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    飼糧纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔瘦素分泌及其基因表達(dá)的影響

    2017-02-05 15:02:46鄺良德任永軍謝曉紅雷岷
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)母兔卵巢

    鄺良德++任永軍++謝曉紅++雷岷++郭志強(qiáng)++李叢艷++鄭潔++張翔宇++張翠霞++楊超++鄧小東

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.078

    摘要:為研究飼糧不同纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔血清中瘦素含量以及卵巢組織中OB、OB-R基因表達(dá)的影響,選取165日齡的新西蘭青年母兔240只,隨機(jī)分為4個(gè)處理,分別為12%、14%、16%、18%纖維水平添加組,每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12只,每個(gè)處理共60只。結(jié)果顯示,從配種到分娩,各處理組的母兔血清中瘦素含量均呈上升趨勢(shì)。不同處理組相比較,母兔血清中瘦素含量存在顯著差異,其中16%添加組的母兔血清瘦素含量最高。基因表達(dá)研究表明,16%添加組的母兔卵巢中,OB、OB-R基因的表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組。飼糧不同纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔瘦素分泌影響顯著,初產(chǎn)母兔飼糧中纖維的適宜添加水平為16%。

    關(guān)鍵詞:纖維;母兔;OB基因;OB-R基因;卵巢;基因表達(dá)

    中圖分類(lèi)號(hào): S829.15文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0281-03

    收稿日期:2016-04-08

    基金項(xiàng)目:四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(編號(hào):SASA2015A10);四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):2011NZ0099);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):201303143-5);國(guó)家兔產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(編號(hào):CARS-44-B-4);動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目。

    作者簡(jiǎn)介:鄺良德(1983—),男,湖南郴州人,碩士,助理研究員,主要從事家兔遺傳育種及飼養(yǎng)研究。E-mail:happyboy5851258@163.com。

    通信作者:任永軍,碩士,助理研究員,主要從事家兔飼養(yǎng)及疫病防控研究。E-mail:360167513@qq.com。粗纖維泛指植物性來(lái)源纖維成分,包括纖維素、半纖維素、果膠、植物膠、黏多糖、木質(zhì)素等,主要存在于植物的細(xì)胞壁中。國(guó)內(nèi)外研究表明,粗纖維是家兔最重要的營(yíng)養(yǎng)素之一,對(duì)家兔具有特殊的生理作用,在構(gòu)成合理日糧結(jié)構(gòu)、維持家兔正常生理功能、初產(chǎn)母兔繁殖及胚胎成活率等方面起著極為重要的作用。瘦素(leptin)是肥胖基因(obesegene,ob)編碼的產(chǎn)物,是一種分泌性蛋白質(zhì)類(lèi)激素。OB基因是1條含167個(gè)氨基酸密碼的DNA序列,包含有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子。Hindlet等研究發(fā)現(xiàn),缺陷ob/ob(缺乏功能性瘦素)雌鼠不僅表現(xiàn)出肥胖,還出現(xiàn)生殖功能障礙,持續(xù)注射外源性瘦素后可恢復(fù)生殖功能,由此證明瘦素與生殖功能有關(guān)[1-2]。瘦素受體由db基因(diabetes gene)編碼,為高度特異的跨膜蛋白質(zhì),與瘦素具有高度親和力。最初認(rèn)為瘦素只在白色脂肪組織中表達(dá),之后研究發(fā)現(xiàn),瘦素在下丘腦、垂體、肺、胃底部上皮、骨骼肌、卵巢、子宮內(nèi)膜、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、乳腺上皮等均有表達(dá),且在卵巢、子宮內(nèi)膜中與瘦素受體同時(shí)表達(dá)[3-4]。

    瘦素及其受體在下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸的多處表達(dá),表明瘦素對(duì)生殖的調(diào)節(jié)是通過(guò)旁分泌或內(nèi)分泌方式對(duì)HPG軸不同水平進(jìn)行復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié),從而對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖機(jī)能發(fā)揮重要作用[5-7]。適宜的粗纖維水平對(duì)家兔繁殖生產(chǎn)具有重要意義;因此,通過(guò)深入研究不同粗纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔瘦素分泌及其基因表達(dá)的影響,為降低母兔淘汰率、死亡率,綜合提高母兔繁殖性能提供前提條件和基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及母兔飼養(yǎng)管理

    選擇相同日齡(165日齡)的新西蘭青年母兔240只,隨機(jī)分為4個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12只,每個(gè)處理共60只。試驗(yàn)期為母兔165日齡至第1胎分娩,4個(gè)處理分別飼喂12%、14%、16%、18%水平纖維的日糧,所有日糧均按美國(guó)NRC肉兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制。分別于母兔配種當(dāng)天、妊娠21 d、分娩當(dāng)天從每個(gè)重復(fù)中選擇4只母兔,每個(gè)處理共20只,進(jìn)行耳緣靜脈采血,分離血清并于-20 ℃保存待測(cè)。同時(shí),在以上日齡的每個(gè)重復(fù)中選擇1只母兔,每個(gè)處理5只,共計(jì)60只,進(jìn)行屠宰并采集卵巢組織樣品,于-80 ℃保存,用于瘦素及瘦素受體mRNA表達(dá)量的測(cè)定。

    1.2試驗(yàn)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平

    按照美國(guó)NRC肉兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制全價(jià)料,試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。在日糧中添加苜蓿草粉,將日糧粗纖維水平分別調(diào)整為12%、14%、16%、18%,即試驗(yàn)1、2、3、4組。所有試驗(yàn)?zāi)竿镁曫B(yǎng)在同一兔舍內(nèi),自由采食、自動(dòng)飲水。

    1.3主要儀器及試劑

    Biowave DNA型核酸蛋白檢測(cè)儀,Power Pac 3000型電泳儀,島津UV2600型紫外分光光度計(jì),Polytron PT1200E型電動(dòng)勻漿器,Bio-rad iCycler iQ型定量PCR儀,日立CR22g型高速冷凍離心機(jī),Versa Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng),無(wú)菌操作工作臺(tái)。兔瘦素(leptin)ELISA測(cè)定試劑盒為基因美公司產(chǎn)品,Trizol試劑、PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

    1.4試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

    1.4.1血清瘦素水平測(cè)定分別取-20 ℃冰箱中冷凍保存的血清樣品,每個(gè)樣品取0.5 mL進(jìn)行瘦素水平測(cè)定。血清瘦素的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),利用紫外分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)進(jìn)行讀數(shù)。

    1.4.2瘦素及瘦素受體基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定采用Trizol法提取各組織樣品中的總RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和完整性,將質(zhì)量合格的RNA置于 -80 ℃ 冰箱中凍存?zhèn)溆谩⒄誔rimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩8鶕?jù)GenBank公布的家兔瘦素基因(OB)、瘦素受體基因(OB-R)、內(nèi)參基因GAPDH序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增OB、OB-R、GAPDH基因。所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。以GAPDH為內(nèi)參基因,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)OB、OB-R基因在初產(chǎn)母兔卵巢組織中mRNA表達(dá)量的變化規(guī)律。RT-PCR體系(20 μL)為:1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、10 μmol/L的上下游引物各0.6 μL、7.8 μL超純水。采用iCycler型熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)進(jìn)行擴(kuò)增,PCR條件為:95 ℃ 90 s;95 ℃ 15 s,63 ℃ 20 s,42個(gè)循環(huán);72 ℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣。所得到的CT值(cycle threshold)采用2-ΔΔCT方法[8]計(jì)算。目的基因mRNA表達(dá)水平通過(guò)內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校正。

    1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncans檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較和顯著分析。所有數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”,顯著性水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01。

    2結(jié)果與分析

    2.1纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔瘦素分泌的影響

    由表3可知,配種當(dāng)天各處理組母兔血清中的瘦素含量存在差異,其中試驗(yàn)3組瘦素含量最高,顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)1、2組顯著高于試驗(yàn)4組(P<0.05)。在妊娠21 d,試驗(yàn)3組瘦素含量最高,顯著高于試驗(yàn)1、4組(P<0.05),試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著。在分娩當(dāng)天,試驗(yàn)3組瘦素含量顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著,試驗(yàn)1組瘦素含量最低。從配種到分娩,各處理組母兔血清中的瘦素含量均呈上升趨勢(shì)。

    2.2纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔卵巢組織中OB基因表達(dá)的影響

    由表4可知,配種當(dāng)天各處理組母兔卵巢組織中的OB基因表達(dá)量存在顯著差異,其中試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量最高,顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)4組表達(dá)量最低,試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組之間差異不顯著。在妊娠21 d,試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量最高,表達(dá)量依次為試驗(yàn)3組>試驗(yàn)1組>試驗(yàn)2組>試驗(yàn)4組。在分娩當(dāng)天,試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著。從配種到分娩,各處理組母兔卵巢組織中的OB基因表達(dá)量均呈顯著上升趨勢(shì)。

    2.3纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔卵巢組織中OB-R基因表達(dá)的影響

    由表5可知,飼料中纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔卵巢組織中的OB-R基因表達(dá)有顯著影響。在配種當(dāng)天, 各處理組母兔卵巢組織中的OB-R基因表達(dá)量存在差異,其中試驗(yàn)3組 OB-R基因表達(dá)量最高,顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)。在妊娠21 d,試驗(yàn)3組OB-R基因表達(dá)量最高,顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)4組表達(dá)量最低。在分娩當(dāng)天,試驗(yàn)3組OB-R基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05),表達(dá)量依次為試驗(yàn)3組>試驗(yàn)2組>試驗(yàn)4組>試驗(yàn)1組。從配種到分娩,試驗(yàn)2、3、4組母兔卵巢組織中的OB-R 基因表達(dá)量均呈顯著上升趨勢(shì),試驗(yàn)1組則表現(xiàn)為先升高、后基本維持不變。

    3結(jié)論與討論

    作為分泌性蛋白質(zhì)類(lèi)激素,瘦素通過(guò)與其受體發(fā)生特異性結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。瘦素水平呈生理性波動(dòng),卵泡早期瘦素水平較低,于排卵期達(dá)到高峰。瘦素可激活磷酸二酯酶水解第二信使cAMP,刺激胚泡的分裂,從而導(dǎo)致卵細(xì)胞的成熟[9-10]。已有研究表明,瘦素可促進(jìn)卵泡刺激素(FSH)、促黃體激素(LH)、雌二醇(E2)的產(chǎn)生,影響卵巢的生殖能力,體內(nèi)瘦素水平過(guò)低將導(dǎo)致女性不孕。Barashi等每天給小鼠注射瘦素,發(fā)現(xiàn)小鼠的LH、FSH水平明顯升高,表明瘦素可在一定程度上提高動(dòng)物卵巢的生殖功能;小鼠在瘦素水平極低的情況下出現(xiàn)不孕癥現(xiàn)象,而注射瘦素后生育功能得到改善[11-12]。為禁食蛋雞注射外源瘦素,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在禁食期間注射瘦素可抑制卵泡的衰亡,蛋雞產(chǎn)蛋行為的停止被延遲,由此可見(jiàn)瘦素具有抑制卵巢功能退化、提高雞繁殖性能的作用[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,從配種到分娩,各處理組母兔血清中的瘦素含量均呈上升趨勢(shì),這與母兔卵巢組織中OB、OB-R基因表達(dá)量基本符合。不同纖維水平添加組之間相比較,母兔血清中的瘦素含量存在顯著差異。在各試驗(yàn)階段,試驗(yàn)3組母兔血清中的瘦素含量均最高。在基因表達(dá)方面,試驗(yàn)3組母兔卵巢中的OB、OB-R基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組。飼糧不同纖維水平對(duì)初產(chǎn)母兔瘦素分泌影響顯著,初產(chǎn)母兔飼糧中纖維的適宜添加水平為16%。

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