銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑的方式及條件研究

鞏志金，車(chē)程川，楊 革，劉金鋒，梁光杰，梁鑫鑫，劉勝格

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑的方式及條件研究

鞏志金，車(chē)程川，楊 革，劉金鋒，梁光杰，梁鑫鑫，劉勝格

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

該文綜述了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生成鼠李糖脂的相關(guān)發(fā)酵技術(shù)的研究概況，包括液態(tài)發(fā)酵、半固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵等。重點(diǎn)介紹了影響液態(tài)發(fā)酵的相關(guān)因素，如碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、溫度、pH、消泡方法及分批補(bǔ)料發(fā)酵等的研究現(xiàn)狀，以期為今后利用銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑提供研究思路和技術(shù)參考。

銅綠假單胞菌；鼠李糖脂；發(fā)酵；生物表面活性劑

表面活性劑具有增加潤(rùn)濕性、乳化性、起泡性等優(yōu)良性能，是日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中重要的化工原料，素有“工業(yè)味精”之稱(chēng)[1]。生物表面活性劑是微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的新型表面活性劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)一般包括由酸類(lèi)、離子肽類(lèi)及糖類(lèi)等物質(zhì)組成的親水基團(tuán)和由飽和或不飽和的脂肪鏈或脂肪酸組成的疏水基團(tuán)，如脂肪酸、脂多糖、磷脂及脂蛋白質(zhì)等[2-4]。與傳統(tǒng)化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有無(wú)毒、可再生、易生物降解等優(yōu)勢(shì)，在石油化工、環(huán)境工程、生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，市場(chǎng)前景廣闊。如20世紀(jì)90年代在美國(guó)阿拉斯加發(fā)生的油船漏油事故中，通過(guò)向海面油層中加入了生物表面活性劑生產(chǎn)菌，幾周后油污中所含正烷烴基本被消耗掉[5]。

鼠李糖脂（rhamnolipid）是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的一種生物表面活性劑，其親水基團(tuán)一般由1～2分子的鼠李糖環(huán)構(gòu)成，疏水基團(tuán)則由不同碳鏈長(zhǎng)度的β-羥基烷酸構(gòu)成[6]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是自然環(huán)境中常見(jiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌[7]，由于其卓越的生產(chǎn)能力，已經(jīng)成為鼠李糖脂發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌株，也是唯一實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的菌株。目前，通常采用銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)鼠李糖脂。發(fā)酵過(guò)程受培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件等的影響，并存在一些諸如發(fā)酵過(guò)程中起泡嚴(yán)重等無(wú)法有效解決的技術(shù)問(wèn)題。近年來(lái)也有研究者嘗試采用半固態(tài)發(fā)酵[8]或固態(tài)發(fā)酵[9-10]的方式生產(chǎn)鼠李糖脂，以期更好的解決鼠李糖脂發(fā)酵過(guò)程中存在的問(wèn)題。

本文擬從目前研究最深入、技術(shù)最成熟的銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂為切入點(diǎn)，以液態(tài)發(fā)酵、半固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵3種鼠李糖脂發(fā)酵技術(shù)為線索，整理國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究報(bào)道、總結(jié)相關(guān)發(fā)酵條件并分析存在的技術(shù)問(wèn)題，以期為改進(jìn)鼠李糖脂的生產(chǎn)工藝和提高鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)水平提供技術(shù)參考。

1 液態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

從1949年JARVIS F G等[11]通過(guò)液態(tài)發(fā)酵首次獲得鼠李糖脂以來(lái)，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，液態(tài)發(fā)酵已經(jīng)成為鼠李糖脂生產(chǎn)的主要技術(shù)，也是目前唯一實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)。銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂受培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的影響，準(zhǔn)確的掌握各影響因素及合理的選擇發(fā)酵條件可以有效的提高鼠李糖脂的發(fā)酵產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1.1 碳源

碳源可為微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成提供所需的碳架和能量，是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。銅綠假單胞菌可以利用的碳源非常廣泛（如親水性的甘油、葡萄糖和乙醇等[12-13]及疏水性的石蠟、烷烴和植物油等[14]）。此外，還有研究者為了降低原料成本、增加鼠李糖脂的經(jīng)濟(jì)性，選擇利用廉價(jià)的工業(yè)廢棄物（如糖蜜廢水[15]和豆油煉油廠廢棄物[16]等）作為發(fā)酵的碳源。

一般來(lái)說(shuō)在銅綠假單胞菌可利用的眾多種碳源中，疏水性碳源特別是以植物油為代表的脂類(lèi)碳源比親水性碳源更適合用于鼠李糖脂的發(fā)酵。其原因可能是當(dāng)以植物油等疏水性碳源為底物時(shí)，銅綠假單胞菌為了利用這類(lèi)底物需要產(chǎn)生具有一定的表面活性物質(zhì)來(lái)增加其溶解度，從而促進(jìn)了鼠李糖脂的生成[17]。因此，在銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究中，多以植物油作為發(fā)酵的碳源。目前，國(guó)際上鼠李糖脂分批發(fā)酵的最高產(chǎn)量的報(bào)道是GIANI C等[18]以豆油為主要碳源并采取氮源限制的方法得到112g/L的鼠李糖脂。ZHU L等[19]也是以豆油為主要碳源得到70.56 g/L的鼠李糖脂。

1.2 氮源

培養(yǎng)基中的氮源可分為兩大類(lèi)：有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。銅綠假單胞菌可利用蛋白胨、尿素、硝酸鈉和硫酸銨等多種氮源合成鼠李糖脂，但大多數(shù)的研究表明，硝酸鈉為最適的發(fā)酵氮源[20-21]。這其中的原因可能是以硝酸鈉為氮源時(shí)，鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因（rhlAB）的表達(dá)量明顯高于硫酸銨等其他氮源[22]，或者是高濃度的NH4+等會(huì)降低細(xì)胞中谷氨酰胺的濃度，從而影響鼠李糖脂的合成[23]。

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的含量對(duì)調(diào)節(jié)菌體代謝和產(chǎn)物生成具有重要作用。研究表明，鼠李糖脂是一種在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期才大量合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，氮源過(guò)量會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)于迅速?gòu)亩绊懏a(chǎn)物的生成。因此，在發(fā)酵過(guò)程中通常會(huì)采用限制氮源的發(fā)酵方式來(lái)提高鼠李糖脂的產(chǎn)量。如ARINO S等[21]考察了氮源過(guò)量和控制氮源兩種培養(yǎng)條件對(duì)鼠李糖脂發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)氮源過(guò)量時(shí)菌株生長(zhǎng)迅速，在35h時(shí)就達(dá)到峰值并停止增長(zhǎng)，鼠李糖脂產(chǎn)量為2.1g/L；在限制氮源的條件下菌體生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，至50 h才停止生長(zhǎng)，鼠李糖脂的產(chǎn)量達(dá)到5.8 g/L。MARKUS M M等[24]以銅綠假單胞菌PAO1為生產(chǎn)菌株，并控制硝酸鈉的質(zhì)量濃度為1.5 g/L，得到了36.7 g/L的鼠李糖脂產(chǎn)量。

另外，培養(yǎng)基中的碳源和氮源的比例（C/N）對(duì)鼠李糖脂的發(fā)酵也有重要影響，合理的優(yōu)化培養(yǎng)基中C/N可以有效提高鼠李糖脂的發(fā)酵產(chǎn)量。LUIS G S等[20]評(píng)價(jià)了C/N為8～30時(shí)的鼠李糖脂發(fā)酵情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C/N為18時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，當(dāng)C/N低至9時(shí)生物量和產(chǎn)量會(huì)隨之減少。RAMANA K V等[25]發(fā)現(xiàn)當(dāng)以硝酸鈉、硫酸銨和硝酸銨為氮源時(shí)，C/N處于低水平時(shí)均有利于菌體生長(zhǎng)但不利于鼠李糖脂生產(chǎn)，而當(dāng)C/N逐漸升高至38時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量也都逐漸增加并達(dá)到最大。

1.3 無(wú)機(jī)鹽

發(fā)酵培養(yǎng)基中除碳源和氮源外，無(wú)機(jī)鹽元素如鎂鐵磷等也對(duì)銅綠假單胞菌發(fā)酵生成鼠李糖脂有較大影響，并且伴有低濃度時(shí)促進(jìn)、高濃度時(shí)抑制鼠李糖脂合成的現(xiàn)象。如LUIS G S等[20]發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂的產(chǎn)量會(huì)隨著碳元素與鐵離子質(zhì)量比（C/Fe）的增大而逐漸升高，但卻基本不受鉀離子、鈣離子和鈉離子的影響；鎂離子在低濃度時(shí)比高濃度時(shí)更有利于鼠李糖脂的合成[26]。RAMANA K V等[25]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了低濃度的鎂離子對(duì)發(fā)酵具有促進(jìn)作用，高濃度時(shí)有抑制作用。但是，卻發(fā)現(xiàn)無(wú)鐵離子的培養(yǎng)基中鼠李糖脂的產(chǎn)量要明顯高于有鐵離子的培養(yǎng)基，這與LUIS G S等[20]報(bào)道的現(xiàn)象正好相反。這可能是由于實(shí)驗(yàn)中所使用的菌株或培養(yǎng)基的差異造成的。

此外，CATHERINE N M等[27]的研究表明限制磷酸鹽的蛋白胨/葡萄糖/銨鹽培養(yǎng)基（phosphate-limited proteose peptone glucose ammonium saltsmedium，PPGAS）中鼠李糖脂的產(chǎn)量明顯高于磷含量較高的磷酸鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基和磷酸鹽肉湯培養(yǎng)基，說(shuō)明低濃度的磷可促進(jìn)鼠李糖脂的合成，高濃度的磷則具有抑制作用。

1.4 pH

pH可對(duì)微生物培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞膜的透性、膜上的帶電性以及酶活性等產(chǎn)生影響，從而影響發(fā)酵生產(chǎn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在鼠李糖脂的發(fā)酵過(guò)程中合理的控制培養(yǎng)基的pH值可有效的提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。有研究者以葡萄糖為碳源，考察了pH5.75～7.50范圍內(nèi)對(duì)發(fā)酵的影響。發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂發(fā)酵最適pH值為6.25，高于這個(gè)值時(shí)鼠李糖脂產(chǎn)量和菌體濃度均下降，而低于pH 5.75時(shí)則很難保持恒定的培養(yǎng)狀態(tài)無(wú)法進(jìn)行恒化培養(yǎng)[26]。還有研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)起始pH值為6～7時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量較高且基本不變，但是高于或低于這個(gè)范圍時(shí)鼠李糖脂產(chǎn)量明顯下降[21]。

通常人們會(huì)根據(jù)菌株和培養(yǎng)基組分的差異，將培養(yǎng)基的起始pH值控制在6～7之間來(lái)提高發(fā)酵的產(chǎn)量。如CHEN S Y等[28]在分批發(fā)酵和補(bǔ)料連續(xù)發(fā)酵中均將發(fā)酵pH值控制在6.8，得到了理想的發(fā)酵結(jié)果。此外，ZHU L等[19]還認(rèn)為根據(jù)菌體生長(zhǎng)代謝的需要在不同生長(zhǎng)階段分別控制發(fā)酵的pH，將有助于提高發(fā)酵的產(chǎn)量。將接種初期（0～24 h）的pH值控制在有助于菌體生長(zhǎng)的中性偏堿的范圍（7.0～7.5），發(fā)酵中后期（24 h后）的pH值控制在有利于鼠李糖脂合成的中性偏酸的生長(zhǎng)環(huán)境（6.0～6.5），最終得到了28.8 g/L的鼠李糖脂產(chǎn)量。這與未采取分段控制pH的分批發(fā)酵方式相比，產(chǎn)量提高了19.7%[19]。

1.5 溫度

銅綠假單胞菌可在多種溫度條件下合成鼠李糖脂，但最適發(fā)酵溫度一般為30～37℃。低至28℃或高于39℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成都會(huì)受到較大影響[26]。目前在鼠李糖脂的發(fā)酵研究中，人們通常會(huì)根據(jù)培養(yǎng)體系和菌株的差異選擇30℃或37℃作為發(fā)酵的溫度。如MARKUS M M等[24]在對(duì)目前已報(bào)道的3種非常優(yōu)異的鼠李糖脂生產(chǎn)菌—銅綠假單胞菌PAO1、DSM 7108和DSM 2874進(jìn)行了評(píng)價(jià)時(shí)，所選的發(fā)酵溫度即為30℃和37℃。

1.6 消泡

銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂是一個(gè)好氧過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程中大量的通氣和快速攪拌會(huì)導(dǎo)致起泡嚴(yán)重，不利于發(fā)酵生產(chǎn)。傳統(tǒng)的消泡方式如流加消泡劑和機(jī)械消泡等，僅適用于鼠李糖脂產(chǎn)量較低的發(fā)酵過(guò)程，當(dāng)產(chǎn)量較高時(shí)則無(wú)法滿足消泡要求。為此，THITIMA S等[29]開(kāi)發(fā)了發(fā)酵偶聯(lián)泡沫分離的消泡技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂的邊發(fā)酵邊泡沫分離。但是泡沫被分離液化后會(huì)含有大量的菌體和未利用的培養(yǎng)基，既浪費(fèi)了發(fā)酵基質(zhì)又增加了后續(xù)鼠李糖脂分離純化的難度，不利于鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)。CHAWALAC等[30]為了避免在鼠李糖脂發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行大量通氣和快速攪拌，提出了一種在厭氧狀態(tài)下進(jìn)行鼠李糖脂生物合成的全新策略，通過(guò)銅綠假單胞菌ATCC10145實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂的厭氧發(fā)酵，并優(yōu)化了培養(yǎng)基中碳、氮、磷、硫、鎂、鈣和鐵等離子的濃度得到了在厭氧條件下進(jìn)行鼠李糖脂發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方，實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂的無(wú)泡沫產(chǎn)生。但是，目前該技術(shù)得到的鼠李糖脂產(chǎn)量還較低，僅為好氧發(fā)酵的1/3，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

曾報(bào)道一種采用在發(fā)酵罐排氣口處連接一個(gè)用于收集和液化泡沫的儲(chǔ)罐的方式，可有效解決鼠李糖脂的消泡問(wèn)題[31]，具體的方法是將發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫經(jīng)尾氣出口進(jìn)入儲(chǔ)罐，并在儲(chǔ)罐內(nèi)進(jìn)行液化，液化后的發(fā)酵液可被重新泵入發(fā)酵罐進(jìn)行再次發(fā)酵。采用該發(fā)酵技術(shù)不僅減少了在消泡過(guò)程中造成的發(fā)酵基質(zhì)損失，也可在儲(chǔ)罐上安裝消泡劑噴淋或壓力控制裝置等進(jìn)行輔助消泡，是目前鼠李糖脂發(fā)酵中最有效的消泡方法。但是，這種發(fā)酵方式還不能解決發(fā)酵罐內(nèi)部起泡的問(wèn)題，無(wú)法對(duì)起泡后的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)和調(diào)控，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。

1.7 補(bǔ)料分批發(fā)酵

補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝可以使微生物在低濃度底物條件下持續(xù)發(fā)酵并可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)欣诮獬孜镆种坪痛x產(chǎn)物阻遏等問(wèn)題。但經(jīng)研究者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵的效果并不明顯（分批發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量范圍為6～112g/L，補(bǔ)料分批發(fā)酵為5～95g/L）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)律比較復(fù)雜，人們對(duì)此還缺乏理解[32]。此外，大多數(shù)高產(chǎn)的分批發(fā)酵都采用了較高濃度的植物油作為碳源，說(shuō)明銅綠假單胞菌可在高初始油濃度的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)和代謝，不存在明顯的底物抑制現(xiàn)象。因此，有時(shí)單純通過(guò)補(bǔ)料來(lái)提高發(fā)酵的水平并不理想，還需要輔以其他調(diào)控方式來(lái)提高產(chǎn)量。如ZHU L等[19]通過(guò)在補(bǔ)料發(fā)酵中輔以分段控制pH的方式得到70.56 g/L的鼠李糖脂產(chǎn)量，比相同條件下的分批發(fā)酵產(chǎn)量提高了193%。

2 半固態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

半固態(tài)發(fā)酵是指在基質(zhì)中含有部分游離水的體系中進(jìn)行的發(fā)酵，一般常用于釀酒、泡菜等傳統(tǒng)釀造食品的生產(chǎn)中，在鼠李糖脂發(fā)酵中的報(bào)道較少[33-34]。王盼盼等[8]以菜籽粕和麩皮為固相載體、甘油為碳源，采用半固態(tài)發(fā)酵的方式得到18.7g/L的鼠李糖脂，并且乳化系數(shù)要高于同等條件下液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂。半固態(tài)發(fā)酵所使用的固相載體一般為廉價(jià)的農(nóng)業(yè)廢棄物，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中存在大量的固相載體及其浸出物，增加了后續(xù)分離純化的困難，不利于鼠李糖脂的提取純化。但是，半固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂也有一定的存在價(jià)值，如采用廉價(jià)的農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵的固相載體，既降低了原料成本又在一定程度上減少了泡沫的產(chǎn)生，增加了鼠李糖脂的經(jīng)濟(jì)性。此外，半固態(tài)發(fā)酵得到的鼠李糖脂在土壤修復(fù)、生物農(nóng)藥及葉面肥料等鼠李糖脂純度要求較低的領(lǐng)域也具有一定的應(yīng)用潛力。

3 固態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

固態(tài)發(fā)酵是指在基質(zhì)中不含有游離水的體系中進(jìn)行的發(fā)酵，是一種發(fā)展已久的發(fā)酵技術(shù)?？墒请S著大規(guī)模深層液態(tài)發(fā)酵技術(shù)的廣泛應(yīng)用和巨大成功，固態(tài)發(fā)酵逐漸被人們忽視了。但是與液態(tài)深層發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵仍具有一些自身的優(yōu)勢(shì)，如對(duì)基質(zhì)要求低、設(shè)備占用空間小、通氣狀況良好和無(wú)需快速攪拌等。因此，為避免液態(tài)發(fā)酵起泡嚴(yán)重的問(wèn)題，人們開(kāi)始考慮利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)來(lái)生產(chǎn)鼠李糖脂。如DOUMIT C N等[9]以銅綠假單胞菌UFPEDA 614為生產(chǎn)菌株，利用甘蔗渣為固相載體進(jìn)行鼠李糖脂的固態(tài)發(fā)酵得到了46 g/L的鼠李糖脂，并且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中無(wú)泡沫產(chǎn)生，后來(lái)通過(guò)進(jìn)一步的優(yōu)化，得到了一種更低成本的鼠李糖脂固態(tài)發(fā)酵工藝，提高了固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的經(jīng)濟(jì)性[10]。此外，NALINI S等[35-36]也采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)成功的得到了鼠李糖脂。

目前對(duì)于固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究較少，僅限于搖瓶發(fā)酵報(bào)道，而且鼠李糖脂產(chǎn)量相對(duì)較低、產(chǎn)物中雜質(zhì)多、提純困難，再加上大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)自身的技術(shù)問(wèn)題，要實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)還有很長(zhǎng)的路要走。但是利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)鼠李糖脂為當(dāng)前鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)提供了另一種研究思路，具有一定的參考價(jià)值。

4 問(wèn)題與展望

經(jīng)過(guò)幾十年的研究，人們對(duì)銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的認(rèn)識(shí)已經(jīng)越來(lái)越全面，并且實(shí)現(xiàn)了一定規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。但是仍然存在著發(fā)酵生產(chǎn)效率較低、原料的成本過(guò)高、下游的提純工藝復(fù)雜且昂貴等諸多問(wèn)題，導(dǎo)致其在經(jīng)濟(jì)上與廉價(jià)的化學(xué)合成的表面活性劑相比不占優(yōu)勢(shì)，限制了鼠李糖脂工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。為此，今后可在以下幾方面繼續(xù)加強(qiáng)研究：

（1）提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率。加強(qiáng)銅綠假單胞菌的遺傳學(xué)研究，通過(guò)基因工程手段改良菌種，從而從源頭上提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率；改進(jìn)發(fā)酵工藝，解決諸如起泡嚴(yán)重帶來(lái)的生產(chǎn)問(wèn)題，提高設(shè)備利用率。

（2）降低原料成本。尋找廉價(jià)的可替代原料為底物，改變現(xiàn)有的普遍以昂貴植物油為碳源的發(fā)酵現(xiàn)狀，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化和復(fù)配，減少昂貴培養(yǎng)基組分的用量，降低生產(chǎn)成本。

（3）改進(jìn)下游提純工藝。整合優(yōu)化現(xiàn)有的提取方法，探索高效、簡(jiǎn)便的提純工藝，并建立有效的廢液回收機(jī)制，降低生產(chǎn)成本。

（4）加快鼠李糖脂的應(yīng)用研究，拓展應(yīng)用范圍。鼠李糖脂生物表面活性劑作為一種新型的表面活性劑，其應(yīng)用研究還處于起步階段，許多應(yīng)用領(lǐng)域還待開(kāi)發(fā)，很多應(yīng)用技術(shù)還待完善。所以應(yīng)重視并加快鼠李糖脂的應(yīng)用研究，拓展應(yīng)用范圍，增加市場(chǎng)需求。通過(guò)市場(chǎng)需求帶動(dòng)鼠李糖脂相關(guān)產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展，近而反哺和推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步。

總之，隨著社會(huì)的進(jìn)步和人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，21世紀(jì)的表面活性劑正朝著安全、溫和及易生物降解的方向發(fā)展，以鼠李糖脂為代表的生物表面活性劑將會(huì)擁有更加廣闊的市場(chǎng)前景。銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究，也將會(huì)迎來(lái)新的高速發(fā)展期。

[1]德魯·邁爾斯.表面、界面和膠體—原理及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：112-114.

[2]SAHARAN B S,SAHU R K,SHARMA D.A review on biosurfactants:fermentation,current developments and perspectives[J].Genet Eng Biotechnol J,2011,7(1):1-14.

[3]馬歌麗，彭新榜，馬翠卿，等.生物表面活性劑及其應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23（5）：42-45.

[4]時(shí)進(jìn)鋼，袁興中，曾光明，等.生物表面活性劑的合成與提取研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2003，30（1）：68-72.

[5]聶利紅，劉憲斌，田勝艷.生物表面活性劑在海洋溢油生物修復(fù)中的應(yīng)用[J].海洋環(huán)境保護(hù)，2007，2（1）：27-29.

[6]ABDEL-MAWGOUD A M,LéPINE F,DéZIEL E.Rhamnolipids:diversity of structures,microbial origins and roles[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(5):1323-1336.

[7]MARKUS M M,KüGLER J H,HENKEL M,et al.Rhamnolipids-Next generation surfactants?[J].J Biotechnol,2012,162(5):366-380.

[8]王盼盼，李成婕，何張?zhí)m.銅綠假單胞菌半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（11）：13-17.

[9]DOUMIT C N,JOEL A M,JANETE M A,et al.Optimization of the production of rhamnolipids byPseudomonas aeruginosaUFPEDA 614 in solid-state culture[J].Appl Environ Microbiol,2008,81(3):441-448.

[10]DOUMIT C N,CYSHELEN B,ARQUIMEDES P S F,et al.Production of rhamnolipids in solid-state cultivation using a mixture of sugarcane bagasse and corn bran supplemented with glycerol and soybean oil[J].Appl Microbiol Biotechno,2011,89(5):1395-1403.

[11]JARVIS F G,JOHNSON M J.A glycolipid produced byPseudomonas aeruginosa[J].J Am Chem Soc,1949,71(12):4124-4126.

[12]ARQUIMEDES P S F,DOUMIT C N,LAURO M S,et al.Evaluation of the structural composition and surface properties of rhamnolipid mixtures produced byPseudomonas aeruginosaUFPEDA 614 in different cultivation periods[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,175(2):988-995.

[13]MATSUFUJI M,NAKATA K,YOSHIMOTO A,et al.High production of rhamnolipids byPseudomonas aeruginosagrowing on ethanol[J].Biotechnol Lett,1997,19(12):1213-1215.

[14]ZHANG G,WU Y,QIAN X,et al.Biodegradation of crude oil byPseudomonasaeruginosainthepresenceofrhamnolipids[J].J Zhejiang Univ Sci,2005,6B(8):725-730.

[15]LI A,XU M,SUN W,et al.Rhamnolipid production byPseudomonas aeruginosaGIM 32 using different substrates including molasses distillery wastewater[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,163(5):600-611.

[16]MARYAM P,TAYEBE B L,REZA R,et al.Management of soybean oil refinery wastes through recycling them for producing biosurfactant usingPseudomonas aeruginosaMR01[J].World J Microbiol Biotechnol,2013,29(6):1039-1047.

[17]吳 虹，汪 薇，韓雙艷.鼠李糖脂生物表面活性劑的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（1）：148-152.

[18]GIANI C,WULLBRANDT D,ROTHERT R,et al.Pseudomonas aeruginosaand its use in a process for the biotechnological preparation of L-rhamnose:US005658793A[P].1997-8-19.

[19]ZHU L,YANG X,XUE C,et al.Enhanced rhamnolipids production by Pseudomonas aeruginosabased on a pH stage-controlled fed-batch fermentation process[J].Bioresource Technol,2012,117(24):208-213.

[20]LUIS G S,K?PPELI O,FIECHTER A,et al.Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source[J].Appl Environ Microbiol,1984,48(2):301-305.

[21]ARINO S,MARCHAL R,VANDECASTEELE J P,et al.Identification and production of a rhamnolipidic biosurfactant by aPseudomonas species[J].Appl Microbiol Biotechnol,1996,45(1):162-168.

[22]DéZIELE,LéPINEF,MILOTS,etal.rhlAisrequiredfortheproduction of a novel biosurfactant promoting swarming motility inPseudomonas aeruginosa:3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs),the precursors of rhamnolipids[J].Microbiology,2003,149(8):2005-2013.

[23]MULLIGAN C N,GIBBS B F.Correlation of nitrogen metabolism with biosurfactant production byPseudomonas aeruginosa[J].Appl Environ Microbiol,1989,55(11):3016-3019.

[24]MARKUS M M,BARBARA H,MICHAELA K,et al.Evaluation of rhamnolipid production capacity ofPseudomonas aeruginosaPAO1 in comparison to the rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874[J].Appl Microbiol Biotechnol,1996,45(1):162-168.

[25]RAMANA K V,KARANTH N G.Factors affecting biosurfactant pro-duction usingPseudornonas aeruginosaCFTR-6 under submerged conditions[J].J Chem Technol Biotechnol,1989,45(4):249-257.

[26]LUIS G S,OTHMAR K,ARMIN F,et al.Dependence ofPseudomonas aeruginosacontinuous culture biosurfactant production on nutritional andenvironmentalfactors[J].J Chem Technol Biotechnol,1986,24(6):443-448.

[27]CATHERINE N M,GEORGES M,BERNARD F G.The influence of phosphate metabolism on biosurfactant production byPseudomonas aeruginosa[J].J Biotechnol,1989,12(3-4):199-209.

[28]CHEN S Y,WEI Y H,CHANG J S.Repeated pH-stat fed-batch fermentation for rhamnolipid production with indigenousPseudomonas aeruginosaS2[J].Appl Environ Microbiol,2007,76(8):67-74.

[29]THITIMA S,ORATHAI P,SUMAETH C,et al.Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant produced byPseudomonas aeruginosaSP4usingfoamfractionation[J].Bioresource Technol,2010,101(1):324-330.

[30]CHAWALA C,JIAN WU,L K J.Rhamnolipid production byPseudomonas aeruginosaunder denitrification:effects of limiting nutrients and carbon substrates[J].Biosensors Bioelectron,2001,72(1):25-33.

[31]GONG Z,PENG P,WANG Q.Rhamnolipid production,characterization and fermentation scale-up byPseudomonas aeruginosawith plant oils[J].Biotechnol Lett,2015,37(10):2033-2038.

[32]MARKUS M M,RUDOLF H.Regulatory and metabolic network of rhamnolipidbiosynthesis:Traditionaland advanced engineeringtowards biotechnological production[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91(2):251-264.

[33]高玉瑩.半固態(tài)法釀酒技術(shù)的探討[J].化工管理，2013，25（12）：83-84.[34]韓新鋒，劉書(shū)亮，張艾青，等.產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌純種半固態(tài)發(fā)酵對(duì)泡菜品質(zhì)的影響[J].中國(guó)釀造，2012，31（7）：72-76.

[35]NALINI S,PARTHASARATHI R.Production and characterization of rhamnolipids produced bySerratia rubidaeaSNAU02 under solid-state fermentation and its application as biocontrol agent[J].Bioresource Technol,2014,173(23):231-238.

[36]SEGHAL K G,ANTO T T,JOSEPH S.Production of a new glycolipid biosurfactant from marineNocardiopsis lucentensisMSA04 in solidstate cultivation[J].Colloid Surface B,2010,78(1):8-16.

Fermentation method and condition of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa

GONG Zhijin,CHE Chengchuan,YANG Ge,LIU Jinfeng,LIANG Guangjie,LIANG Xinxin,LIU Shengge
(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)

Fermentation technology of rhamnolipid was reviewed byPseudomonas aeruginosain this paper,including liquid-state fermentation,semi-solid state fermentation and solid-state fermentation.In addition,influencing factors were specially summarized in liquid-state fermentation,such as carbon source,nitrogen source,inorganic salt,temperature,pH,defoaming method and batch-fed fermentation,which could provide a good idea and reference for the fermentation of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa;rhamnolipid;fermentation;biosurfactant

Q93

0254-5071（2017）10-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.027

2017-08-10

國(guó)家級(jí)“本科教學(xué)工程”專(zhuān)業(yè)綜合改革試點(diǎn)（ZG0293）；高校應(yīng)用型人才培養(yǎng)專(zhuān)業(yè)發(fā)展支持計(jì)劃（魯教高字[2015]5號(hào)）；曲阜師范大學(xué)科技計(jì)劃（xkj201610）

鞏志金（1988-），男，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榇x與發(fā)酵工程。