結(jié)果為wPDI在面制品加工及其他方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 宿主菌株與質(zhì)粒

“中優(yōu)9507”小麥種子，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；克隆菌株E.coli DH5α、表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）、pMD19-T和pET-30b載體 寶生物工程有限公司。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨和酵母提取粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶和超螺旋DNA定量Marker寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHⅠ和T4連接酶 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；通用型RNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒 廣州東盛生物有限公司；DNA小提試劑盒 天根生物科技有限公司；胞苷2’,3’-環(huán)-磷酸單鈉鹽（cytidine 2’,3’-cyclic monophosphate，2’,3’-cCMP） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。β-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等（均為分析純） 健陽(yáng)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EDC-80聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Nanovue Plus超微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥總RNA提取

“中優(yōu)9507”小麥種子于30 ℃和相對(duì)濕度85%條件下避光培養(yǎng)8～9 d后，取10 cm葉片剪成小段，置于液氮中研磨成粉末，并按照通用型RNA提取試劑盒操作方法，提取小麥黃化苗葉片總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度與純度后，用于反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增基因產(chǎn)物。

1.3.2 wpdi基因克隆

以提取得到的總RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV作用下先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min后，于70 ℃溫育5 min終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得wpdi基因。PCR擴(kuò)增引物是根據(jù)NCBI上提供的wpdi基因序列為模板，利用Primer Premier 3.0 設(shè)計(jì)而出，上、下游引物分別為：F1：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’和R1：5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min后，按以下的參數(shù)進(jìn)行35 次循環(huán)：98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸120 s。最后72 ℃延伸5 min擴(kuò)增結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒回收wpdi基因。純化后的wpdi基因優(yōu)先連接到pMD19-T載體上保存。隨后，從pMD19-T載體上，按照上述相同條件擴(kuò)增出不含信號(hào)肽序列的wpdi基因，擴(kuò)增引物分別為：F2：5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’和R2：5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。其中，下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)、回收純化后于－20 ℃保存。

1.3.3 wPDI表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

對(duì)wpdi基因回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-30b質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，回收純化后得到wpdi基因和表達(dá)載體pET-30b的雙黏性末端DNA片段，加入T4 DNA連接酶，22 ℃連接30 min后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布至含有硫酸卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB平板培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。菌落長(zhǎng)成后，隨機(jī)挑選單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定。將經(jīng)雙酶切和電泳驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET-30b-wpdi送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank上wpdi基因mRNA進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)重組質(zhì)粒序列信息。

1.3.4 wPDI的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

將測(cè)試無(wú)誤的pET-30b-wpdi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）和C43（DE3）中，涂布在含Kan的LB平板培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取形態(tài)飽滿的單克隆接種到含有Kan的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液以1∶100（V/V）的比例轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中，相同條件下再培養(yǎng)2～3 h，至菌液OD600nm為0.5～0.6后，吸取200 μL菌液，作為0 h非誘導(dǎo)對(duì)照樣品，向剩余菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為0.3 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后吸取200 μL菌液。剩下菌液離心收集菌體細(xì)胞，加入0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）重懸樣品，在冰浴中超聲波破碎，超聲條件：功率200 W，占空比0.4∶0.6，超聲時(shí)間15 min。菌液破碎后于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析重組蛋白的表達(dá)和可溶性形式。

1.3.5 Western-blot分析

將wpdi基因的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western-blot分析[13-14]。一抗為鼠抗His單克隆抗體，工作濃度為1∶5 000（V/V）。二抗為羊抗鼠IgG單克隆抗體，工作濃度為1∶10 000（V/V），最后使用二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色。

1.3.6 wPDI的表達(dá)條件優(yōu)化

含重組質(zhì)粒pET-30b-wpdi的工程菌BL21（DE3）接種于含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間（4、5、6、7 h）、表達(dá)溫度（37、22 ℃）以及IPTG濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L）對(duì)重組蛋白表達(dá)水平的影響。收集200 μL菌液，離心去上清液，對(duì)沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定最適表達(dá)條件。

1.3.7 重組wPDI分離純化

大量發(fā)酵后獲得的菌體按照每g菌體加入5 mL平衡緩沖液（20 mmol/L Tris，20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）重懸，按1.2.4節(jié)所述條件超聲破碎菌體至澄清透明。4 ℃、8 000 r/min離心15 min，獲得的上清液過(guò)0.45 μm的微濾膜，進(jìn)一步去除微小顆粒，防止堵塞色譜柱。

過(guò)濾后的上清液載入到預(yù)平衡的Ni-NTA親和柱中，先用平衡緩沖液洗去未與柱子結(jié)合的蛋白，然后再用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）按照梯度洗脫方式洗脫柱子，流速為2 mL/min，收集洗脫峰流出液，分別取10 μL洗脫液作SDS-PAGE分析，并用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度（εwPDI＝0.729 mL/（mg·cm））[15]。

1.3.8 重組wPDI活性測(cè)定

二硫鍵還原酶活性：wPDI能將以二硫鍵交聯(lián)的胰島素還原成A、B單鏈，B鏈隨后發(fā)生聚集沉淀，通過(guò)測(cè)定特定波長(zhǎng)吸光度變化可以反映wPDI的還原酶活性[16]。反應(yīng)體系為：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，2 mmol/L EDTA，30 μmol/L胰島素，不同質(zhì)量濃度（25、50、75、100 μg/mL和125 μg/mL）wPDI，加入3.3 mmol/L二硫蘇糖醇啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)630 nm處吸光度變化。以添加相同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)任何蛋白添加為陰性對(duì)照。

二硫鍵異構(gòu)酶活性：wPDI能夠糾正蛋白質(zhì)因錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的二硫鍵錯(cuò)配，恢復(fù)其天然配對(duì)方式。以錯(cuò)誤二硫鍵折疊的變性RNA酶（scrambled RNase，sRNase）為底物，探究wPDI的異構(gòu)活性。sRNase的制備參照Walker等[17]的方法。反應(yīng)體系如下：0.1 mol/L Tris，1.2 mmol/L還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），8.4 μmol/L sRNase，1.4 μmol/L wPDI，4.5 μmol/L 2’,3’-cCMP。測(cè)定296 nm波長(zhǎng)處吸光度變化。

分子伴侶活性：wPDI的分子伴侶活性表現(xiàn)為抑制變性蛋白的凝沉，并恢復(fù)其天然構(gòu)象的性質(zhì)[18]。以鹽酸胍變性的三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）為底物，稀釋作用下，探究不同濃度wPDI（10、20、30 μmol/L和40 μmol/L）對(duì)其聚集抑制率的影響。鹽酸胍變性的GAPDH的制備參照Cai等[19]的方法。反應(yīng)體系如下：2.5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），wPDI（10、20、30 μmol/L和40 μmol/L），最后加入2.8 μmol/L變性的GAPDH，于488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度變化。以添加相同濃度的BSA為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)任何蛋白質(zhì)添加為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和wpdi基因的擴(kuò)增

用植物RNA提取試劑盒提取“中優(yōu)9507”小麥黃化苗葉片總RNA，由圖1A可見(jiàn)，小麥總RNA在圖中顯示3個(gè)條帶，從上到下分別為28S、18S和5S條帶，其中28S的RNA條帶粗于18S的RNA。5S的RNA條帶輕微彌散，說(shuō)明總RNA存在少量降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)得總RNA的質(zhì)量濃度約為525.6 ng/μL，A260nm/A280nm為2.04。該結(jié)果表明，總RNA的完整性良好，符合反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)要求。

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并進(jìn)一步以此為模板，PCR擴(kuò)增得到wpdi基因產(chǎn)物。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 500 bp左右的位置出現(xiàn)一條明亮的條帶，與wpdi基因全長(zhǎng)1 548 bp基本一致（圖1B）。

圖1 小麥黃化苗葉片總RNA提?。ˋ）和反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物（B）Fig. 1 Electrophoresis of total RNA extracted from etiolated wheat leaves (A) and reverse transcription-PCR amplified product (B)

2.2 wpdi基因的克隆載體構(gòu)建

圖2 菌落PCR分析Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplified products of monoclonal colonies

wpdi基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至克隆載體pMD19-T上，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。如圖2所示，陽(yáng)性菌落擴(kuò)增條帶較亮，且位置正確，在1 500 bp左右，與預(yù)計(jì)大小基本相同；陰性菌落擴(kuò)增的條帶則較暗。將3、4和5條帶對(duì)應(yīng)的單克隆送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，3號(hào)和4號(hào)基因序列不全，存在堿基缺失。5號(hào)的基因序列完整，且與NCBI上品種為“Wyuna”（序列號(hào)：AF262979.1）的小麥PDI序列相似性最高，達(dá)99%，僅一個(gè)堿基不同，且這個(gè)堿基位于信號(hào)肽部位。說(shuō)明品種“中優(yōu)9507”的小麥與品種為“Wyuna”的小麥編碼PDI的基因無(wú)差別。

2.3 wpdi基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar軟件分析，wpdi基因編碼蛋白質(zhì)全長(zhǎng)515 個(gè)氨基酸，理論蛋白分子質(zhì)量為56.7 kD，理論等電點(diǎn)為4.9。NCBI顯示wPDI的4 個(gè)結(jié)構(gòu)域分布如下：第42～145位氨基酸為a結(jié)構(gòu)域，第153～246位氨基酸為b結(jié)構(gòu)域，第263～363位氨基酸為b’結(jié)構(gòu)域，第383～484位氨基酸為a’結(jié)構(gòu)域。

wPDI氨基酸序列和已公開(kāi)報(bào)道物種（包括大麥、檸檬、甘薯、酵母和人）的PDI氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。4 種植物來(lái)源的PDI高度同源，小麥與大麥、檸檬和甘薯的相似性分別達(dá)96.7%、60.9%和58.6%。而wPDI與人和酵母來(lái)源的PDI相比，相似性較低，只有30%左右。通過(guò)NetNGlyc 1.0 Server在線軟件（http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，4 種植物PDI上只有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，且位置相同（綠色陰影標(biāo)示），酵母PDI有5 處（橙色陰影標(biāo)示），人PDI有2 處（紫色陰影標(biāo)示）。對(duì)不同來(lái)源wPDI保守區(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，催化活性位點(diǎn)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)肽仍是高度保守的。6 個(gè)物種的活性位點(diǎn)都含CGHC序列，而人PDI a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)（CTHC）除外（紅色框標(biāo)示）。4 種植物PDI的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)肽都為KDEL，酵母PDI為HDEL，人PDI的為KEEL（淺藍(lán)色陰影標(biāo)示）。

圖3 PDI氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Alignment of the deduced amino acid sequences of PDI from different species

2.4 wpdi基因的表達(dá)載體構(gòu)建

圖4 菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）Fig. 4 PCR Analysis of positive monoclonal colonies (A) and identification of recombinant plasmid (B) by double restriction enzyme digestion

從pMD19-T-wpdi上亞克隆不含信號(hào)肽序列的wpdi基因，連接至pET-30b表達(dá)載體上。所選酶切位點(diǎn)分別為BamHⅠ和XhoⅠ。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，菌落長(zhǎng)成后進(jìn)行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定。由圖4A可見(jiàn)，挑取的單克隆皆為陽(yáng)性，雖然有拖帶和非特異性擴(kuò)增，但目的基因位置明確。雙酶切結(jié)果表明，外源基因已正確插入到pET-30b載體內(nèi)，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-30b-wpdi（圖4B）。

2.5 wPDI的重組表達(dá)和Western-blot分析

圖5 wPDI表達(dá)檢測(cè)（A）、可溶性（B）和Western-blot分析（C）Fig. 5 SDS-PAGE (A), soluble expression (B) and Western-blot (C) analysis of recombinant wPDI protein

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30b-wpdi分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）和C43（DE3）中，進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖5A所示。wPDI在兩種表達(dá)菌中都有表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物在凝膠上的分子質(zhì)量約為66.2 kD，比理論值60.5 kD（含表達(dá)標(biāo)簽）偏高。有研究報(bào)道，重組蛋白所帶的His融合標(biāo)簽可能是引起這種偏差的原因[20]。wPDI的C-和N-端都帶有His融合標(biāo)簽，該標(biāo)簽中的堿性氨基酸能夠造成重組蛋白在SDS-PAGE中遷移變慢，從而引起測(cè)定分子質(zhì)量比理論分子質(zhì)量偏大。相比于大腸桿菌C43（DE3），BL21（DE3）表達(dá)菌株表達(dá)目的蛋白水平更高，且呈可溶表達(dá)（圖5B），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇BL21（DE3）為表達(dá)宿主菌。

為驗(yàn)證誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為帶His標(biāo)簽的目的蛋白，采用Western-blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。由圖5B所示，Western-blot采用DAB顯影，背景顏色深，顯色雖不明顯但仍能看到相關(guān)的特異性條帶，表明BL21（DE3）和C43（DE3）這兩種宿主菌所表達(dá)的蛋白確為帶His標(biāo)簽的目的蛋白，能夠用于鎳離子螯合層析進(jìn)行分離純化。

2.6 wPDI的表達(dá)條件優(yōu)化

圖6 wPDI的表達(dá)條件優(yōu)化Fig. 6 Optimization of expression conditions for wPDI

2.6.1 誘導(dǎo)劑濃度

在確定了最佳表達(dá)宿主菌為BL21（DE3）后，優(yōu)先考察誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)重組wPDI表達(dá)量的影響。在相同誘導(dǎo)溫度（37 ℃）和時(shí)間（6 h）條件下，0.5 mmol/L的IPTG濃度能夠誘導(dǎo)表達(dá)最大量的wPDI，提高IPTG濃度對(duì)表達(dá)量影響不明顯（圖6A），但是過(guò)高的IPTG濃度容易殺死大腸桿菌細(xì)胞以及導(dǎo)致包涵體的產(chǎn)生[21]。因此，選擇0.5 mmol/L IPTG為最適誘導(dǎo)劑濃度。

2.6.2 誘導(dǎo)溫度

在IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間6 h條件下，考察誘導(dǎo)溫度（37、22 ℃）對(duì)wPDI表達(dá)量的影響。結(jié)果如圖6B所示，在相同誘導(dǎo)條件下，選擇的兩個(gè)誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白wPDI的表達(dá)量無(wú)顯著差別，但是在后續(xù)的純化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低溫22 ℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的目的蛋白，對(duì)親和層析柱的結(jié)合能力較強(qiáng)，易于分離出較高純度的目的蛋白，因此選擇溫度22 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)。究其原因可能是低溫誘導(dǎo)下降低了大腸桿菌生長(zhǎng)速率和重組蛋白的合成速率，有利于重組蛋白的正確折疊，減少因蛋白錯(cuò)誤折疊引起的His標(biāo)簽包埋，從而提高了分離純化效率[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇溫度22 ℃進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)。

2.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間

在IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度37 ℃或22 ℃條件下，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組wPDI表達(dá)量的影響。如圖6C、D所示，兩個(gè)溫度條件下，目的蛋白的表達(dá)量在誘導(dǎo)時(shí)間6 h時(shí)最高，在7 h時(shí)有所下降，可能是由于過(guò)高的IPTG濃度對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生了一定的毒性，抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。因此，確定IPTG最適誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

2.7 wPDI的親和純化

圖7 wPDI親和純化電泳分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of wPDI after affini ty chromatography

重組蛋白wPDI的C-和N-端都帶有His標(biāo)簽，容易與Ni2+螯合，利用金屬螯合層析可以較方便地分離純化蛋白。如圖7所示，在所選的層析條件下，依靠鎳離子與重組蛋白His標(biāo)簽的特異性螯合作用，一步純化即得到電泳純目的蛋白。在咪唑濃度為150 mmol/L的洗脫液洗脫下，雖有少量目的蛋白開(kāi)始流出，但是該洗脫峰中雜蛋白含量高；在咪唑濃度為200 mmol/L的洗脫液洗脫下，大部分目的蛋白流出，且雜蛋白含量較少，達(dá)到了電泳純，可用于wPDI酶學(xué)性質(zhì)的研究。

2.8 wPDI的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.8.1 wPDI的二硫鍵還原酶活性

圖8 不同重組wPDI添加量對(duì)胰島素還原的影響Fig. 8 Effect of different amounts of recombinant wPDI on reduction of insulin

wPDI能夠還原胰島素A-B兩條鏈間的二硫鍵，引起B(yǎng)鏈的聚集。如圖8所示，以30 μmol/L胰島素為底物，考察了不同質(zhì)量濃度wPDI對(duì)胰島素還原的最佳比例。結(jié)果顯示，隨著重組wPDI添加量的增大，吸光度顯著增加，表明胰島 素被還原的量增大。當(dāng)wPDI添加量達(dá)到100 μg/mL時(shí)，吸光度不再增加，表明酶反應(yīng)趨于平衡。因此，在實(shí)驗(yàn)所選條件下，wPDI還原胰島素的質(zhì)量比為1∶1.73。

2.8.2 wPDI的異構(gòu)酶活性

圖9 重組wPDI異構(gòu)酶活性測(cè)定Fig.9 Isomerase assay of recombinant wPDI

在真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，wPDI參與了新生肽鏈的折疊以及二硫鍵的形成。因錯(cuò)誤折疊誤配的二硫鍵能夠通過(guò)wPDI的二硫鍵異構(gòu)酶活性恢復(fù)成天然二硫鍵配對(duì)形式。體外考察wPDI的異構(gòu)酶活性所用底物為sRNase。如圖9所示，相比于未變性的RNase，wPDI能夠使部分sRNase復(fù)性，從而具有催化底物2′,3′-cCMP水解的能力。25 min時(shí)，等量未變性RNase組在296 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化值為0.21，重組wPDI催化sRNase復(fù)性后，吸光度變化值為0.13。因此，wPDI能使sRNase恢復(fù)約60%的活性，表明重組wPDI具有良好的異構(gòu)酶活性。

2.8.3 wPDI的分子伴侶活性

圖10 重組wPDI的分子伴侶活性Fig. 10 Chaperone activity of recombinant wPDI

分子伴侶是細(xì)胞中一大類蛋白質(zhì)，它們氨基酸序列沒(méi)有相關(guān)性但具有相同功能，能夠介導(dǎo)其他蛋白質(zhì)的正確裝配，但自身不會(huì)成為功能結(jié)構(gòu)中的組分[23]。熱休克蛋白是最常見(jiàn)的一大類分子伴侶蛋白。PDI的分子伴侶假說(shuō)最早由王志珍[24]通過(guò)復(fù)性不含二硫鍵的GAPDH和硫氰酸酶提出的，現(xiàn)已被廣泛接受。PDI的伴侶活性指PDI能幫助新生肽鏈正確折疊并抑制因錯(cuò)誤折疊引起的蛋白凝沉作用[2-3]。測(cè)定PDI伴侶活性的常用底物為鹽酸胍變性的GAPDH，稀釋后的變性GAPDH易發(fā)生沉淀，通過(guò)測(cè)定GAPDH的聚集程度來(lái)衡量其伴侶活性的大小[25]。圖10顯示了不同濃度的重組wPDI對(duì)變性GAPDH聚集的抑制率影響。結(jié)果表明，隨著wPDI濃度的增加，對(duì)變性GAPDH聚集的抑制率顯著提高，30 μmol/L的wPDI對(duì)聚集的抑制率最高，達(dá)到35%左右。Cai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，wPDI對(duì)變性GAPDH的聚集抑制率越高，其酶學(xué)活性恢復(fù)的比例越大。因此說(shuō)明，本研究獲得的重組wPDI也具有分子伴侶活性。

3 結(jié) 論

從品種為“中優(yōu)9507”小麥葉片中克隆了蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶wpdi基因，全長(zhǎng)1 548 bp，與“Wyuna”小麥編碼PDI的基因相似性達(dá)99%；多重序列分析發(fā)現(xiàn)，wPDI與植物來(lái)源PDI親緣關(guān)系近，與人或酵母來(lái)源PDI關(guān)系遠(yuǎn)。但不同物種PDI的催化活性位點(diǎn)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)序列仍高度保守；構(gòu)建了pET-30b-wpdi表達(dá)載體，并在最佳表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）得到了大量可溶表達(dá)，最適表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度22 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間6 h，誘導(dǎo)劑濃度0.5 mmol/L。Western-blot結(jié)果證實(shí)了表達(dá)產(chǎn)物帶有重組His標(biāo)簽。經(jīng)鎳離子螯合層析，一步純化得到電泳純重組wPDI；酶學(xué)性質(zhì)表明，重組wPDI具有二硫鍵的還原酶和異構(gòu)酶活性以及分子伴侶活性。該研究結(jié)果為wPDI在面制品加工以及其他方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

[1] WILKINSON B, GILBERT H F. Protein disulfide isomerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1699(1/2): 35-44. DOI:10.1016/ j.bbapap.2004.02.017.

[2] HATAHET F, RUDDOCK L W. Protein disulf de isomerase: a critical evaluation of its function in disulf de bond formation[J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2009, 11(11): 2807-2850. DOI:10.1089/ ars.2009.2466.

[3] WANG L, WANG X, WANG C C. Protein disulfide-isomerase, a folding catalyst and a redox-regulated chaperone[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 83: 305-313. DOI:10.1016/ j.freeradbiomed.2015.02.007.

[4] TIAN G, XIANG S, NOIVA R, et al. The crystal structure of yeast protein disulf de isomerase suggests cooperativity between its active sites[J]. Cell, 2006, 124(1): 61-73. DOI:10.1016/j.cell.2005.10.044.

[5] WANG C, LI W, REN J, et al. Structural insights into the redoxregulated dynamic conformations of human protein disulfide isomerase[J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2013, 19(1): 36-45. DOI:10.1089/ars.2012.4630.

[6] d’ALOISIO E, PAOLACCI A R, DHANAPAL A P, et al. The Protein Disulfide Isomerase gene family in bread wheat (T. aestivum L.)[J]. BMC Plant Biology, 2010, 10: 101. DOI:10.1186/1471-2229-10-101.

[7] XU Z J, UEDA K, MASUDA K, et al. Molecular characterization of a novel protein disulf de isomerase in carrot[J]. Gene, 2002, 284(1/2): 225-231. DOI:10.1016/S0378-1119(01)00889-7.

[8] HUANG D J, CHEN H J, LIN Y H. Isolation and expression of protein disulfide isomerase cDNA from sweet potato (Ipomoea batatas[L.] Lam ‘Tainong 57’) storage roots[J]. Plant Science, 2005, 169(4): 776-784. DOI:10.1016/j.plantsci.2005.05.034.

[9] JOYE I J, LAGRAIN B, DELCOUR J A. Endogenous redox agents and enzymes that affect protein network formation during breadmaking-a review[J]. Journal of Cereal Science, 2009, 50(1): 1-10. DOI:10.1016/j.jcs.2009.04.002.

[10] WATANABE E, BELL A E, BROCKWAY B E. The effect of protein disulphide isomerase on dough rheology assessed by fundamental and empirical testing[J]. Food Chemistry, 1998, 61(4): 481-486. DOI:10.1016/S0308-8146(97)00095-2.

[11] EVERY D, SIMMONS L D, ROSS A P. Distribution of redox enzymes in millstreams and relationships to chemical and baking properties of f our[J]. Cereal Chemistry, 2006, 83(3): 315. DOI:10.1094/cc-83-0062.

[12] 臧聞, 董劍, 高翔, 等. 小麥品種“陜253”PDI基因的克隆、原核表達(dá)及蛋白純化[J]. 麥類作物學(xué)報(bào), 2011, 31(5): 799-804. DOI:10.7606/ j.issn.1009-1041.2011.05.002.

[13] 陳明, 徐幸蓮, 周光宏, 等. 鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 180-184. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309037.

[14] 劉光明, 梁銀龍, 蘇文金, 等. 鯉魚(yú)小清蛋白的純化及其過(guò)敏原性鑒定[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(3): 188-191. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.03.042.

[15] MAITY H, WEI A, CHEN E, et al. Comparison of predicted extinction coefficients of monoclonal antibodies with experimental values as measured by the Edelhoch method[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 77: 260-265. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2015.03.027.

[16] NORGAARD P, WINTHER J R. Mutation of yeast Eug1p CXXS active sites to CXXC results in a dramatic increase in protein disulphide isomerase activity[J]. Biochemical Journal, 2001, 358(1): 269-274. DOI:10.1042/bj3580269.

[17] WALKER K W, LYLES M M, GILBERT H F. Catalysis of oxidative protein folding by mutants of protein disulfide isomerase with a single active-site cysteine[J]. Biochemistry, 1996, 35(6): 1972-1980. DOI:10.1021/bi952157n.

[18] NOIVA R. Protein disulfide isomerase: the multifunctional redox chaperone of the endoplasmic reticulum[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology, 1999, 10(5): 481-493. DOI:10.1006/ scdb.1999.0319.

[19] CAI H, WANG C C, TSOU C L. Chaperone-like activity of protein disulf de isomerase in the refolding of a protein with no disulf de bonds[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(40): 24550-24552.

[20] 唐威華, 張景六, 王宗陽(yáng), 等. SDS-PAGE法測(cè)定His-tag融合蛋白分子量產(chǎn)生偏差的原因[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2000, 26(1): 65-69. DOI:10.3321/j.issn:1671-3877.2000.01.012.

[21] 楊海麟, 王長(zhǎng)城, 張玲, 等. 產(chǎn)膽固醇氧化酶重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(5): 670-674. DOI:10.3321/j.issn:1673-1689.2009.05.018.

[22] 林凡, 秦松. 乳糖誘導(dǎo)重組別藻藍(lán)蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 海洋科學(xué), 2005(11): 22-27. DOI:10.3969/ j.issn.1000-3096.2005.11.006.

[23] FEDER M E, HOFMANN G E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology[J]. Annual Review of Physiology, 1999, 61: 243-282. DOI:10.1146/annurev.physiol.61.1.243.

[24] 王志珍. 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶既是酶又是分子伴侶[J]. 科學(xué)通報(bào), 1998(13): 1345-1353. DOI:10.3321/j.issn:0023-074X.1998.13.002.

[25] SONG J L, QUAN H, WANG C C. Dependence of the anti-chaperone activity of protein disulphide isomerase on its chaperone activity[J]. Biochemical Journal, 1997, 328(3): 841-846. DOI:10.1042/bj3280841.

Gene Cloning, Expression and Characterization of Protein Disulfide Isomerase from Wheat (Triticum aestivum L.)

LIU Guang1,2, HU Songqing1,2, ZHANG Tingting1,2, WANG Jingjing1,2, LI Lin1,2, HOU Yi1,*
(1. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China)

Purpose: The gene encoding wheat protein disulf de isomerase (wPDI) was cloned and expressed in Escherichia coli, and its enzymatic properties were investigated. Methods: The wpdi gene was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction amplif cation using the total RNA from wheat seeds as template. The recombinant plasmid pET-30b-wpdi was constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3). After metal chelating chromatography, the enzymatic properties of the purif ed wPDI were determined. Results: A 1 548 bp gene fragment was amplif ed and sequenced as wpdi gene that had 99% identity with that of the wheat cultivar Wyuna. The optimized conditions for wPDI expression were determined as follows: induction at 22 ℃ using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside at a concentration of 0.5 mmol/L for 6 h. The recombinant wPDI consisted of four thioredoxin-like domains and had a molecular weight of 66.2 kD. The enzyme exhibited enzymatic activities (including reductase activity and isomerase activity of disulf de bonds) and chaperone activity. Conclusions: The expression of wPDI and its enzymatic properties can provide the foundation for its application in the f our processing industry.

wheat protein disulf de isomerase; cloning; expression; enzymatic activities

10.7506/spkx1002-6630-201702002

Q816

A

1002-6630（2017）02-0007-08

劉光, 胡松青, 張婷婷, 等. 小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的克隆、表達(dá)及重組酶性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 7-14. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702002. http://www.spkx.net.cn

LIU Guang, HU Songqing, ZHANG Tingting, et al. Gene cloning, expression and characterization of protein disulfide isomerase from wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Food Science, 2017, 38(2): 7-14. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702002. http://www.spkx.net.cn

2016-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471691；31130042）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20130172110018）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A010107002）；佛山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015AG10011）

劉光（1988—），男，博士研究生，研究方向?yàn)楣任锘瘜W(xué)與蛋白質(zhì)工程。E-mail：liuguang033@126.com

*通信作者：侯軼（1973—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)廢水的生物處理。E-mail：ceyhou@scut.edu.cn