靶向性重組PF4裸質(zhì)?？寡苌苫钚缘难芯?/h1>

2017-02-03 03:28:51王聽月王喆黃鶴

化學(xué)工業(yè)與工程訂閱 2017年3期 收藏

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)液內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)粒

王聽月，王喆，黃鶴*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072）

隨著腫瘤發(fā)病率和致死率的日益增高，惡性腫瘤已成為目前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。自從1971年 Folkman[1]提出腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成的觀點(diǎn)后，通過抑制腫瘤血管的生成來抑制腫瘤生長(zhǎng)的理論已被大量研究所證實(shí)[2]。目前廣泛認(rèn)為，新生血管的形成對(duì)于實(shí)體瘤的生長(zhǎng)是一個(gè)關(guān)鍵的步驟。因此以腫瘤血管新生為靶點(diǎn)的治療方法逐漸受到重視，并且發(fā)展成為目前腫瘤治療的研究重點(diǎn)。而尋找具有低毒性、高活性、良好的穩(wěn)定性和高度靶向性的血管生成抑制劑是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，許多內(nèi)源性或外源性抗血管生成因子如血管生成抑制素（angiostatin）、內(nèi)皮抑制素（endostatin）、interleukin-12（IL-12）、血小板因子四（platelet factor-4，PF4）等均具有一定的抗血管生成作用[3-4]。重組人血管內(nèi)皮抑制素于2005年獲得國(guó)內(nèi)新藥證書，作為全球首例，也是目前唯一的內(nèi)源性血管抑制劑抗腫瘤藥物，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。目前，包括PF4、血管生成抑制素、IL-12等在內(nèi)的血管生成抑制因子已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

血小板因子四作為腫瘤血管生成抑制因子中的一員，日益發(fā)揮出了重要的作用，成為最受關(guān)注的抑制血管新生因子之一。血小板因子四是一種具有多種生物學(xué)功能的趨化因子，它能夠通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移抑制血管生成，研究表明，PF4抑制血管新生作用主要集中在其C末端與肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其47-70肽段抑制活性較強(qiáng)[5-6]。早在1999年，Jouan等[7]觀察到PF447-70可以直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；Perollet等[8-9]發(fā)現(xiàn)PF447-70可以通過抑制促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子發(fā)揮作用間接地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)；在FGF-2或VEGF結(jié)合試驗(yàn)、三維血管小管形成增殖試驗(yàn)等一系列試驗(yàn)中，PF447-70都顯示出了抗血管生成活性[10]。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，能夠與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素αvβ3結(jié)合[11]，因此可作為腫瘤靶向肽進(jìn)行腫瘤的診斷與治療，且含有2個(gè)二硫鍵的環(huán)形RGD肽對(duì)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制效力最強(qiáng)[12-14]。

本研究將PF447-70與環(huán)形RGD肽通過柔性肽連接構(gòu)成靶向性重組PF4，表達(dá)的PF447-70蛋白含有RGD結(jié)構(gòu)。利用RGD肽能與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素結(jié)合的特性，提高PF447-70蛋白與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力與靶向性，使其在抑制血管生成的同時(shí)，增強(qiáng)靶向性，降低副作用，從而更有針對(duì)性的抗癌。考慮到PF4蛋白的分離純化困難，加之其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，活性形式為四聚體，直接化學(xué)合成不但成本高，還難以保證其活性。且直接給予蛋白藥物，在體內(nèi)不穩(wěn)定，易被代謝，很難維持較高治療濃度。而基因治療則具有可以在腫瘤局部維持血管新生抑制因子較高水平表達(dá)、避免腫瘤細(xì)胞的耐藥性、降低藥物毒副作用等優(yōu)勢(shì)[15]。本研究以能表達(dá)該重組肽的裸質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD為研究對(duì)象，探討了其在體外的抑制血管生成活性，為抗血管新生基因療法治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，DMSO購自美國(guó)Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA消化液、G-418 Sulfate、RIPA裂解液和 MTT均購自北京索萊寶科技有限公司，脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自Biom iga公司，RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，Hind III和Xba I限制性內(nèi)切酶和 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自 Thermo公司，抗 β-actin鼠單克隆抗體、抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠lgG購自Abcam公司。所用引物自行設(shè)計(jì)，由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

1.1.2 儀器設(shè)備

日本Sanyo細(xì)胞培養(yǎng)箱，Viber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)IR公司 CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本 Nikon公司倒置熒光顯微鏡；SIGMA公司3K-18低溫高速離心機(jī)，Microplate酶標(biāo)儀，Perkin Elmer Cetus PCR儀，北京六一儀器廠核酸、蛋白電泳儀。

1.1.3 質(zhì)粒、細(xì)胞株和試驗(yàn)動(dòng)物

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存；中華倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮（HUVEC）細(xì)胞系均購于天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶向性重組PF4的設(shè)計(jì)、拼接和優(yōu)化

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為 NM_002619.3的PF4基因序列，選取 PF4信號(hào)肽基因及 PF447-70基因；連入環(huán)狀 RGD肽（PDB：1FUV_A）基因（33bp）序列，為了保持PF447-70和RGD肽各自的空間結(jié)構(gòu)，在二者之間加入了柔性連接肽（GenBank：CAJ56254.1），根據(jù)其氨基酸序列初步設(shè)計(jì)其基因（42bp）序列。在PF447-70-RGD基因前后加入表達(dá)必需的元件拼接后，利用軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的PF447-70-RGD基因序列為（含有Hind III和Xba I酶切位點(diǎn)及 His標(biāo)簽）：AAGCTT GCCACC ATG GGC AGC TCC GCA GCC GGG TTC TGC GCC TCA CGC CCC GGG CTG CTG TTC CTG GGG TTG CTG CTC CTG CCA CTT GTG GTC GCC TTC GCC AGC GCT AAT GGA AGG AAA ATT TGC TTG GAC CTG CAA GCC CCC CTG TAC AAG AAA ATA ATT AAG AAA CTT TTG GAG AGT GGA GGC GGA GGA AGC GGA GGA GGA GGA AGC GGC GGA GGA GGC AGC GCC TGC GAC TGC AGG GGA GAC TGC TTC TGC GGT CAT CAT CAC CAT CAC CAT TGA G TCTAGA；氨基酸序列為：MGSSAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLVVAFASA NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLE S GGGGSGGGGSGGGGS ACDCRGDCFCG HHHHHH，其中_下劃線標(biāo)示的序列為信號(hào)肽， 下劃線標(biāo)示的序列為PF447-70，下劃線標(biāo)示的序列為柔性連接肽，下劃線標(biāo)示的序列為RGD肽，下劃線標(biāo)示的序列His標(biāo)簽蛋白。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

合成靶向性重組PF4基因序列（由金唯智公司合成）。用Hind III和Xba I分別對(duì)靶向性重組PF4基因片段和真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）進(jìn)行雙酶切。用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，并對(duì)酶切后的目的基因片段（286 bp）及酶切后的 pcDNA3.1（+）（5428 bp）載體進(jìn)行切膠回收。各自回收純化后，用 T4連接酶對(duì)目的片段和酶切后的pcDNA3.1（+）載體進(jìn)行連接，構(gòu)建出真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD。以其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)DH5α，通氨芐青霉素 LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆。在含100μg/m L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒。進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。鑒定正確的重組載體即為重組 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD真核表達(dá)載體。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

CHO細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清 +青霉素 100 IU/m L、鏈霉素 100μg/m L，DMEM（High Glucose）培養(yǎng)液中，置于 5%CO2、37 ℃、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，用胰蛋白酶進(jìn)行消化以收獲對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以（0.5～2.0）×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜至細(xì)胞達(dá)到70% ～80%匯合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別取適量 DNA，Lipofectam ineTM2000用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋至25μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將稀釋的DNA和稀釋的Lipofectam ineTM2000混合，輕輕混勻，并在室溫下孵育20 min。將24孔板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成450μL無血清無雙抗培養(yǎng)基，然后將50μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24細(xì)胞孔板內(nèi)，輕輕搖勻。將細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h后，更換成500μL含雙抗和10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后檢測(cè)。

1.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

選擇培養(yǎng)基中G418濃度在400～1200μg/m L范圍內(nèi)，以100μg/m L為梯度；分別進(jìn)行篩選，每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基。在篩選10～14 d內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度1000μg/m L即為最適宜篩選濃度。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞傳代，第2 d加入最適宜篩選濃度的G418篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選10～14 d后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)。停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，該細(xì)胞系為 CHO穩(wěn)定表達(dá)系。未轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD質(zhì)粒的細(xì)胞，篩選4 d，細(xì)胞全部死亡。

1.2.5 M TT法檢測(cè)對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的影響

收集對(duì)數(shù)期HUVEC細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/m L的密度接種于96孔板，180μL/孔，分成3組，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，第1組加入未轉(zhuǎn)染組 CHO細(xì)胞培養(yǎng)液，第2組加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）組 CHO細(xì)胞培養(yǎng)液，第3組加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組 CHO細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔各加入200μL。培養(yǎng)72 h后，吸去96板中上清，加入90μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后洗掉上清，每孔加入110μL Formazan溶解液，振蕩混勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在540 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度 A540值。細(xì)胞增殖抑制率（inhibition ratio，IR），IR=（1-實(shí)驗(yàn)組平均 A540/對(duì)照組平均A540）×100%；計(jì)算出含有重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD的CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)上清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)

提取CHO細(xì)胞系的總 RNA，用 Nanodrop測(cè)定總RNA的濃度，總RNA經(jīng)M-MLVⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 以 P1（5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’）P2（5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’） 為引 物 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增內(nèi)參肌動(dòng)蛋白（β-actin）特異性片段，以P3（5’-GGCTGCTGTTCCTGGGGTTGCTG-3’） P4（5’-CAGAAGCAGTCTCCCCTGCAGTCGC-3’）為引物進(jìn)行PCR獲得目的基因特異性片段。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s，55 ℃/65 ℃ 30 s，72 ℃25 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，切膠，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，測(cè)序鑒定。測(cè)序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.7 W estern Blot檢測(cè)

收集CHO細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行分泌蛋白檢測(cè)。用RIPA裂解液裂解CHO細(xì)胞提取胞內(nèi)總蛋白檢測(cè)。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。15%SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)到PVDF膜。轉(zhuǎn)完膜后用TBST清洗1次，5%的脫脂奶粉中封閉90 m in，棄掉5%封閉緩沖液，分別于一抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體（1∶500）、β-actin鼠單克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜。 從抗體中取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次搖床搖動(dòng)10 m in；將其放入二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶000）中室溫孵育1 h，再用TBST液清洗3次，每次10 m in。滴加ECL發(fā)光液顯影，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描曝光。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與鑒定

利用Hind III和Xba I進(jìn)行重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD的雙酶切鑒定，其產(chǎn)物經(jīng)過1.5%凝膠電泳檢測(cè)，可見到約5.4 kb的大片段和約260 bp的小片段（圖1）。大片段與 pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體片段大小一致，小片段與PF447-70-RGD基因片段大小一致。而經(jīng) Hind III、Xba I雙酶切過的質(zhì)粒 pcDNA3.1（+），無小片段，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序鑒定證明序列正確（圖2），證明重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功。

圖1 pcDNA3.1（ +）-PF447-70-RGD質(zhì)粒 Hind ⅠⅠⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定Fig.1 Recom binant p lasm id pcDNA 3.1（ +）-PF447-70-RGD identified with H ind ⅠⅠⅠand Xba Ⅰdigestion

2.2 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞RT-PCR鑒定

利用根據(jù) pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD兩端cDNA設(shè)計(jì)的引物 P1、P2、P3、P4 進(jìn)行 RT-PCR，擴(kuò)增出內(nèi)參β-actin特異性條帶，經(jīng)過2.0%凝膠電泳檢測(cè)，可見到約260 bp的片段，與預(yù)期條帶位置相符，說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈成功；擴(kuò)增目的基因特異性條帶經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）組未見條帶，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD的CHO細(xì)胞組可見約200 bp的基因片段，與預(yù)期相符，說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組基因水平上可檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)（圖3）。

2.3 W estern Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)在CHO細(xì)胞的表達(dá)

圖2 pcDNA 3.1（+）-PF447-70-RGD質(zhì)粒測(cè)序峰圖Fig.2 pcDNA3.1（ +）-PF447-70-RGD p lasm id sequencing d iagram

圖3 RT-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 RT-PCR am p lified electrophoresis

收取 CHO細(xì)胞裂解液獲得胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)Western blot法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組胞內(nèi)蛋白，均表達(dá)了43 KD的內(nèi)參 β-actin，且亮度基本相同，說明3組的胞內(nèi)蛋白樣品質(zhì)量良好且濃度相仿；而只有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組在8.8 KD附近處有帶有His標(biāo)簽的目的條帶，而未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）組則無條帶（見圖 4）。 說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組在蛋白水平上可檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)。收集CHO細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行分泌蛋白檢測(cè)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組分泌蛋白可見帶有His標(biāo)簽?zāi)康?.7 KD左右的條帶，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）組未見條帶（見圖5），說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組在蛋白水平上可檢測(cè)到目的蛋白分泌表達(dá)。

2.4 靶向性重組PF4細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用

MTT法檢測(cè)含有重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)上清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響（見圖6）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）組與未轉(zhuǎn)染組相比無明顯區(qū)別（P=0.260＞0.05）。而經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD組CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)后，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）組對(duì)比，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力顯著減?。≒=0＜0.05），與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（+）組相比降低了50.8%。表明分泌表達(dá)的PF447-70-RGD重組蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。

圖4 胞內(nèi)蛋白W estern b lot結(jié)果圖Fig.4 W estern blot analysis for in tracellular proteins

圖5 分泌蛋白W estern b lot結(jié)果圖Fig.5 W estern blot analysis for secreted proteins

圖6 含有靶向性重組PF4細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖能力的抑制作用Fig.6 The inhibition of cell culturem edium con taining Targeting Recom binant PF4 on HUVEC p roliferation

3 討論

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，是影響臨床腫瘤治療的主要問題。研究表明，通過抑制血管新生能控制實(shí)體瘤及血液腫瘤的生長(zhǎng)，所以抑制血管新生治療的方法已成為當(dāng)前治療腫瘤的熱點(diǎn)[16]。PF4屬于CXC趨化因子亞家族，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，PF4作為一種抑制血管新生因子，通過干擾血管生成因子、激活CXCR3B、與整合素相互作用、干擾細(xì)胞周期、與VEGF家族的其他成員VEGF121相互作用等多種分子作用機(jī)制誘發(fā)了其在內(nèi)皮細(xì)胞中的活性，得到了廣泛關(guān)注。

為了深入研究PF4，本研究頗具創(chuàng)新性的構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)該重組肽的裸質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至 CHO細(xì)胞，采用 RT-PCR和 Western blot分別從基因和蛋白水平上檢測(cè)目的基因的表達(dá)。篩選得到CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，經(jīng)過Western blot驗(yàn)證，細(xì)胞表達(dá)了目的蛋白且部分分泌到了胞外。MTT法測(cè)定胞外分泌蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)。因此，本研究證明靶向性重組PF447-70-RGD肽段具有較強(qiáng)的體外抑制血管生成活性。位于PF4的C末端的PF447-70肽段具有較強(qiáng)的抗血管生成活性，其可能的機(jī)理在于：由于肽鍵剪切后影響了蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)而引起形成的新氨基末端富含堿性氨基酸；空間結(jié)構(gòu)的變化可能使其暴露更多的活性中心或尚不為人所知的功能區(qū)域；可能去除了PF4的某些活性抑制區(qū)域。此外，結(jié)合了RGD肽段的PF447-70-RGD肽段，在腫瘤的治療過程中，具有比PF447-70肽段更高的活性，更精準(zhǔn)的靶向性。因?yàn)镽GD肽靶向性的藥物能更有效地選擇性殺傷腫瘤部位的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制腫瘤的效果更好[17-18]。而此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PF447-70肽段和RGD肽分別形成了有活性的空間結(jié)構(gòu)，而通過中間的柔性肽連接，沒有互相干擾，各自發(fā)揮作用或者起到協(xié)同作用而使其抗血管生成活性更強(qiáng)大。此外，我們的研究已經(jīng)涉及少量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步研究結(jié)果顯示靶向性重組PF4表達(dá)載體在體內(nèi)也展現(xiàn)出一定的抑瘤效果，對(duì)我們的進(jìn)一步的研究起到促進(jìn)意義。

本研究利用裸質(zhì)粒的治療腫瘤的方案，為腫瘤抑制血管新生的基因治療開辟光明前景；而加入環(huán)狀RGD肽的靶向性的設(shè)計(jì)對(duì)靶向抗腫瘤治療的研究具有重大意義。綜上所述，本次研究的對(duì)象pcDNA3.1（+）-PF447-70-RGD具有很好的臨床應(yīng)用前景。然而，對(duì)于PF447-70-RGD的抑制腫瘤生長(zhǎng)活性具體作用機(jī)理及同其他抗血管生成因子抑癌作用的比較，有待進(jìn)一步的研究。

同時(shí)，基因治療的應(yīng)用面臨的一些問題，其中重要問題之一是如何提高基因藥物的傳遞效率。研究表明通過一些物理、化學(xué)，生物學(xué)等方法，可以提高傳遞效率。因此為靶向性PF4基因片段能夠高效的轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞組織，尋求合理的物理化學(xué)等的方法或者有效安全的運(yùn)載系統(tǒng)是十分必要的。此外，用于基因治療的生物制品的生產(chǎn)與質(zhì)量控制都有相當(dāng)嚴(yán)格的要求。因此其產(chǎn)品的有效性和安全性需要有所保障，這些問題有待克服。

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