內(nèi)蒙古西部赤霞珠葡萄自然發(fā)酵酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化

王鳳梅++馬利兵

摘要：在無(wú)菌條件下，對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)赤霞珠葡萄汁進(jìn)行自然發(fā)酵，分別在發(fā)酵初、中、后期分離酵母菌株，采用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類，采用基于酵母5.8S rRNA-ITS區(qū)域的RFLP（restriction fragment length polymorphism）分析對(duì)分類酵母菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，統(tǒng)計(jì)不同發(fā)酵時(shí)期發(fā)酵液中酵母菌株的種類及數(shù)量。結(jié)果表明，分離到的327株酵母菌分屬于5個(gè)屬的5個(gè)酵母菌種，分別是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克魯維畢赤氏酵母（Pichia kluyveri）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）及葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；自然發(fā)酵初期，葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤氏酵母的數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢(shì)，分別占分離總菌株數(shù)的64.22%、17.43%；隨著發(fā)酵進(jìn)行，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）菌株的數(shù)量有所減少，釀酒酵母的數(shù)量逐漸增加，至發(fā)酵后期，發(fā)酵液中僅能檢測(cè)到釀酒酵母的存在。這表明內(nèi)蒙古西部地區(qū)野生酵母菌種較為豐富，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂形態(tài)學(xué)分類法結(jié)合酵母5.8S rRNA-ITS區(qū)域的RFLP分析能夠快速分類、鑒定野生酵母菌種，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；酵母；赤霞珠；WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂；動(dòng)態(tài)變化

中圖分類號(hào)： S182；TS262.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0340-04

收稿日期：2015-08-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160245）。

作者簡(jiǎn)介：王鳳梅（1975—），女，河北定縣人，碩士，副教授，主要從事發(fā)酵微生物研究。E-mail：maywfm@126.com。

通信作者：馬利兵，博士，教授，主要從事細(xì)胞工程及基因工程研究。E-mail：mlb-xn2004@163.com。葡萄表面、葡萄園土壤、葡萄酒廠乃至釀酒設(shè)備上存在著大量與葡萄酒發(fā)酵有關(guān)的天然酵母菌種[1]。在這些酵母菌種中，酵母屬（Saccharomyces）在發(fā)酵過(guò)程中起主要作用，發(fā)酵力較強(qiáng)，產(chǎn)酒精多，產(chǎn)生的有益副產(chǎn)物多；而非酵母屬（non-Saccharomyces）在葡萄汁中數(shù)量較多，能啟動(dòng)發(fā)酵，但其發(fā)酵力相對(duì)較弱[2]。在傳統(tǒng)的葡萄及葡萄酒產(chǎn)區(qū)，一些天然酵母菌種在每年生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中逐漸適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍夂蚣巴寥罈l件，并與當(dāng)?shù)仄咸哑贩N形成良好的共生關(guān)系，再經(jīng)自然選擇作用形成適應(yīng)于不同類型葡萄酒的酵母菌系[3]。對(duì)天然酵母種群的研究報(bào)道表明，絕大多數(shù)情況下，葡萄品種、地理位置及氣候條件等會(huì)影響天然酵母的菌群及其數(shù)量[4]。

內(nèi)蒙古西部地區(qū)屬中溫帶半干旱大陸性氣候，干旱少雨，日照充足，晝夜溫差大，有效積溫高，是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)。本研究采用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂形態(tài)學(xué)分類法，結(jié)合酵母 5.8S rRNA-ITS區(qū)域的RFLP（restriction fragment length polymorphism）分析，對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)赤霞珠葡萄中的酵母菌種進(jìn)行分類、鑒定，確定該地區(qū)天然酵母菌群的種類，探究自然發(fā)酵過(guò)程中天然酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，為該地區(qū)葡萄酒發(fā)酵工藝控制及后續(xù)優(yōu)良釀酒酵母篩選提供理論及技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種分離

1.1.1培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium）[5]：酵母浸粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，固體培養(yǎng)基中需添加2%瓊脂、0.01%氯霉素。WL瓊脂培養(yǎng)基（wallerstein laboratory nutrient agar）配方[6]：酵母浸粉0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、硫酸鎂0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸錳0.000 25%、溴鉀酚綠0.002 2%，pH值為5.5。

1.1.2自然發(fā)酵過(guò)程中酵母的分離赤霞珠來(lái)源于內(nèi)蒙古西部阿拉善盟釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)，選取成熟的赤霞珠果粒，無(wú)菌條件下破碎，轉(zhuǎn)入1 L的無(wú)菌玻璃容器內(nèi)，室溫下進(jìn)行自然發(fā)酵；分別在自然發(fā)酵前期（瓶底部有少量氣泡產(chǎn)生，發(fā)酵啟動(dòng)）、中期（大量氣泡上升，發(fā)酵旺盛）及后期（無(wú)明顯氣泡上升，發(fā)酵消退期）取發(fā)酵液，經(jīng)梯度稀釋，涂布于YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d；結(jié)合菌落顏色及形態(tài)挑取菌落，對(duì)挑取的單個(gè)菌落以劃線方式在YPD平板上進(jìn)一步分離、純化。

1.2分離菌種的形態(tài)學(xué)分類

將各時(shí)期分離的酵母菌株劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落的顏色、形態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)不同發(fā)酵時(shí)期不同酵母菌株的數(shù)量。

1.3酵母菌種的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的酵母菌種，參照Esteve-Zarzoso等的方法[7-8]，進(jìn)一步進(jìn)行5.8S rRNA-ITS區(qū)域RFLP分析。采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的酵母基因組提取試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書提取酵母菌的基因組DNA，-20 ℃凍存、備用；采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)不同酵母菌株的 5.8S rRNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10×PCR buffer 5 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，dNTP混合液1 μL，超純水40 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火2 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用由寶生物（大連）有限公司生產(chǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ、HaeⅢ及HhaⅠ于37 ℃條件下酶切16 h，酶切反應(yīng)體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，10×buffer 2 μL，限制性核酸內(nèi)切酶2 μL，超純水6 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，在凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

2結(jié)果與分析

2.1WL培養(yǎng)基上酵母菌株的聚類分析

從赤霞珠自然發(fā)酵的葡萄汁中共分離、純化出327株酵母菌，將所有菌株劃線接種于WL培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察酵母菌株在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)。根據(jù)不同酵母菌種在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的不同菌落顏色及形態(tài)（圖1、表1），將分離純化的327株酵母菌分為5類。

2.2酵母5.8S rRNA-ITS區(qū)域的RFLP分析

分別提取5種類型酵母菌的基因組DNA，以ITS1/ITS4為引物對(duì)其5.8S rRNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Hif、HaeⅢ及HhaⅠ進(jìn)行酶切，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，共有5種不同的酶切類型，見圖2、表2。通過(guò)與Esteve-Zarzoso等研究結(jié)果[7-10]進(jìn)行比對(duì)分析，確定Ⅰ至Ⅴ類型酵母菌種分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.3不同發(fā)酵時(shí)期酵母菌的種群分布

由圖3可見，不同發(fā)酵時(shí)期的發(fā)酵液中，不同酵母菌種的分布存在很大差異；發(fā)酵前期，分離到的菌株為釀酒酵母、東方伊薩酵母、克魯維畢赤氏酵母、淺黃隱球酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母，分別占分離總菌株的2.75%、9.17%、17.43%、6.42%、64.22%，葡萄汁有孢漢遜酵母是這一時(shí)期的優(yōu)勢(shì)酵母菌，其次是克魯維畢赤酵母，釀酒酵母、東方伊薩酵母及淺黃隱球酵母檢出量相對(duì)較少；發(fā)酵中期，發(fā)酵液中葡萄汁有孢漢遜酵母的數(shù)量銳減，其他非釀酒酵母的數(shù)量也有所減少，而釀酒酵母隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位；發(fā)酵后期，發(fā)酵液中僅能檢測(cè)到釀酒酵母的存在。

3結(jié)論與討論

酵母菌普遍存在于葡萄果實(shí)、葉片、根系以及葡萄園土壤顆粒中，葡萄果實(shí)表面是各種酵母菌的天然棲息地，其上分布的酵母菌數(shù)量尤為可觀。葡萄汁在發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌群種類及其數(shù)量處于動(dòng)態(tài)變化中，不同酵母菌群有規(guī)律地此消彼長(zhǎng)，發(fā)酵力強(qiáng)的釀酒酵母比例會(huì)逐漸上升，發(fā)酵力弱的酵母比例會(huì)迅速下降。近些年，有關(guān)葡萄發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化國(guó)內(nèi)外已做了大量研究與報(bào)道，結(jié)果表明，在葡萄漿果表面占主導(dǎo)地位的酵母主要為葡萄汁有孢漢遜酵母屬、假絲酵母屬（Candida）及畢赤酵母屬（Pichia）等，這些非釀酒酵母在發(fā)酵初期占據(jù)優(yōu)勢(shì)；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，非釀酒酵母的數(shù)量會(huì)逐漸減少，直至消失，而耐酒精能力更強(qiáng)的酵母屬酵母會(huì)逐漸增多，直至占據(jù)主導(dǎo)地位；發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中存活的幾乎全部是酵母屬酵母[11-14]。本試驗(yàn)得到同樣一致的結(jié)論，這說(shuō)明不同葡萄產(chǎn)區(qū)的天然酵母雖然存在種屬差異，然而，葡萄汁在發(fā)酵過(guò)程中，天然酵母種群的變化趨勢(shì)是相同的。

本試驗(yàn)中使用的WL培養(yǎng)基是一種非選擇性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基最初由Wallerstein實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，用于檢測(cè)飲料中的微生物菌群。國(guó)內(nèi)外研究表明，使用WL培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)基于菌落的顏色及形態(tài)對(duì)酵母菌進(jìn)行分類，該培養(yǎng)基對(duì)自然發(fā)酵過(guò)程中葡萄汁中分離到的酵母菌種具有良好的鑒別能力[6，13，15]。Pallmann等采用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的酵母菌種進(jìn)行分類，采用26S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)分類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可用于監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)[16]。楊瑩等也采用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)葡萄酒相關(guān)酵母菌種進(jìn)行分類，采用酵母5.8S-ITS區(qū)及26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增與測(cè)序技術(shù)對(duì)分類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂與分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果相一致[13]。因此，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂能對(duì)葡萄酒相關(guān)酵母進(jìn)行分類，此法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單、易行。

親緣關(guān)系相近的菌種，其5.8S rRNA序列很相似，但其兩側(cè)的間隔序列（ITS）由于相對(duì)較快的進(jìn)化速率，而具有長(zhǎng)度和序列上的高度變異性，可以提供豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。因此，采用酵母菌種5.8S rRNA-ITS區(qū)的RFLP分析，可作為鑒別酵母菌種的依據(jù)[6]。Esteve-Zarzoso等首次建立了132種酵母的RFLP分析圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并確定5.8S rRNA-ITS擴(kuò)增片段的RFLP分析在種的水平上鑒定酵母的有效性[6]。此后，該數(shù)據(jù)庫(kù)得到不斷的補(bǔ)充和完善[7-9]，Echeverrigaray等使用該方法鑒定出巴西葡萄酒中的非酵母屬敗壞酵母[17]，U'beda等也采用5.8S rRNA-ITS區(qū)RFLP分析及26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增與測(cè)序技術(shù)研究西班牙La Mancha地區(qū)葡萄酒廠的非酵母屬的多樣性[18]。

早期的研究一般認(rèn)為，葡萄汁有孢漢遜酵母的發(fā)酵力低，能生成較多的醋酸及乙酸乙酯，對(duì)葡萄酒的整個(gè)釀造過(guò)程具有負(fù)面影響[19]。然而，近期研究表明，有孢漢遜酵母屬中的部分菌株能生成大量的酯類、甘油及β-葡萄糖苷酶，對(duì)葡萄酒的化學(xué)成分和最終感觀有著積極影響[20]。Longo等認(rèn)為，隨著發(fā)酵力低的克勒克酵母屬、有孢漢遜酵母屬及其他一些屬酵母如畢赤酵母屬、假絲酵母屬等的發(fā)酵啟動(dòng)，耐酒精能力強(qiáng)的釀酒酵母會(huì)逐步占據(jù)優(yōu)勢(shì)，主導(dǎo)發(fā)酵的完成[21]。本試驗(yàn)在無(wú)菌環(huán)境下對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)采集到的赤霞珠進(jìn)行自然發(fā)酵，通過(guò)分析不同發(fā)酵時(shí)期酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，一方面證明發(fā)酵液中存在大量的野生釀酒酵母，發(fā)酵初期，發(fā)酵液中能分離到少量的克魯維畢赤酵母、釀酒酵母、東方伊薩酵母及淺黃隱球酵母，葡萄汁有孢漢遜酵母在發(fā)酵早期為優(yōu)勢(shì)菌株，另一方面，結(jié)果表明，在發(fā)酵中期，非釀酒酵母的數(shù)量銳減，釀酒酵母的數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，分析其原因在于：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中的酒精濃度逐漸升高，非釀酒酵母由于較低的酒精耐受力而使生長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡，而釀酒酵母的酒精耐受力較強(qiáng)，仍可大量增殖，此消彼長(zhǎng)，最終導(dǎo)致發(fā)酵中期的發(fā)酵液中酵母菌群的數(shù)量發(fā)生根本性改變，且這一過(guò)程持續(xù)進(jìn)行，直至發(fā)酵末期，發(fā)酵液中僅能分離到釀酒酵母。

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