D-異抗壞血酸油酸酯的制備及其結(jié)構(gòu)表征*

劉國(guó)琴 王靈利 劉新旗

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640；2.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心∥食品學(xué)院，北京 100048)

維生素C又稱L-抗壞血酸，是一種常見(jiàn)的天然抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[1]和生理活性，但其多羥基的親水結(jié)構(gòu)限制了它在油基食品中的使用[2].為了增強(qiáng)其脂溶性，使其更好地應(yīng)用在脂類食品中，在L-抗壞血酸結(jié)構(gòu)上引入脂肪酸對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到的L-抗壞血酸脂肪酸酯具有良好的脂溶性[3].目前關(guān)于L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究較為廣泛，已經(jīng)合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯[4]、L-抗壞血酸月桂酸酯[5]、L-抗壞血酸油酸酯[6]、L-抗壞血酸亞油酸酯[7]等多種L-抗壞血酸脂肪酸酯.其中L-抗壞血酸棕櫚酸酯已經(jīng)被批準(zhǔn)作為食品添加劑應(yīng)用于食品行業(yè)，而且是我國(guó)目前唯一可以應(yīng)用于嬰幼兒食品的抗氧化劑[8].

D-異抗壞血酸是L-抗壞血酸的旋光異構(gòu)體，分子結(jié)構(gòu)中含有活性連烯二醇結(jié)構(gòu)，是優(yōu)良的天然抗氧化劑[9].D-異抗壞血酸較L-抗壞血酸有更強(qiáng)的抗氧化能力且價(jià)格低廉，但同L-抗壞血酸一樣親油性差，不能很好地應(yīng)用在油基食品中，故很多學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向?qū)-異抗壞血酸改性的研究.目前主要集中在D-異抗壞血酸月桂酸酯[10]、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯[11]、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯[12- 13]以及D-異抗壞血酸混合脂肪酸酯[14]的制備和性質(zhì)研究.因此可見(jiàn)，關(guān)于D-異抗壞血酸脂肪酸酯的研究多見(jiàn)于D-異抗壞血酸飽和脂肪酸酯，而D-異抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.與飽和脂肪酸相比，修飾得到的不飽和脂肪酸酯與油脂有更好的相容性且不飽和脂肪酸有更好的營(yíng)養(yǎng)性.因此，文中以不飽和脂肪酸——油酸為酰基供體，叔戊醇為溶劑，Lipozyme 435固定化酶為催化劑合成D-異抗壞血酸油酸酯(D-isoascorbyl oleate,IAO)，并根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用JMP軟件[15](SAS軟件研究所)建立各因素與得率的Box-Behnken數(shù)學(xué)模型對(duì)其合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證因子間的相互作用并得到最優(yōu)工藝條件.JMP軟件可以更直觀地預(yù)測(cè)響應(yīng)模式對(duì)取值范圍內(nèi)任意取值下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以期獲得準(zhǔn)確可靠的最優(yōu)條件組合.

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

D-異抗壞血酸(98%)、油酸(90%)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；Lipozyme 435脂肪酶，酶活力9 160 PLU/g(PLU指每分鐘生成1 μmol丙基月桂酸酯所需的酶的量為一個(gè)單位)，諾維信(中國(guó))生物科技有限公司生產(chǎn)；4A分子篩，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；叔戊醇、乙酸乙酯、正己烷，均為分析純；甲醇、乙腈，均為色譜純.

1.2 儀器與設(shè)備

VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；AVANCE III HD 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；Agilent 1100/Esquire HCT PLUS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；DionexUltiMate3000高效液相色譜儀，美國(guó)DIONEX公司生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 IAO的合成和萃取分離

將一定量的油酸、D-異抗壞血酸、脫水處理過(guò)的叔戊醇、4A分子篩加入到錐形瓶中，在 50 ℃條件下攪拌 30 min 后，再加入一定量的 Lipozyme 435脂肪酶.反應(yīng)完成后抽濾除去分子篩和脂肪酶.然后取 200 μL 的濾液用甲醇稀釋后進(jìn)液相色譜(HPLC)分析并計(jì)算 IAO 得率.剩余的濾液經(jīng)旋蒸除去溶劑，得到的固體產(chǎn)物用乙酸乙酯和水萃取，將乙酸乙酯層減壓蒸餾除去溶劑后再用正己烷洗滌 3～5 次后，氮吹，得到 IAO 產(chǎn)品.

1.3.2 萃取產(chǎn)物的HPLC分析

取一定量的濾液用甲醇稀釋，用HPLC技術(shù)對(duì)合成的IAO進(jìn)行定量分析，采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，C18色譜柱(Eclipse XDB-C18,5 μm,4.6×250 mm)，流動(dòng)相采用乙腈/水/甲酸體積比為90∶10∶0.05，運(yùn)行時(shí)間20 min.根據(jù)面積歸一化法，按下式計(jì)算得率.

(1)

式中,AIAO和AD-異抗壞血酸分別表示IAO和D-異抗壞血酸的峰面積.

1.3.3 萃取產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

將樣品與干燥的KBr混合壓片，進(jìn)行紅外掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1，儀器分辨率優(yōu)于7.5 px-1.根據(jù)IAO和D-異抗壞血酸的FTIR圖譜上吸收峰的變化判斷待測(cè)化合物中的官能團(tuán)及其結(jié)構(gòu).

1.3.4 萃取產(chǎn)物的核磁共振波譜(NMR)分析

將得到的IAO用氘代氯仿溶解，室溫條件下進(jìn)行NMR分析，1H NMR和13C NMR的頻率分別為600 MHz和151 MHz，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物.

1.3.5 IAO合成的單因素試驗(yàn)

以IAO得率為指標(biāo)，分別選取油酸與D-異抗壞血酸油酸摩爾比3∶1，反應(yīng)時(shí)間20 h，酶添加量5%，溫度50 ℃，油酸濃度0.6 mol/L，分子篩添加量100 g/L.固定其它影響因素，分別考察油酸與D-異抗壞血酸摩爾比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，反應(yīng)時(shí)間為10、15、20、25、30 h，酶添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為1%、3%、5%、7%、9%，根據(jù)Lipozyme 435脂肪酶的最適催化溫度，同時(shí)保證反應(yīng)速率和優(yōu)化效率，分別選取反應(yīng)溫度為45、50、55、60、65 ℃，底物(以油酸計(jì))濃度為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L，分子篩添加量為0、50、100、150、200 g/L時(shí)的IAO得率變化.確定最適反應(yīng)條件，同時(shí)為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素和參數(shù)的選擇提供參考.

1.3.6 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以IAO得率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取反應(yīng)時(shí)間(X1)、溫度(X2)、分子篩添加量(X3)3個(gè)影響較大的因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示.根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的15個(gè)試驗(yàn)結(jié)果用二次多項(xiàng)式回歸模型擬合：

Y=β0+∑βiXi+∑βiiXi2+∑∑βijXiXj

(2)

式中，Y為IAO得率，β0、βi、βii、βij分別為截距、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互作用項(xiàng)的回歸系數(shù).Xi、Xj為影響因素.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平

Table 1 Analytical factors and levels for response surface metho-dology

因素水平低(-1)中(0)高(1)X1反應(yīng)時(shí)間/h182430X2反應(yīng)溫度/℃455055X3分子篩添加量/(g·L-1)50100150

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0、SPSS 20.0、JMP 10.0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果與討論

2.1 IAO的合成

按1.3.1的方法合成IAO，其化學(xué)反應(yīng)方程式如圖1所示.酶催化合成IAO反應(yīng)液中各組分的HPLC圖譜如圖2所示.D-異抗壞血酸和IAO的保留時(shí)間分別為2.22和8.73 min.

圖1 酶催化合成IAO的化學(xué)反應(yīng)式

Fig.1 Reaction formula for lipase-catalysed synthesis of IAO

圖2 合成IAO反應(yīng)液的HPLC圖譜

2.2 IAO的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 IAO產(chǎn)品的HPLC分析

按1.3.1的方法萃取分離得到IAO產(chǎn)品，用甲醇稀釋后進(jìn)行HPLC分析，其色譜圖如圖3所示.萃取分離后的產(chǎn)物主要為IAO.

圖3 IAO產(chǎn)品的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of extracted IAO products

2.2.2 IAO產(chǎn)品的FTIR分析

對(duì)萃取分離得到的IAO產(chǎn)品進(jìn)行FTIR分析，D-異抗壞血酸和IAO的FTIR圖譜如圖4所示.

圖4 D-異抗壞血酸和IAO的FTIR圖譜

Fig.3 FTIR spectra ofD-isoascorbyl acid and extracted IAO products

2.2.3 IAO產(chǎn)品的NMR分析

根據(jù)1.3.4中的NMR分析方法對(duì)分離后的樣品分別進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析，其NMR圖譜如圖5和圖6所示.由NMR圖譜可知，13C NMR(151 MHz,Chloroform-d):179.92(C-1′);152.08(C-2′);119.10(C-3′);75.34(C-4′);70.54(C-5′);68.74(C-6′);174.73(C-7);34.02(C-8);25.64(C-9);29.08(C-10);29.33(C-11,C-19);29.69(C-12);29.78(C-13,C-18);27.16(C-14,C-17);130.02(C-15);129.72(C-16);29.53(C-20);29.15(C-21);31.92(C-22);22.69(C-20);14.12(C-24);1H NMR(600 MHz,Chloroform-d):δ5.31～5.24(m,1H),2.30～2.25(m,1H),1.97～1.91(m,2H),1.57(q,J=7.4 Hz,1H),1.31～1.15(m,11H),0.81(t,J=6.9 Hz,2H).與D-異抗壞血酸的13C NMR圖譜[11]對(duì)比可知，sn-6′位上碳原子的化學(xué)位移由61.70增至68.74.1H NMR數(shù)據(jù)顯示，sn-5′位上有羥基，而sn-6′位上無(wú)羥基.

圖5 IAO產(chǎn)品的13C NMR圖譜Fig.3 13C NMR spectra of extracted IAO products

圖6 IAO產(chǎn)品的1H NMR圖譜Fig.6 1H NMR spectra of extracted IAO products

結(jié)合FTIR和NMR的結(jié)果可以判定油酸和D-異抗壞血酸的酯化反應(yīng)發(fā)生在D-抗壞血酸的sn-6位的羥基上，其產(chǎn)物為D-異抗壞血酸-6-油酸酯.

2.3 IAO合成的單因素試驗(yàn)

用1.3.5的方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示.由圖7(a)-(f)可知，隨著油酸與D-異抗壞血酸摩爾比的增加、油酸濃度的增大，產(chǎn)物得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì).綜合考慮實(shí)驗(yàn)得率和有機(jī)試劑用量等，本研究選取油酸與D-異抗壞血酸摩爾比3∶1， 油酸濃度為0.6 mol/L.隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 h時(shí)產(chǎn)物得率急劇下降，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，生成的水分越多，在一定的時(shí)間內(nèi)水分被分子篩除去，但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的攪拌破壞分子篩的孔穴結(jié)構(gòu)，降低其除水效果，當(dāng)體系中的水分活度超過(guò)酶的最適水分活度后，水分會(huì)通過(guò)毛細(xì)管和滲透作用進(jìn)入脂肪酶，改變了酶活性，使反應(yīng)向水解方向進(jìn)行，而限制了酯化合成反應(yīng).隨著酶添加量的增加，產(chǎn)物得率呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)橹久冈谟袡C(jī)相中催化合成IAO的過(guò)程中，水分含量逐漸增加，不僅阻礙IAO的催化合成，而且在油水界面脂肪酶會(huì)催化IAO的水解.而隨著酶添加量的增加，反應(yīng)速率增大，水分含量快速增加，從而加速IAO水解反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)降低其合成反應(yīng)速率，最終IAO得率趨于平衡.綜合考慮生產(chǎn)成本，本研究選取酶添加量為3%.而分子篩可以除去反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的水分，減弱水分對(duì)酶催化作用的影響，從而促進(jìn)IAO的合成.隨著分子篩的增加，產(chǎn)物得率不斷增加，在200 g/L時(shí)達(dá)到最大值，而添加量達(dá)到100 g/L后其得率無(wú)顯著差異，綜合考慮成本和響應(yīng)面優(yōu)化的準(zhǔn)確性，選擇50～150 g/L的分子篩添加量做進(jìn)一步的優(yōu)化.綜合分析圖7中6個(gè)因素可知，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和分子篩添加量對(duì)IAO得率影響較大，所以本研究將對(duì)這3個(gè)因素做進(jìn)一步優(yōu)化.

圖7 不同因素對(duì)IAO得率的影響

Fig.7 Effect of different factors on lipase-catalyzed synthesis of IAO

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化合成工藝

2.4.1 回歸模型的建立

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選取X1、X2、X3為自變量，IAO得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)方案，其結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 Experimental design and results of the response surface

試驗(yàn)編號(hào)X1/hX2/℃X3/(g·L-1)得率/%124555043.902185015065.183304510054.634245515073.87518505050.73630505052.617185510057.058244515042.289245010075.5410245010073.4911184510028.811224455055.2513305510036.5814245010069.2215305015052.06

2.4.2 模型建立及方差分析

利用JMP 10.0.0對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，其二次多項(xiàng)回歸方程為

表3 回歸模型方差分析表1)Table 3 Analysis of variance for regression equation

續(xù)表

方差來(lái)源方差和自由度均方FPX2359.78159.784.330.0919殘差69.02513.80失擬項(xiàng)48.23316.081.550.4159凈誤差20.79210.40總和2770.3414

1)*表示顯著，**表示極顯著.

2.4.3 響應(yīng)面法作圖分析結(jié)果

為了更直觀地描述各因子之間的相互作用，優(yōu)化出最適的工藝條件，結(jié)合JMP軟件擬合出該模型的響應(yīng)面立體圖(圖中黑點(diǎn)表示實(shí)際值)和交互作用圖，如圖8和圖9所示.

圖8 IAO得率的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

Fig.8 Response surface and contour curve of conversion rate of IAO

圖9 反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和分子篩添加量間的交互作用圖

Fig.9 Interaction among reaction temperature,reaction time,and molecular sieve amounts

由圖8和圖9可以對(duì)X1、X2、X3任意兩個(gè)因素的交互作用進(jìn)行分析.交互作用圖中，曲線彎曲程度越大，交叉現(xiàn)象越明顯表明這種因素的變化隨著相應(yīng)的變量因素的變化而明顯變化，即二者的交互作用越明顯.由圖9可知，X1與X2、X2與X3的交互作用很顯著，而X1與X3的交互作用不顯著.同時(shí)結(jié)合方差分析結(jié)果，可以得出X1、X2、X33個(gè)因素對(duì)反應(yīng)得率影響的大小依次是：X2>X3>X1.

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證試驗(yàn)

本研究將意愿設(shè)到最大化，得到的結(jié)果如圖10所示，由圖可知 IAO合成的最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間21.3 h，反應(yīng)溫度53.3 ℃，分子篩添加量150 g/L，IAO最大得率為78.40%.為了驗(yàn)證模型的可靠性，按照優(yōu)化得到的最佳工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，IAO得率為(74.65±1.50)%，與預(yù)測(cè)值接近，因此可以用此模型指導(dǎo)IAO的合成.

圖10 預(yù)測(cè)值刻畫器Fig.10 Prediction profile

3 結(jié)論

本研究旨在合成一種新型的脂溶性抗氧化劑，選用比L-異抗壞血酸價(jià)格低廉且抗氧化能力更高的D-異抗壞血酸與油酸為研究對(duì)象，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)IAO的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的工藝條件：油酸與D-異抗壞血酸摩爾比3∶1，反應(yīng)時(shí)間21.3 h，酶添加量3%，反應(yīng)溫度53.3 ℃，油酸濃度為0.6 mol/L，分子篩添加量150 g/L，IAO預(yù)測(cè)得率為78.40%，與此條件下的實(shí)驗(yàn)值(74.65±1.50)%接近，相對(duì)誤差為4.78%.用FTIR、1H和13C NMR對(duì)合成分離后的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果表明合成的IAO的結(jié)構(gòu)主要為D-異抗壞血酸-6-油酸酯.

[1] REKHA C,POORNIMA G,MANASA M,et al.Ascorbic acid,total phenol content and antioxidant activity of fresh juices of four ripe and unripe citrus fruits [J].Chemical Science Transactions,2012,1(2):303- 310.

[2] JIANG X J,HU Y,JIANG L,et al.Optimization of enzymatic synthesis ofL-ascorbyl palmitate by solvent engineering and statistical experimental designs [J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2013,18(2):350- 357.

[3] 王靈利,劉國(guó)琴,曹劉霞.響應(yīng)面法優(yōu)化L-抗壞血酸油酸酯合成及性能研究 [J].食品工業(yè)科技,2011(11):226- 231.

WANG Ling-li,LIU Guo-qin,CAO Liu-xia.Optimization ofL-ascorbate oleate production using response surface methodology and its properties [J].Science and Techno-logy of Food industry,2011(11):226- 231.

[4] LERIN L A,RICHETTI A,DALLAGO R,et al.Enzymatic synthesis of ascorbyl palmitate in organic solvents:Process optimization and kinetic evaluation [J].Food and Bioprocess Technology,2012,5(3):1068- 1076.

[5] CHANG S W,YANG C J,CHEN F Y,et al.Optimized synthesis of lipase- catalyzed l- ascorbyl laurate by Novozym435 [J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009,56(1):7- 12.

[7] SONG Q X,ZHAO Y,XU W Q,et al.Enzymatic synthesis ofL-ascorbyl linoleate in organic media [J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2006,28(4):211- 215.

[8] KARMEE S K.Lipase catalyzed synthesis of ester-based surfactants from biomass derivatives [J].Biofuels,Bioproducts and Biorefining,2008,2(2):144- 154.

[9] SELLECK R.Flavonoid and antioxidant such as ascorbic acid,erythorbic acid or alpha lipoic acid extend shell life:U.S.Patent 6,749,875 [P].2004- 06- 15.

[10] PARK K M,SUNG H,LEE J H,et al.Lipase-catalysed synthesis of erythorbyl laurate in acetonitrile [J].Food chemistry,2011,129(1):59- 63.

[11] SUN W J,ZHAO H X,CUI F J,et al.D-isoascorbyl palmitate:lipase-catalyzed synthesis,structural characterization and process optimization using response surface methodology [J].Chemistry Central Journal,2013,7(1):1.

[12] LIU Z,SHEN Y,LI W,et al.Process optimization and kinetic evaluation for biosynthesis of D-isoascorbyl stearate [J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2015,38(5):833- 839.

[13] CUI F J,ZHAO H X,SUN W J,et al.Ultrasound-assisted lipase- catalyzed synthesis ofD-isoascorbyl palmitate:process optimization and Kinetic evaluation [J].Chemistry Central Journal,2013,7(1):1- 10.

[14] 鄭大貴,祝顯虹,余泗蓮,等.酶法合成異VC混合脂肪酸酯及其抗氧化性能 [J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(14):6- 9.

ZHENG Da-zui,ZHU Xian-hong,YU Si-lian,et al.Lipase-catalyzed synthesis ofD-isoascorbyl mixed-fatty acid esters and their antioxidation activities [J].Food Research and Development,2013,34(14):6- 9.

[15] SALL J,LEHMAN A,STEPHENS M L,et al.JMP start statistics:a guide to statistics and data analysis using JMP [M].[S.l.] :SAS Publishing,2012.