腫瘤癌變細胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究

陳 舒，陳若寒

(福建警察學(xué)院 計算機與信息安全管理系，福建 福州 350007)

腫瘤癌變細胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究

陳 舒，陳若寒

(福建警察學(xué)院 計算機與信息安全管理系，福建 福州 350007)

腫瘤癌變細胞FISH圖像分析系統(tǒng)中，需要解決粘連細胞核的分割問題。FISH屬于新興技術(shù)，產(chǎn)生的是特殊的熒光彩色細胞圖，現(xiàn)有細胞圖像分析方法并不適用。文章創(chuàng)新設(shè)計了基于深度凹陷檢測和構(gòu)造自然凹陷力的方法，分離粘連細胞核。首先，針對參差不齊的實驗成像，在RGB模型下結(jié)合統(tǒng)計思想，將圖像分為三類，分別進行預(yù)處理。繼而，利用融合了K-means聚類算法的改進馬爾科夫隨機場(MRF)方法，將細胞核與癌變信號點進行有效提取。在此基礎(chǔ)上，利用幾何原理，創(chuàng)新設(shè)計了一套粘連細胞核分離算法。最后，給出細胞核快速計數(shù)和信號點提取方法。該系統(tǒng)設(shè)計基本完整，并達到預(yù)期效果。

FISH圖像；細胞核提取；MRF模型；細胞核粘連；自然凹陷力

0 引言

較多研究表明，癌變細胞中都存在HER2蛋白的過表達或基因擴增現(xiàn)象。當(dāng)前的檢測技術(shù)有很多種，其中的FISH技術(shù)雖是一項新興技術(shù)但已經(jīng)被公認(rèn)為業(yè)界的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[1-2]。

經(jīng)過FISH技術(shù)處理后產(chǎn)生的腫瘤癌變細胞圖像中，包含三個主要成分：背景(黑色)、細胞核(藍色)、信號點(紅色和綠色)。通過統(tǒng)計、分析細胞核與信號點的個數(shù)，就可以實現(xiàn)對HER2蛋白擴增現(xiàn)象的檢測。

1 預(yù)處理

FISH圖像中，具有研究價值的區(qū)域恰好與RGB顏色模型的三個通道相吻合，不需要進行復(fù)雜的映射或者換算，所以選用RGB模型來進行設(shè)計。通過批量觀察以及相應(yīng)資料的查閱，F(xiàn)ISH技術(shù)呈現(xiàn)的細胞核大致具有3個特點：邊緣模糊(熒光強度不同)、核外輪廓各異(探針手工著色)、核內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜(孔洞)，需要進行預(yù)處理使得圖像呈現(xiàn)最佳效果，從而簡化算法。

1.1 FISH圖像分類

首先，根據(jù)成像的熒光效果，將圖像分為三類：(1)弱熒光信號圖；(2)暈染嚴(yán)重信號圖；(3)理想信號圖。分別如圖1(a)、(b)、(c)所示。在專家指導(dǎo)下進行手工分類作為訓(xùn)練樣本，得出圖像在藍色通道上的分布規(guī)律，借助統(tǒng)計學(xué)原理，進行自動分類。

圖1 三類腫瘤癌變細胞FISH圖像示例

1.2 非理想圖片的改善

需要對弱熒光圖進行增強，對暈染現(xiàn)象進行去除。

1.2.1 弱熒光圖自適應(yīng)增強

(1)原圖像進行疊加，I=1.5×I(這步操作的實質(zhì)是對亮度進行疊加)；

(2)重新判斷是否為弱熒光，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟(1)，否則停止。實驗效果如圖2所示。

圖2 弱熒光信號圖自適應(yīng)增強的前后對比

1.2.2 暈染現(xiàn)象的自動去除

(1)將判別為“暈染嚴(yán)重”的原始圖像轉(zhuǎn)化為藍色亮度圖；

(2)運用Otsu法進行閾值分割，目標(biāo)標(biāo)記為1(白)，背景標(biāo)注為0(黑)；

(3)填補小于閾值Pc個像素點的連通區(qū)域(孔洞)；

(4)去除小于閾值Pc個像素點的連通區(qū)域(非細胞核區(qū)域)；

(5)將標(biāo)記為目標(biāo)的區(qū)域恢復(fù)成RGB圖，其他部分保持黑色背景；

(6)重新判斷是否暈染嚴(yán)重，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟(2)，否則停止。實驗效果如圖3。

圖3 嚴(yán)重暈染現(xiàn)象去除前后對比圖

其中Pc默認(rèn)為原圖總像素點的4%，這個百分比是根據(jù)多次實驗效果得出的經(jīng)驗值，表示該圖片中的細小孔洞，可以自適應(yīng)各種尺寸的原始圖像。

2 FISH圖像細胞核的提取

2.1 傳統(tǒng)方法

對細胞核提取的常用方法主要依據(jù)四類原理，分別是：閾值分割、邊緣檢測、傳統(tǒng)區(qū)域思想以及基于特殊算法的理論[3-4]。

閾值分割雖然快速簡便、不需要先驗知識，卻沒有考慮與鄰域像素點之間的關(guān)聯(lián)性，分割較為粗糙，容易發(fā)生誤判；邊緣檢測雖然是基于各個像素點與其鄰域的差異，但是細胞核內(nèi)熒光信號產(chǎn)生了大量的梯度變化，給真實邊緣的檢測增加了困難；傳統(tǒng)區(qū)域思想需要先驗知識并對圖像有一定要求，且不考慮空間信息，容易造成過分割；而基于特殊算法的理論，則因為其特定的應(yīng)用條件、復(fù)雜的參數(shù)或?qū)D像計算量的要求等，在FISH圖像的細胞核提取中并不適用。

2.2 本文方法

綜合以上算法的優(yōu)缺點，本文考慮到像素點間的關(guān)聯(lián)，選取馬爾科夫隨機場(MRF)[5-7]與無監(jiān)督的聚類算法相結(jié)合來進行圖像分割，提取FISH圖像的細胞核。

從算法計算量和精度的角度考慮，在MRF建模中，選用二階8-鄰域系統(tǒng)的Potts模型作為標(biāo)記場模型，有限高斯混合模型(FGMM)建立觀測場，迭代條件模式(ICM)作為最優(yōu)化分割算法，其中Potts模型中的勢函數(shù)β改進為可變勢函數(shù)βb。

2.2.1 可變勢函數(shù)

勢函數(shù)β的大小對分割結(jié)果影響很大。以圖4a為例進行分割，選取其中β=0.5和β=5的情況，分割結(jié)果如圖4(b)和圖4(c)。

圖4 圖像在不同勢函數(shù)作用下的分割結(jié)果

顯然，當(dāng)勢函數(shù)β增大時，標(biāo)記場就越占主導(dǎo)，區(qū)域性就越好，分割結(jié)果細節(jié)也就越差；當(dāng)勢函數(shù)β變小時，標(biāo)記場的影響就弱了，觀測場占的比重變大，分割結(jié)果細節(jié)信息豐富，區(qū)域性差。由此引入可變勢函數(shù)βb，符合“前期著重在區(qū)域性的控制，后期集中在細節(jié)信息的判斷”的規(guī)律，勢函數(shù)應(yīng)該是逐漸變小的。

綜上所述，設(shè)計可變勢函數(shù)如下：

令初始勢函數(shù)β=1，總迭代次數(shù)限制為maxIter，當(dāng)前迭代次數(shù)為Iter，則當(dāng)Iter

(1)

上式保證在迭代次數(shù)Iter增加時，勢函數(shù)βb是緩慢變小的，并且不會偏離最初由經(jīng)驗確定的β值太多。

2.2.2FISH圖像細胞核的提取具體步驟

(1)將原始圖像轉(zhuǎn)化為藍色亮度圖;

(2)設(shè)定實驗圖像分類數(shù)K=2，初始勢函數(shù)β=1，最大迭代次數(shù)maxIter=10；

(3)應(yīng)用K-means聚類算法得到初始分割；

(4)估計觀測場參數(shù)μ和σ2；

(5)計算FGMM模型建立的觀測場能量；

(6)計算Potts模型建立的標(biāo)記場能量；

(7)根據(jù)能量最小原則，估計新的分割；

(8)判斷是否滿足迭代終止條件(MAP準(zhǔn)則和最大迭代次數(shù))，滿足則算法停止，得到最佳分割，否則更新勢函數(shù)βb的值，并重新轉(zhuǎn)入步驟(3)。

2.2.3 實驗效果

分別用Otsu自動閾值法、傳統(tǒng)的K-means聚類算法以及本文算法對FISH細胞圖像進行分割，效果如圖5所示?？梢钥闯?，本文算法比前兩種產(chǎn)生的分割結(jié)果更加連續(xù)，且錯判產(chǎn)生的孔洞現(xiàn)象更少。這說明：融合了MRF模型的K-means聚類分割方法，在兼顧了區(qū)域完整性的同時較好地保有了細節(jié)信息。而引入可變的勢函數(shù)βb的優(yōu)勢，在前文已有分析。在判定為細胞核的一些區(qū)域內(nèi)，仍然存在一些細小的孔洞，用前文處理暈染圖片時使用的方法修復(fù)，效果如圖6所示。

圖5 三種算法對細胞核提取效果比較

圖6 本文算法對細胞核提取并修復(fù)

3 粘連細胞核的分離

對粘連細胞核分離的常用方法主要依據(jù)三類原理，分別是：基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)、基于形狀特征以及特定理論的方法。

3.1 傳統(tǒng)方法

當(dāng)目標(biāo)粘連緊密時，應(yīng)用基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法通常得不到理想的種子點個數(shù)。

基于形狀特征原理，主要是采用尋找凹點進而分離的方法。將細胞核的粘連方式分為串聯(lián)和并聯(lián)兩類，根據(jù)每個區(qū)域凹點奇偶性或者其他準(zhǔn)則，來判斷屬于哪一類粘連。然后運用不同的凹點匹配策略，進行凹點連線劃分。但大部分的方法并沒有考慮更加復(fù)雜的串并聯(lián)混合情況，F(xiàn)ISH細胞核恰屬于復(fù)雜粘連情況，同時，F(xiàn)ISH細胞核邊緣不規(guī)則，容易出現(xiàn)“假凹點”。

基于特定理論的方法中，比較適合FISH圖像復(fù)雜結(jié)構(gòu)的是文獻[8]中提出的基于水平集和隨機霍夫圓檢驗方法來分離原生質(zhì)細胞核。但該算法融入了水平集算法，需要設(shè)定的參數(shù)非常多，隨著粘連細胞核個數(shù)的增加和粘連情況的復(fù)雜，相應(yīng)的參數(shù)也更加難以全面設(shè)置，并且需要用到統(tǒng)計學(xué)的霍夫投票法決定區(qū)域的分割歸屬問題，計算量較大，影響了總體分析效率，故不采用。此外，其他文獻中基于主動輪廓模型[9-10]和圖論[11-12]等方法的改進，都因計算量比較大，不予采用。

3.2 本文方法

在Harris和Susan算法的基礎(chǔ)上，改進設(shè)計出“深度凹陷點”的檢測方法，尋找因粘連造成的真正凹陷，同時判斷出粘連現(xiàn)象的存在與否。接著，創(chuàng)新引入“自然凹陷力”的概念，令深度凹陷點的凹陷有規(guī)律有方向地加深，并逐漸產(chǎn)生區(qū)域斷裂，最終實現(xiàn)粘連的分離。

3.2.1 深度凹陷點檢測

本文將角點分為以下4種點情況：鈍角凸點、銳角凸點、輕微凹陷點、深度凹陷點。本文定義的深度凹陷點必須滿足以下條件：以該角點作為圓形模板的中心，角點的兩條線段在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)構(gòu)成的夾角必須大于225°。

本文設(shè)計的深度凹陷檢測方法：

(1)設(shè)FISH細胞核二值圖I中，目標(biāo)(細胞核區(qū)域)標(biāo)記為1，背景標(biāo)記為0，同時構(gòu)造半徑R=5的圓形模板M，模板內(nèi)標(biāo)記為1的像素點總個數(shù)為MMAX；

(2)利用Harris角點檢測算法對I進行掃描，得到一個角點集合J(j1,j2,...,jn)；

(3)將圓形模板M的中心與J(j1,j2,...,jn)逐點重合；

(4)借鑒Susan算法的思想，得到每一個角點位置上的USAN值MUSAN；

(5)當(dāng)MUSAN>5/8×MMAX時，該角點判定為深度凹陷點，存入集合H中，用于下一階段運算。

3.2.2 粘連判斷

當(dāng)某個目標(biāo)連通區(qū)域內(nèi)存在深度凹陷點時，該區(qū)域存在粘連現(xiàn)象，需要實現(xiàn)細胞分離，否則是獨立細胞核。

3.2.3 自然凹陷力

設(shè)想：在現(xiàn)實世界中，要讓這些粘連的細胞核產(chǎn)生分離，可以對每一個深度凹陷處施加作用力，要求該作用力的大小一致，方向順應(yīng)每個凹陷處的凹陷方向，這樣在凹陷處就會不斷地加深凹陷程度，粘連的細胞核們也會逐漸被擠壓得分離開。當(dāng)某幾處作用力匯集到一點時，該局部的粘連區(qū)域就被分離；當(dāng)圖像中所有深度凹陷處施加的作用力都匯集到某一處時，則粘連部分被完全分離。

為了滿足實時性的需求，本文采用純幾何的線性思想來模擬自然凹陷力的作用，如圖7所示。

圖7 本文設(shè)計的自然凹陷力作用示意圖

本文設(shè)計的自然凹陷力具體作用過程為：

(1)取深度凹陷點集合H(H1,H2,...,Hn)；

(2)定位至其中一點Hi(i=1,2...,n)，以該點為圓心、R=8(多次實驗的經(jīng)驗值)為半徑構(gòu)造一個圓，設(shè)該圓交Hi兩條邊的交點分別為J1和J2；

(4)逐個定位至H中的其他點，重復(fù)步驟(2)和(3)，遍歷一輪后，將產(chǎn)生的集合H′作為新的凹陷點集合H，完成一輪自然凹陷力作用；

(5)定位至更新過的Hi點，重復(fù)步驟(2)～(4)，直至新產(chǎn)生的Hi′不再在目標(biāo)內(nèi)時，停止Hi點的繼續(xù)凹陷，跳至H中的其他點繼續(xù)操作，直至所有的H′都在背景中時(表示粘連產(chǎn)生的凹陷區(qū)域都完成分離)，停止所有操作。

3.2.4 本文粘連分離方法

(1)讀取一張原始FISH細胞核圖Iy；

(2)利用前文設(shè)計的方法，將Iy分類并預(yù)處理為理想圖I，使用前文設(shè)計的細胞核提取方法，將I中的細胞核提取出來，并將圖像轉(zhuǎn)化為二值圖I0；

(3)對I0做邊界提取，記錄目標(biāo)初始邊緣ED0；

(4)利用半徑R=3的近圓形結(jié)構(gòu)元素SE，對I0圖像做腐蝕運算，分離輕微粘連的細胞核；

(5)利用前文設(shè)計的“深度凹陷檢測方法”，檢測出當(dāng)前圖中深度凹陷點，存入集合H；

(6)利用前文“自然凹陷力”，逐點加深H點處的凹陷，最終使得細胞核粘連區(qū)域全部得以分離；

(7)對分離后的各個區(qū)域進行連續(xù)粗化運算(保持不連通性)，使各個區(qū)域復(fù)原成原始大小，直至區(qū)域邊緣達到ED0的極限，且結(jié)果不再變化為止；

(8)對當(dāng)前二值圖I0做邊界提取，記錄當(dāng)前目標(biāo)的邊緣ED，則ED為細胞核的分離界線；

(9)將分離界線轉(zhuǎn)化為紅色，疊加于圖像I上，作為輸出結(jié)果。

3.2.5 實驗效果

分別選取“簡單粘連”和“復(fù)雜粘連”的FISH細胞核圖像進行分離實驗，結(jié)果如圖8、圖9所示，實驗效果理想。

圖8 簡單粘連的分離效果

圖9 復(fù)雜粘連的分離效果

4 細胞核計數(shù)和信號點提取

4.1 細胞核計數(shù)

讀取一張經(jīng)過粘連分離后的細胞核二值圖I0，繼而計算標(biāo)記為目標(biāo)(標(biāo)記為1)的連通區(qū)域數(shù)，即為細胞核個數(shù)。

4.2 信號點提取

紅色信號點的提取方法：先將G和B的值減為0，得到R-紅色熒光圖，再通過閾值分割和極限腐蝕法得到幾何中心，用于后續(xù)分析。同理，可用于綠色信號點的提取。

5 結(jié)論

系統(tǒng)主要實現(xiàn)4個功能：(1)FISH圖像預(yù)處理；(2)FISH細胞核的提取；(3)粘連細胞核的分離；(4)細胞核技術(shù)和信號點提取。上述設(shè)計，都在滿足精確度和視覺效果要求的范圍內(nèi)，盡可能構(gòu)造計算量小、直觀性強的方法。但仍存在著不足：無法實現(xiàn)某些特殊情況下的粘連分離，比如在細胞核嚴(yán)重團簇、細胞核發(fā)生多層粘連時，內(nèi)層細胞核相互擠壓，沒有形成凹陷，使之無法分離。這有待進一步改善。

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Research on the FISH image analysis system of tumor cell

Chen Shu，Chen Ruohan

(Department of Computer and Information Security Management，F(xiàn)ujian Police College,Fuzhou 350007， China)

In FISH image analysis system, the segmentation of the cell nucleus is needed. FISH is a new technology, it is a special fluorescent color cell image, the existing cell image analysis method is not applicable. In this paper, we design a method based on deep depression detection and constructing the natural sag force to separate the adhesion nucleus. Firstly, according to the different experimental imaging, the images are divided into three kinds according to the RGB model, and the images are preprocessed. Then, using the improved Markov Random Field (MRF) method with the integration of K-means clustering algorithm, to extract nuclei and carcinogenesis signal points. On this basis, using geometric principles, a set of adhesion cell nuclear separation algorithm is designed. In the end, the method of nuclear fast counting and signal point extraction is presented. The design of the system is basically complete, and achieve the desired results.

FISH image；nucleus extraction；MRF model；nucleus adhesion；natural depression force

R857.3;TP391

A

10.19358/j.issn.1674- 7720.2017.01.015

陳舒，陳若寒. 腫瘤癌變細胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究[J].微型機與應(yīng)用，2017,36(1)：48-51，55.

2016-10-20)

陳舒(1988-)，女，碩士研究生，助教，主要研究方向：圖像處理，模式識別。

陳若寒(1987-)，男，碩士研究生，助教，主要研究方向：圖像處理，模式識別。