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    基于SRAP分子標記的黃顙魚屬遺傳多樣性分析

    2017-02-05 20:17:36龔瑞玥方春林萬正義舒漢鼎
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:遺傳多樣性

    龔瑞玥++方春林++萬正義++舒漢鼎++胡成鈺++毛慧玲

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.021

    摘要:選用64對SRAP引物對黃顙魚屬進行遺傳多樣性研究。結(jié)果顯示,有46對引物能成功擴增,其中19對條帶清晰、顯示較高多態(tài)性。檢測其PCR產(chǎn)物共獲得179條,每對引物擴增條帶5~15條不等,擴增片段介于90~510 bp 之間,物種間遺傳相似系數(shù)范圍為0.500~1.000,黃顙魚屬各物種間具有較大的遺傳差異性。SRAP聚類結(jié)果顯示,瓦氏黃顙魚與其他物種差異最大,普通黃顙魚、長須黃顙魚和中間黃顙魚親緣關(guān)系較近。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示,5種黃顙魚遺傳多樣性處于較高水平,有助于后續(xù)深入對黃顙魚屬各物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化進行分析。

    關(guān)鍵詞:黃顙魚屬;SRAP;遺傳多樣性;遺傳相似系數(shù)

    中圖分類號: S961.2文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0092-03

    收稿日期:2015-08-15

    基金項目:江西省科技支撐資助項目(編號:20112BBF60011);江西省教育廳科技資助項目 (編號:GJJ14152)。

    作者簡介:龔瑞玥(1990—),女,江西南昌人,碩士研究生,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。 E-mail:enidpace713@gmail.com。

    通信作者:毛慧玲,碩士,教授,主要從事魚類遺傳與育種研究。E-mail:huilinm6@163.com。黃顙魚俗稱黃丫頭,是備受我國老百姓喜愛的主要經(jīng)濟魚類之一。據(jù)中國動物志中報道,黃顙魚屬共有普通黃顙魚(P.eupogon)、長須黃顙魚(P.fulvidraco)、瓦氏黃顙魚(P.vachelli)、光澤黃顙魚(P.nitidus)和中間黃顙魚(P.intermedius)等5種,中間黃顙魚僅分布于珠江水系及海南島,其他4種均廣泛分布于長江水系[1-2]。隨著市場對黃顙魚需求的增大,其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大,隨之出現(xiàn)魚種混雜,品種退化現(xiàn)象,主要表現(xiàn)在生長速度變慢、抗病力及抗逆力降低等方面。從良種選育、養(yǎng)殖和種質(zhì)資源保護角度考慮,亟須提供一種有效的方法來鑒別這些物種,并研究其遺傳多樣性。

    序列相關(guān)擴增多態(tài)性(SRAP,sequence-related amplified polymorphism)分子標記是由美國加州大學(xué)蔬菜系Li等于2001年提出[3],該標記具有簡單、高效、高共顯、高重復(fù)、易測序等優(yōu)點[4-5],廣泛運用于物種遺傳多樣性、品種鑒定和親緣關(guān)系的研究當中。本研究從分子水平角度,應(yīng)用SRAP分子標記技術(shù)來鑒別黃顙魚屬5個種,并探討它們的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系,為黃顙魚屬種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用提供理論資料[6-7],對黃顙魚漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

    1材料與方法

    1.1樣品采集

    2011年6月至2012年9月,從江西鄱陽湖和廣東西江野外采得魚類(表1),并應(yīng)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法將它們逐一進行分類。

    1.2基因組DNA

    每個物種隨機選取4尾,共20尾樣品。取背部肌肉,采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA[8]。

    1.3SRAP引物來源

    由表2可知,SRAP引物序列,將上游引物與下游引物交叉組合得到64對SRAP引物,按照簡寫上下游序號原則進行命名,如上游2號引物me與下游3號引物em組合而成的SRAP引物命為m2e3。

    1.4PCR擴增和電泳檢測

    20 μL SRAP的PCR擴增體系含:100 ng/μL模板DNA 1.0 μL,50 μmol/L上下游引物各0.06 μL,10×PCR buffer (Mg2+) 2.0 μL,200 μmol/L dNTPs 1.6 μL,5.0 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL,ddH2O 15.08 μL;PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,5個循環(huán);94 ℃變性1 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物多態(tài)性。

    1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    對著SRAP的PCR擴增圖譜,自下而上按遷移率不同排列計數(shù),無帶則賦值為“0”,有帶則賦值為“1”,建立不同SRAP引物“0-1”矩陣表。應(yīng)用軟件包括POPGENE32、POWERMARKER V3.25等不同軟件處理、分析“0-1”矩陣表數(shù)據(jù),獲得等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、等位基因有效率(A)、多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳多樣性指標。分別應(yīng)用NTSYS-pc2.0軟件、UPGMA程序計算遺傳相似系數(shù)[9]、聚類分析[10]。

    2結(jié)果與分析

    2.1SRAP擴增結(jié)果

    由64對SRAP引物擴增結(jié)果獲悉,46對引物能成功擴增,占引物總數(shù)的71.9%。檢測引物擴增的PCR產(chǎn)物,共獲得179條,每對引物擴增條帶5~15條不等,擴增片段介于 90~510 bp之間。由此可確定46對引物是黃顙魚屬SRAP標記的有效引物。

    選取其中條帶清晰、多態(tài)性較高的19對引物(表3)用于分析。DNA圖譜(圖1)清楚地顯示了引物m2e1、m6e5在20尾黃顙魚樣品特異性擴增產(chǎn)物所具有的多態(tài)性,相同引物下擴增出的同種不同個體均能顯示明顯的相同特征性條帶,體現(xiàn)出種內(nèi)差異較?。欢瑢俨煌N間條帶差異明顯,多態(tài)性高,清晰地體現(xiàn)出黃顙魚屬5個種之間的差異。

    2.2遺傳多樣性指標分析

    19對SRAP引物對黃顙魚屬5個物種20尾樣品進行擴增,檢測到118個等位基因,每個位點可擴增出的等位基因數(shù)為4~8個不等,平均數(shù)為6.2個,大小在90~510 bp之間,計算出有效等位基因數(shù)。由表4可知,有效等位基因數(shù)等位基因有效率、多態(tài)信息含量等平均數(shù)值分別為5.348 6、0.834 2、0.766 7。由表5可見,除中間黃顙魚外的4個物種Shannon信息指數(shù)均較高,特別是長須黃顙魚高達0.683 9。上述數(shù)據(jù)都是反映遺傳多樣性的指標,其數(shù)值越大,說明基因豐富度越高。

    2.3黃顙魚屬各種聚類分析

    由圖2可知,根據(jù)PCR產(chǎn)物的多態(tài)性和聚類分析結(jié)果,5種黃顙魚間遺傳相似系數(shù)范圍為0.500~1.000,這說明黃顙魚屬各物種間具有較大的遺傳差異性。其中,不同物種間遺傳相似系數(shù)低,同一物種間遺傳相似系數(shù)高,說明親緣關(guān)系近。根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù)對黃顙魚屬進行聚類分析,在遺傳相似系數(shù)為0.50水平時,可將瓦氏黃顙魚與其他物種區(qū)分開;在遺傳相似系數(shù)為0.56水平時,可明確地將光澤黃顙魚與其他3個物種區(qū)分開來;在遺傳相似系數(shù)為 0.64 的水平下,可將普通黃顙魚與長須黃顙魚、中間黃顙魚分開;隨后在0.72水平時,長須黃顙魚和光澤黃顙魚分為2類。綜合來說,供試的黃顙魚屬5個物種相似系數(shù)不高,遺傳距離相對較遠,分屬于不同種。19對SRAP引物所構(gòu)成的各物種的特異性譜系,能夠為黃顙魚屬各物種提供更準確的分子水平上的鑒定。

    3討論

    SRAP作為一種新型的分子標記技術(shù),不需要像RAPD、SSR標記那樣花費大量人力和時間進行引物設(shè)計開發(fā),重復(fù)試驗結(jié)果穩(wěn)定,PCR擴增所需求的DNA質(zhì)量要求低,最為重要的一點是SRAP標記穩(wěn)定且多態(tài)性可與AFLP標記相媲美[11-12]。本試驗利用了19對SRAP引物對黃顙魚屬進行遺傳多樣性研究,結(jié)果顯示5種黃顙魚遺傳多樣性處于較高水平。相對于其他幾個物種而言,中間黃顙魚的多樣性指數(shù)偏低,原因可能是廣州西江采樣點為經(jīng)濟高度發(fā)達區(qū)域,環(huán)境污染、過度捕撈等人為干擾比較嚴重,而其余4個物種都采于生態(tài)環(huán)境較好的鄱陽湖,物種受到破壞程度相對較小[13]。

    對196個擴增條帶構(gòu)建的各物種特異性譜系,雖然能夠用于對黃顙魚屬幼苗和幼魚的鑒別,但是由于SRAP引物擴增出的條帶較多,需通過多對引物擴增檢測才能對黃顙魚屬進行區(qū)分,這將浪費大量人力、物力,如果將SRAP轉(zhuǎn)化為SCAR標記能夠克服這一缺點[14-17]。丁煒東等通過SRAP方法對3種草魚基因組進行分析,設(shè)計了3對SCAR引物,其中SCAR1能夠區(qū)分人工養(yǎng)殖和野生草魚種群[18]。由此可見,將SRAP標記轉(zhuǎn)化為SCAR標記后,其特異性和穩(wěn)定性均大幅度提高,可以更方便快捷地應(yīng)用于相似物種的鑒定。

    鲿科魚類的分類系統(tǒng)一直比較混亂,在屬的劃分上還存在許多爭議,黃顙魚屬亦如此。肖調(diào)義等對洞庭湖4種黃顙魚的生態(tài)學(xué)特征和遺傳多樣性的RAPD分析結(jié)果表明,長須黃顙魚與瓦氏黃顙魚具有較近的親緣關(guān)系,而光澤黃顙魚與普通黃顙魚關(guān)系較近[19],與本研究結(jié)果相反。SRAP聚類結(jié)

    果表明普通黃顙魚和長須黃顙魚關(guān)系相近,光澤黃顙魚與瓦氏黃顙魚關(guān)系相近,這與丁言偉對黃顙魚屬分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果[20]相近;與趙哲霞等的SSR分析結(jié)果[9]略有不同,主要原因可能在于普通黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間的位置調(diào)換了,各物種種內(nèi)遺傳差異與SSR分析相比較小。其可能的原因在于SSR引物設(shè)計是根據(jù)普通黃顙魚相關(guān)序列設(shè)計的,擴增出來的多態(tài)性條帶相對于其他物種較多;而SRAP分子標記是通過獨特的引物設(shè)計對ORFs進行擴增。

    基因組DNA不同區(qū)域進化速率相差很大,而分子標記是根據(jù)特定序列設(shè)計引物進行擴增檢測來解決所研究物種的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生,結(jié)果肯定存在差別。至于選取那種方法得出的結(jié)論最準確、具有更高的可信性都還沒有定論,需要之后進一步研究比較。

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