HIF1α和HIF2α調控低氧誘導的MCF-7和HepG2細胞PAI-1表達

崔冠一，彭 戰(zhàn)，李一鳴，沈國民

纖溶酶/纖溶酶原激活物系統在腫瘤細胞的遷移過程中起著至關重要的作用。纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitors,PAIs)，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，抑制纖溶酶原激活物的活性，限制活性纖溶酶的產生[1]。PAI主要有兩種類型，PAI-1和PAI-2。其中PAI-1與腫瘤細胞表型密切相關，參與腫瘤細胞的遷移和血管形成，同時抑制腫瘤細胞的凋亡，是一個腫瘤預后因子。腫瘤細胞快速增殖導致實體瘤內部形成低氧微環(huán)境，低氧引起一系列低氧應答反應，低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)在此過程中起著至關重要的作用[2-3]。HIFα亞基有兩種亞型:HIF1α、HIF2α，都含有bHLH和PAS結構域，有研究報道HIF1α調節(jié)PAI-1的表達[4]，也有研究稱PAI-1是HIF2α的靶基因[5]。因此，本研究用人肝癌細胞系(HepG2)和人乳腺癌細胞系(MCF-7)研究低氧條件下HIF1α和HIF2α對PAI-1表達的影響，揭示PAI-1在肝癌腫和乳腺癌瘤細胞中表達升高的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料藥品與試劑：M-MLV Reverse Trancriptase及Ribonuclease Inhibitor為Promega 公司產品；TransStar SYBR Green qPCR SuperMix購自全式金公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒為威格拉斯公司產品；Human PAI-1 ELISA kit為Bender公司產品。Dharma FECT siRNA 轉染試劑為Thermo Scientific Dharmacon產品。HIF1α(sc-53546)抗體為鼠源單抗，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠IgG、抗兔IgG均購自Santa Cruz。HIF2α(NB100-122)抗體為兔源多抗，購自Novus。β-Actin(60008-1-1g)抗體為鼠源單抗，購自ProteinTech。丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨(AP)、Penicillin、Streptamycin和 SDS 均為Sigma公司產品，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、細胞培養(yǎng)基DMEM、MEM均為Gibco BRL公司產品；胰酶(Trypsin-EDTA)和Trizol為Invitrogen公司產品；胎牛血清(FBS)為PAA產品。蛋白分子量標準為MBI公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)HepG2和MCF-7分別生長于MEM-NEAA、DMEM培養(yǎng)基中，含有10%的胎牛血清(FBS)，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，2.5 mM L-Gln,培養(yǎng)條件均為37 ℃，5%CO2及飽和濕度。低氧培養(yǎng)箱為YCP系列三 氣培養(yǎng)箱(1%O2, 5%CO2, 94%N2)(長沙華曦電子科技有限公司)。HepG2和MCF-7分別在常氧(21%O2)、低氧(1%O2)下培養(yǎng)24 h后，收集細胞，提蛋白用于Western blot；提取總RNA用于實時定量PCR(RT-PCR),收集培養(yǎng)基上清用于ELISA實驗。

1.2.2siRNA轉染轉染前24 h傳代到6孔板，第2天細胞密度約50%～70%。siRNA轉染按廠家說明進行。轉染24 h后給細胞換含有10%FBS的雙抗完全培養(yǎng)基，然后放入低氧箱，再過24 h，收培養(yǎng)基上清、RNA和蛋白，分別用于ELISA、Realtime PCR和Western blot分析。

1.2.3PAI-1含量測定按ELISA試劑盒方法進行。

1.2.4RealtimePCR檢測PAI-1mRNA的表達用Bio-Rad iQ5 PCR儀進行擴增，條件為95 ℃ 3 min預變性; 95 ℃10 s,60 ℃30 s,共40個循環(huán)。HIF1α：上游引物5’-AGGTGGATATGTCTGGGTTG-3’；下游引物5’-AAGGACACATTCTGTTTGTTG-3’。HIF2α：上游引物5’-GTCTCTCCACCCCATGTCTC-3’；下游引物5’-GGTTCTTCATCCGTTTCCAC-3’。PAI-1：上游引物5’-TCTGCCCTCACCAACATTCTG-3’；下游引物5’-TGTCGGTCATTCCCAGGTTCT-3’。β-Actin：上游引物5’-CTGGCACCACACCTTCTACA-3’；下游引物5’-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’。

1.2.5HIF1α和HIF2α表達蛋白免疫印跡收集6孔板細胞，用SDS裂解液(50 mM Tri-Cl pH6.8，2%SDS,10%glycerol)提取總蛋白進行蛋白的SDS-PAGE電泳，每孔上樣量為100 μg全細胞抽提物。之后蛋白轉移到PVDF膜。電轉完畢的PVDF膜在TBST (20 mM Tris 8.0, 100 mM NaCl, 0.1%Tween-20)溶液中洗滌5 min。將PVDF膜放于含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。再將膜放于封閉稀釋的一抗溶液中，4 ℃孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，每次10 min。再將膜放于封閉稀釋的二抗溶液中，室溫孵育1～2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。之后用ECL試劑顯影，在暗室中壓X線片，曝光時間3 s～5 min，然后分別用顯影液和定影液顯影和定影。

2 結果

2.1低氧誘導HepG2和MCF-7細胞中PAI-1的表達Western blot結果顯示，低氧時HepG2和MCF-7中,HIF1α和HIF2α蛋白表達量均明顯升高，而內參β-Actin的表達無明顯變化(圖1A)。實時定量PCR檢測低氧時PAI-1 mRNA升高(圖1B)。ELISA檢測培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平明顯增加(圖1C)。在HepG2細胞中，低氧時PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約59倍(圖1B)，培養(yǎng)基上清中PAI-的含量上升了約114倍(圖1C)。在MCF-7細胞中，低氧時PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約11倍(圖1B)，培養(yǎng)基上清中PAI-1的含量升高了約3倍(圖1C)。

2.2在HepG2中低氧下HIF2α主要調節(jié)PAI-1的表達HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過HepG2細胞以后，低氧時HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了(圖2A, 2B)。用實時定量PCR檢測PAI-1mRNA的表達，在HepG2中敲低 HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF1α對PAI-1 mRNA水平無明顯變化。用ELISA檢測培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達，敲低 HIF2α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF1α對PAI-1表達無明顯變化(圖3C)。

A:Western blot檢測HIF1α和HIF2α在HepG2和MCF-7中低氧和常氧下的表達；B:低氧誘導PAI-1 mRNA升高；C:低氧誘導培養(yǎng)基上清中PAI-1的蛋白水平明顯增加。圖1 低氧誘導HepG2和MCF-7細胞系高表達PAI-1

A:低氧下敲低HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA 的表達；B:HIF1α和HIF2α的siRNA 特異敲低HIF1α和HIF2α的蛋白表達；C:低氧下敲低HIF2α顯著降低PAI-1的蛋白水平。圖2 在HepG2中低氧下HIF2α主要調節(jié)PAI-1的表達

2.3在MCF-7中低氧下HIF1α主要調節(jié)PAI-1的表達HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過MCF-7細胞后，低氧時HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了(圖3A,3B)。用實時定量PCR檢測PAI-1mRNA的表達，發(fā)現敲低 HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF2α對PAI-1 mRNA水平無明顯變化(圖3C)。用ELISA檢測培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達，發(fā)現敲低 HIF1α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF2α對PAI-1表達無明顯變化。

A:低氧下敲低HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA 的表達水平；B:HIF1α和HIF2α的siRNA 特異敲低HIF1α和HIF2α的蛋白表達；C:低氧下敲低HIF1α顯著降低PAI-1的蛋白水平。圖3 在MCF-7中低氧下HIF1α主要調節(jié)PAI-1的表達

3 討論

腫瘤細胞快速增殖導致實體瘤內部形成低氧微環(huán)境，低氧引起一系列低氧應答反應，HIF在此過程中起著至關重要的作用[4-5]。HIF是一種異源二聚體轉錄因子，它由兩個堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)亞基組成：HIFα和HIFβ。HIFα亞基有兩種亞型：HIF1α、HIF2α。HIF1α和HIF2α具有相似的結構，都含有bHLH和PAS結構域，這兩個結構域分別負責與DNA結合以及與HIFβ二聚化，同時HIF1α和HIF2α蛋白都含有氧依賴的降解結構域(ODDD)，因此α亞基在常氧下被迅速降解[6-7]。β亞基是不依賴于氧氣的組成型表達蛋白。低氧、鐵螯合劑以及α-酮戊二酸類似物均能引起HIFα蛋白的穩(wěn)定，從而與HIFβ亞基二聚化，該復合體轉位到細胞核，結合于靶基因的順式反應元件(低氧反應元件，HRE，核心模體序列為5’-(A/G)CGTG-3’)，從而引起靶基因的轉錄。盡管低氧下HIF1α和HIF2α可能共同參與某個特定基因的表達，但二者并不冗余。有報道HIF1α和HIF2α具有不同的反式激活結構域，這表明二者可能有各自獨特的靶基因，而這種特異性可能取決于細胞類型和基因種類[6-10]。

PAI-1是一個分子量約為52 kDa的糖蛋白,最初是定位于內皮細胞的一種蛋白。現已證實體外低氧條件下會引起PAI-1基因的表達上調[2,7]。本研究在HepG2細胞中，低氧時PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約59倍，培養(yǎng)基上清中PAI-的含量上升了約114倍。在MCF-7細胞中，HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過HepG2細胞以后，低氧時HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了。在HepG2中敲低 HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低HIF1α對PAI-1 mRNA水平無明顯變化。敲低 HIF2α顯著降低PAI-1蛋白水平，而敲低 HIF1α對PAI-1蛋白表達無明顯變化。結果表明HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過MCF-7細胞后，低氧時HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了。用實時定量PCR檢測PAI-1mRNA的表達，發(fā)現敲低 HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF2α對PAI-1 mRNA水平無明顯變化。用ELISA檢測培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達，發(fā)現敲低 HIF1α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF2α對PAI-1表達無明顯變化。結果與之前的報道一致[2-4]。本研究發(fā)現低氧下在HepG2細胞系中HIF2α主要調節(jié)PAI-1的表達，而在MCF-7中HIF1α主要調節(jié)PAI-1的表達。PAI-1基因，像其他低氧反應基因一樣，在其啟動子區(qū)含有低氧反應元件，被HIF結合后促進其轉錄。然而PAI-1在不同腫瘤中的表達調控機制可能有差異。有報道HIF1α調節(jié)PAI-1基因的表達[11-12]，也有文獻報道PAI-1是HIF2α的靶基因[3]。本研究說明在肝癌和乳腺癌中，PAI-1的高表達機制是不一樣的。因此在肝癌和乳腺癌的治療中要針對不同的靶標來抑制PAI-1的表達，從而達到抑制腫瘤增殖和轉移的目的。

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