不同品種豬PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)規(guī)律與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)

盤道興，王振，楊茂林，廖喬平，楊昌平，吳宇萍，王金洲，劉若余

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不同品種豬PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)規(guī)律與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)

盤道興1，王振1，楊茂林2，廖喬平3，楊昌平3，吳宇萍3，王金洲1，劉若余1

（1貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；2貴州省江口縣科技局，貴州銅仁554400；3貴州省江口縣畜牧局，貴州銅仁554400）

【目的】研究PPARγ和C/EBPα基因在豬不同組織、月齡和品種中mRNA的表達(dá)規(guī)律，結(jié)合屠宰試驗分析PPARγ和C/EBPα mRNA表達(dá)水平對肌內(nèi)脂肪沉積的影響?！痉椒ā窟x取3—7月齡的江口蘿卜豬、從江香豬和大白豬為試驗材料，提取心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌和皮下脂肪的總RNA，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測PPARγ和C/EBPα基因在3個品種不同月齡各組織中mRNA的相對表達(dá)量，同時測定背最長肌中的肌內(nèi)脂肪含量。【結(jié)果】PPARγ、C/EBPα在大白豬3—7月齡各組織中均有表達(dá)，其中肝、小腸、背最長肌、皮下脂肪的表達(dá)水平較高，心、脾、肺、腎的表達(dá)水平較低。其中PPARγ在小腸、背最長肌、皮下脂肪中3、4月齡分別與6、7月齡的表達(dá)量差異極顯著（＜0.01）。C/EBPα在肝、肺、小腸、皮下脂肪中3月齡與6、7月齡均差異極顯著（＜0.01）；PPARγ、C/EBPα在江口蘿卜豬心、脾、肺、腎、背最長肌的表達(dá)量最低，在皮下脂肪中最高，具有組織特異性。其表達(dá)量隨月齡遞增而上升，皮下脂肪的增加幅度最大。其中PPARγ在小腸、背最長肌、皮下脂肪中3、4月齡與6、7月齡的表達(dá)量差異極顯著（＜0.01）。C/EBPα在小腸、皮下脂肪中3月齡與5、6、7月齡的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）；PPARγ、C/EBPα在從江香豬心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌的表達(dá)量較低，在皮下脂肪的表達(dá)量最高，PPARγ的表達(dá)量隨月齡增加而上升的幅度較小， C/EBPα的表達(dá)量在各組織中的表達(dá)量隨時間增加而上升。其在小腸、皮下脂肪、背最長肌中3、4月齡與6、7月齡的表達(dá)量差異極顯著（＜0.01）；PPARγ和C/EBPα基因在各組織均有表達(dá)，組織間的表達(dá)量存在差異，其中在肝、小腸、皮下脂肪中為高豐度表達(dá)。隨著月齡的增加，PPARγ和C/EBPα基因mRNA的表達(dá)模式基本相同，總體呈現(xiàn)上升趨勢，6、7月齡的表達(dá)水平較高，即隨著月齡的增加而逐漸上升，到生長后期維持一個相對穩(wěn)定水平?？傮w上皮下脂肪的表達(dá)量最高，其次肝、肺、小腸、背最長肌中較高，心、脾、腎中的表達(dá)量最低; 不同品種間PPARγ、C/EBPα在相同月齡各組織中的表達(dá)量存在差異，總體上大白豬中肝、小腸、皮下脂肪中PPARγ和C/EBPα mRNA的表達(dá)量分別與江口蘿卜豬、從江香豬差異顯著；肌內(nèi)脂肪含量隨著月齡的增加持續(xù)上升，不同品種間肌內(nèi)脂肪含量存在差異，其中江口蘿卜豬和從江香豬較高。不同品種豬PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析表明，不同時期基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈不同程度正相關(guān)?！窘Y(jié)論】豬PPARγ和C/EBPα基因在不同組織、時期和品種中的表達(dá)差異可能與脂質(zhì)代謝和脂肪沉積有關(guān)。

豬；PPARγ；C/EBPα；基因表達(dá)；肌內(nèi)脂肪

0 引言

【研究意義】肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）是影響肉品質(zhì)的主要因素，適宜的IMF含量是評價優(yōu)質(zhì)肉的重要指標(biāo)，可以更好地反映其風(fēng)味、嫩度、多汁性等肉質(zhì)性能[1- 3]。肌內(nèi)脂肪的生成受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等因素影響，探究其沉積規(guī)律和調(diào)控機制對改善肉質(zhì)性狀具有積極意義?！厩叭搜芯窟M展】過氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorgamma, PPARγ）是核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，具有調(diào)節(jié)脂肪形成、糖脂代謝和細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能[4]。脂肪分化受眾多轉(zhuǎn)錄因子共同作用，是精密復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)調(diào)控過程，其中PPARγ基因是重要的核心調(diào)控因子。PPARγ還是介導(dǎo)與脂肪酸合成、轉(zhuǎn)運、代謝相關(guān)基因發(fā)揮作用的媒介，是脂肪生成過程中信號傳遞的紐帶[5]。LEFTEROVA等[6]研究表明在缺失PPARγ時，任何誘導(dǎo)條件都不能再激發(fā)成脂分化的進程。FARMER[7]研究表明脂肪分化必須要有PPARγ的參與。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族成員之一，在脂肪細(xì)胞分化、發(fā)育過程中起著決定性作用，并可激活眾多脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時促進細(xì)胞中脂肪的累積[8-9]。脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)的基因含有C/EBPα的結(jié)合位點，若此類基因調(diào)控區(qū)內(nèi)的CCAAT重復(fù)序列發(fā)生突變就不能誘導(dǎo)基因表達(dá)[10]。C/EBPα與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1啟動子區(qū)域結(jié)合從而促進其表達(dá)，進而促進脂肪沉積相關(guān)基因的表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c】在脂肪分化過程中各轉(zhuǎn)錄因子的作用時間和方式不同，但最終匯集到PPARγ、C/EBPα上，兩者共同作用，開啟一系列脂肪特異性基因的表達(dá)，從而生成并儲存長鏈脂肪酸[11]。因此，其可作為研究脂肪分化及沉積的關(guān)鍵候選基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測PPARγ和C/EBPα基因在江口蘿卜豬、從江香豬和大白豬不同時期、不同組織中的表達(dá)變化規(guī)律，并結(jié)合屠宰試驗進行PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析，旨在探討不同豬種中兩者的表達(dá)規(guī)律及其對脂肪沉積的影響，為進一步改善肉質(zhì)性狀提供數(shù)據(jù)參考，同時為科學(xué)合理利用優(yōu)良地方豬種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本試驗于2015年5—10月在貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室進行。

1.2 試驗動物

采用江口蘿卜豬、從江香豬和大白豬3個豬品種作為試驗材料，每個品種在3—7月齡各選6頭，屠宰后采集心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌和皮下脂肪放入裝有RNA保存液的凍存管中，之后置于-80℃保存，用于提取組織RNA；取部分背最長肌保存于-20℃，用于測定肌內(nèi)脂肪含量。

1.3 IMF含量的測定

充分烘干后的肉樣經(jīng)粉碎后，采用索氏抽提法測定肌內(nèi)脂肪含量。每個樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)計算公式：IMF=（提前總重 - 提后總重）/提前樣品干物質(zhì)總重×100，取平均值作為樣品的IMF含量。

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中豬PPARγ、C/EBPα基因的mRNA序列（登錄號分別為：NM_214379；NC_010448）中的編碼區(qū)設(shè)計引物，選用β-actin基因作為內(nèi)參基因。利用NCBI中的 Primer-BLAST設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

1.5 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取組織樣總RNA，超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度（OD260/OD280=1.8—2.0），1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果。使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）進行反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL。反應(yīng)條件為：25℃孵育10 min，42℃孵育30 min，85℃加熱5 s。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-20℃保存。

1.6 熒光實時定量PCR

采用SYBR Green I熒光染料法在熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量。反應(yīng)體系為20 μL：2×UltraSYBR Mixture（With ROX）10 μL，目的基因上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，無RNA酶去離子水8.4 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s；退火30 s（退火溫度見表1）；72℃延伸32 s；循環(huán)40次后進行溶解曲線分析：95℃ 10 s，60℃ 15 s，然后以每10 s上升0.5℃的速率從60℃升高到95℃。每個樣品重復(fù)3個。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用2-△△CT方法計算基因?qū)崟r熒光定量PCR的表達(dá)量。試驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。＜0.01表示差異極顯著；＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 豬背最長肌的IMF含量

大白豬、江口蘿卜豬、從江香豬在3—7月齡背最長肌中的肌內(nèi)脂肪含量如圖1所示。3月齡時，3個豬種的肌內(nèi)脂肪含量均較低，隨著月齡的增加逐漸上升，6—7月齡時較高且處于相對穩(wěn)定水平。其中大白豬、江口蘿卜豬、從江香豬的肌內(nèi)脂肪含量在5、6、7月齡均極顯著高于3月齡（＜0.01）；大白豬的肌內(nèi)脂肪含量在4月齡時與5、6、7月齡時差異顯著（＜0.05）。同一月齡不同品種豬的肌內(nèi)脂肪在3月齡時無顯著差異，4月齡時從江香豬顯著高于大白豬（＜0.05），6、7月齡時江口蘿卜豬、從江香豬均顯著高于大白豬（＜0.05）。

同一品種不同月齡間的差異用字母表示，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），無字母或字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）；**表示同月齡不同品種間差異極顯著（P＜0.01），*表示差異顯著（P＜0.05）。表2同

2.2 同一品種不同時期各組織PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)差異

2.2.1 大白豬不同月齡同一組織及同一月齡不同組織間PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)差異 PPARγ基因在大白豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表2、圖2所示。PPARγ在大白豬3—7月齡各組織中均有表達(dá)，其中皮下脂肪的表達(dá)水平最高，其次為肝、小腸，心、脾、肺、腎、背最長肌的表達(dá)水平最低。PPARγ的表達(dá)量隨時間增加呈上升趨勢，各組織在3月齡時表達(dá)水平低，到6、7月齡時較高且維持在一定水平。其中肝中3月齡與5、6、7月齡，脾、肺、腎中3月齡與7月齡，小腸中4月齡與6、7月齡，皮下脂肪中3、4月齡與5月齡PPARγ的表達(dá)量均差異顯著（P＜0.05）；小腸、背最長肌中3月齡與6、7月齡，皮下脂肪中3、4月齡分別與6、7月齡PPARγ的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。PPARγ在大白豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、小腸、皮下脂肪最高。其中4、5月齡的肝與心、脾、肺、腎、背最長肌，6、7月齡的肝、小腸與心、脾、肺、腎中PPARγ的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；3月齡的皮下脂肪與心、脾、肺、腎、背最長肌，4月齡的皮下脂肪與心、脾、肺、腎、小腸、背最長肌，5、6、7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌中PPARγ的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

C/EBPα基因在大白豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表3、圖3所示。大白豬中，C/EBPα在3—7月齡各組織的表達(dá)量亦呈上升趨勢，到6、7月齡較高。其中肝、小腸中3月齡與5月齡，脾中3、4月齡與5、6、7月齡，肺中3月齡與5月齡及4月齡與5、6、7月齡，背最長肌中3、4月齡分別與6、7月齡，皮下脂肪中3月齡與5月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；肝、肺、小腸中3月齡與6、7月齡，皮下脂肪中3、4月齡與6、7月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。C/EBPα在大白豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、肺、小腸、背最長肌、皮下脂肪較高。其中3月齡的肝與心、腎，4、6月齡的肝、肺、小腸與心、腎，5月齡的肝、肺、小腸與心、腎、背最長肌，7月齡的肝、肺、小腸與心、脾、腎中C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；3、4、5月齡的皮下脂肪與心、腎，6月齡的皮下脂肪與心、脾、腎、背最長肌，7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌中C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

表2 大白豬不同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)

同一品種同一組織不同月齡間的差異用字母表示，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），無字母或字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）；**表示同一品種同一月齡不同組織間差異極顯著（P＜0.01），*表示差異顯著（P＜0.05）。下同

表3 大白豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

圖3 大白豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

2.2.2 江口蘿卜豬不同月齡同一組織及同一月齡不同組織間PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)差異 PPARγ基因在江口蘿卜豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表4、圖4所示。江口蘿卜豬中，PPARγ在心、脾、肺、腎、背最長肌的表達(dá)量最低，在皮下脂肪中最高，具有組織特異性。PPARγ的表達(dá)量隨月齡遞增而上升，皮下脂肪的增加幅度最大。其中肝、脾、肺、背最長肌3月齡與6、7月齡，小腸中3、4月齡與7月齡PPARγ的表達(dá)量差異顯著（＜0.05）；皮下脂肪中3、4月齡與5、6、7月齡PPARγ的表達(dá)量差異極顯著（＜0.01）。PPARγ在江口蘿卜豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、小腸、皮下脂肪較高。其中4月齡的肝與心、脾、背最長肌，5、6月齡的肝與心、脾、肺、腎、背最長肌，7月齡的肝、小腸與心、脾、肺、腎中PPARγ的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；3、4月齡的皮下脂肪與心、脾、肺、腎、背最長肌，5、6、7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌中PPARγ的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

表4 江口蘿卜豬不同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)

C/EBPα基因在江口蘿卜豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表5、圖5所示。江口蘿卜豬中，C/EBPα的表達(dá)量隨時間增加呈逐漸上升趨勢。其中心3月齡與6、7月齡，肝中3、4月齡分別與5、6、7月齡，脾中3月齡與7月齡，肺中4月齡與6、7月齡，腎中3月齡與6、7月齡，背最長肌中3、4月齡分別與6、7月齡，皮下脂肪中5月齡與7月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；肺中3月齡與5、6、7月齡，小腸、皮下脂肪中3、4月齡與6、7月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。C/EBPα在江口蘿卜豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、小腸、背最長肌、皮下脂肪較高。其中3、4月齡的小腸與腎，5、6月齡的肝、肺、小腸與心、脾、腎，7月齡的肝、肺與心、腎中C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；3、4月齡的皮下脂肪與心、腎、背最長肌，5、6月齡的皮下脂肪與心、脾、腎、背最長肌，7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌及小腸與心、腎中C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

圖4 江口蘿卜豬不同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)

表5 江口蘿卜豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

圖5 江口蘿卜豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

2.2.3 從江香豬不同月齡同一組織及同一月齡不同組織間PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)差異 PPARγ基因在從江香豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表6、圖6所示。從江香豬中，PPARγ在心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌的表達(dá)量較低，且隨月齡增加而上升的幅度較小，在皮下脂肪的表達(dá)量最高。其中肝3月齡與5、6、7月齡，小腸中3月齡與5、6月齡，背最長肌中3、4月齡與6、7月齡，皮下脂肪中5月齡與7月齡PPARγ的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；小腸中3月齡與7月齡，皮下脂肪中3、4月齡與5、6、7月齡PPARγ的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。PPARγ在從江香豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、小腸、皮下脂肪較高。其中3月齡的皮下脂肪與心、脾、肺、腎、背最長肌，5、7月齡的肝、小腸與心、脾、肺、腎，6月齡的肝與心、脾、肺、腎中PPARγ的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；4月齡的皮下脂肪與心、脾、肺、腎、背最長肌，5、6、7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌中PPARγ的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

表6 從江香豬不同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)

圖6 從江香豬不同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)

C/EBPα基因在從江香豬不同時期各組織間的表達(dá)水平如表7、圖7所示。C/EBPα在從江香豬肝、肺、小腸、皮下脂肪中的表達(dá)量較高，各組織中的表達(dá)量隨時間增加而上升。其中心3月齡與6、7月齡，肝中3、4月齡與5、6、7月齡及5月齡與6、7月齡，脾中3、4月齡與7月齡，肺中4、5月齡與6、7月齡，腎中3月齡與6月齡，小腸、皮下脂肪中5月齡與6、7月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；肺中3月齡與6、7月齡，小腸、皮下脂肪中3、4月齡與6、7月齡，背最長肌中3、4月齡與7月齡C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。C/EBPα在從江香豬同一時期各組織間的表達(dá)量為肝、肺、小腸、背最長肌、皮下脂肪較高。其中3月齡的肝、小腸、皮下脂肪與心、腎，4月齡的肝、肺、小腸與脾、腎，5月齡的肝、肺、小腸與心、腎，6月齡的肝、肺、小腸與心、脾、腎、背最長肌中C/EBPα的表達(dá)量均差異顯著（＜0.05）；4月齡的皮下脂肪與心、脾、腎，5、6月齡的皮下脂肪與心、脾、腎、背最長肌，7月齡的皮下脂肪與心、肝、脾、肺、腎、背最長肌及肝、肺、小腸與心、脾、腎中C/EBPα的表達(dá)量均差異極顯著（＜0.01）。

表7 從江香豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

圖7 從江香豬不同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)

2.3 不同品種相同時期各組織PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)差異

2.3.1 不同品種相同時期各組織C/EBPα基因的表達(dá)差異 3月齡時，C/EBPα在肝、小腸、皮下脂肪中的表達(dá)量分別是江口蘿卜豬與從江香豬、大白豬與從江香豬、大白豬與江口蘿卜豬之間差異顯著（＜0.05）；4月齡時，C/EBPα在小腸、皮下脂肪中的表達(dá)量分別是大白豬與從江香豬及大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；5月齡時，C/EBPα在肝、小腸中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬及皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；6月齡時，C/EBPα在肝、皮下脂肪中的表達(dá)量分別是大白豬與從江香豬、大白豬與江口蘿卜豬及小腸中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；7月齡時，C/EBPα在肝、小腸中的表達(dá)量是大白豬與從江香豬及皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬、江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）。

2.3.2 不同品種相同時期各組織PPARγ基因的表達(dá)差異 3月齡時，PPARγ在肝中的表達(dá)量是大白豬與從江香豬及小腸、皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬之間差異顯著（＜0.05）；4月齡時，PPARγ在肝、皮下脂肪中的表達(dá)量分別是大白豬與江口蘿卜豬、大白豬與從江香豬及小腸中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；5月齡時，PPARγ在小腸中的表達(dá)量是大白豬與從江香豬及皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；6月齡時，PPARγ在皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）；7月齡時，PPARγ在肝中的表達(dá)量是大白豬與江口蘿卜豬及皮下脂肪中的表達(dá)量是大白豬、江口蘿卜豬、從江香豬之間差異顯著（＜0.05）。

2.4 豬PPARγ、C/EBPα基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性

對不同品種豬PPARγ、C/EBPα基因表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)分析表明，PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，其中在4—6月齡時呈強度正相關(guān)。大白豬PPARγ、C/EBPα的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪呈顯著相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.564、0.621；江口蘿卜豬、從江香豬PPARγ的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪呈顯著相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.604、0.586；江口蘿卜豬、從江香豬C/EBPα的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪呈極顯著相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)r分別為0.718、0.764；PPARγ 基因的表達(dá)量在三個豬品種中的決定系數(shù)2約為 0.3，說明其表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪有一定的線性關(guān)系，C/EBPα基因的表達(dá)量在江口蘿卜豬、從江香豬中的決定系數(shù)約為0.5，說明其表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪有較強的線性關(guān)系（表8）。

表8 PPARγ、C/EBPα基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性分析

**表示差異極顯著（＜0.01），*表示差異顯著（＜0.05） **indicates extreme differences (＜0.01), *indicates significant differences (＜0.05)

3 討論

肌內(nèi)脂肪沉積的多少直接影響豬的肉質(zhì)性狀及其經(jīng)濟價值，在過去幾十年世界各國對豬的遺傳改良主要集中在提高生長速度、飼料利用率和瘦肉率等方面，并且取得了豐碩的科研成果。但另一方面卻嚴(yán)重影響了豬肉品質(zhì)，其感官性質(zhì)、營養(yǎng)價值及可食用性均出現(xiàn)急劇下降。近年來，豬脂肪沉積及其調(diào)控成為研究者關(guān)注的熱點，致力于改善商品豬的肉質(zhì)性能[12-14]。不同品種豬的脂肪沉積能力存在差異，江口蘿卜豬和從江香豬屬于脂肪型豬種，其肉質(zhì)細(xì)嫩多汁、香味濃郁，作為貴州寶貴的地方優(yōu)良品種素有“一家煮肉四鄰香”之美譽；大白豬屬于典型的瘦肉型豬種，具有生長快、瘦肉率高等特點[15-18]。利用不同類型豬種進行脂肪細(xì)胞分化因子間表達(dá)差異研究對了解脂肪沉積變化規(guī)律具有重要意義[19-20]。脂肪分化過程中依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用時間可分為兩類：在脂肪分化早期，被成脂激素激活的轉(zhuǎn)錄因子為第一大類，主要包括環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、早期生長反應(yīng)蛋白（Krox20）、鋅指蛋白（KLFs）等；在脂肪分化晚期，可以直接上調(diào)脂質(zhì)生成相關(guān)基因表達(dá)，促進成熟脂肪細(xì)胞形成的轉(zhuǎn)錄因子為第二大類，主要包括PPARγ、C/EBPα、SREBP-1（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1）等。其中PPARγ、C/EBPα是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可直接或間接介導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控脂肪分化作用[21-23]。姜俊芳等[24]研究表明PPARγ基因的表達(dá)與脂肪沉積率呈正相關(guān)；郝稱莉等[25]對湖羊肌肉組織中PPARγ的表達(dá)情況及與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性進行研究結(jié)果表明PPARγ基因可能對肌內(nèi)脂肪的沉積產(chǎn)生一定的影響。C/EBPα基因在脂肪細(xì)胞分化、發(fā)育過程中起著決定性作用，可以直接刺激脂肪生成基因的表達(dá)，其能與脂肪細(xì)胞中特異性表達(dá)基因（如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）-4基因、瘦蛋白（leptin）基因和胰島素受體基因等）的調(diào)控區(qū)域結(jié)合從而啟動這些基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄[26-27]。因此，PPARγ、C/EBPα基因可作為影響肌內(nèi)脂肪含量的主效基因。本試驗進行了三個豬品種在不同生長階段PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)水平分析，以及其表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析，探討PPARγ、C/EBPα基因?qū)?nèi)脂肪的作用機理。研究結(jié)果表明PPARγ、C/EBPα基因在大白豬、江口蘿卜豬、從江香豬各組織中均表達(dá)并且存在顯著性差異，在心、脾、腎中的表達(dá)量最低，肝、肺、小腸、背最長肌中表達(dá)量較高，皮下脂肪中的表達(dá)量最高，具有較高的組織特異性；不同月齡中，其基因的表達(dá)量隨著月齡增加總體呈上升趨勢，在3月齡時表達(dá)量較低，到6、7月齡時較高且保持相對穩(wěn)定水平。不同品種間PPARγ、C/EBPα在相同月齡各組織中的表達(dá)量存在差異，總體上大白豬中肝、小腸、皮下脂肪中兩個基因的表達(dá)量分別與江口蘿卜豬、從江香豬差異顯著。這可能是瘦肉型豬與脂肪型豬中其基因的表達(dá)量間存在差別。PPARγ、C/EBPα基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，在4—6月齡時呈強度相關(guān)，這時間段正是豬體中脂肪沉積的關(guān)鍵時期，說明PPARγ、C/EBPα可能對肌內(nèi)脂肪的沉積有一定的積極作用，但具體的調(diào)控機理還需進一步深入的研究。本研究僅在轉(zhuǎn)錄水平上探討了PPARγ、C/EBPα基因的發(fā)育性變化對IMF含量的影響，后期將會在蛋白質(zhì)水平上對其進行更全面的研究。

4 結(jié)論

同一品種各組織中PPARγ、C/EBPα的表達(dá)及肌內(nèi)脂肪含量的變化規(guī)律基本相同，即隨著月齡的增加而逐漸上升，到生長后期維持一個相對穩(wěn)定水平。同一品種同一時期各組織間PPARγ、C/EBPα的表達(dá)量不同，總體上皮下脂肪的表達(dá)量最高，其次肝、肺、小腸、背最長肌中較高，心、脾、腎中的表達(dá)量最低。不同品種同一時期各組織間PPARγ、C/EBPα的表達(dá)量存在差異，總體上江口蘿卜豬、從江香豬高于大白豬。PPARγ、C/EBPα的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，在4—6月齡時呈強度相關(guān)。豬PPARγ、C/EBPα基因在調(diào)控脂質(zhì)代謝及脂肪沉積方面發(fā)揮一定作用，可進一步更深入研究其調(diào)控機理。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Association of the PPARγ and C/EBPα Gene Expression with Intramuscular Fat Content in Different Varieties of Pig

PAN DaoXing1, WANG Zhen1, YANG MaoLin2, LIAO QiaoPing3, YANG ChangPing3, WU YuPing3, WANG JinZhou1, LIU RuoYu1

(1College of Animal Sciences, Guizhou University/ Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region(Guizhou University), Ministry of Education, Guiyang 550025;2Science and Technology Bureau of Jiangkou County, Tongren 554400, Guizhou;3Animal Husbandry Bureau of Jiangkou County, Tongren 554400, Guizhou)

【Objective】The objectives of this study were to investigate the developmental changes of the PPARγ and C/EBPα mRNA expression level in different tissues, months and breeds, and its effect on intramuscular fat accumulation in pig. 【Method】Jiangkou Luobo Pig, Congjiang Xiang Pig and Large White Pig were slaughtered at 3, 4, 5, 6, and 7 months to collect samples from heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine, longissimus dorsi, and subcutaneous adipose for the purpose of determing the IMF content in longissimus dorsi and extracting total RNA in order to investigate the developmental changes of the PPARγ and C/EBPα expression by real - time PCR.【Result】By real-time PCR, PPARγ and C/EBPα had the mRNA expression in all tissues of Large White Pig at 3, 4, 5, 6, and 7 months, but highly in liver, small intestine, longissimus dorsi, subcutaneous adipose, lowly in heart, spleen, lung, and kidney. The expression levels of PPARγ in the small intestine, longissimus dorsi, and subcutaneous adipose at 3, 4 months were extremely different with that at 6 and 7 months (＜0.01). The expression levels of C/EBPα in the liver, lung, small intestine, and subcutaneous adipose at 3 month was extremly different with that at 6 and 7 months (＜0.01); The mRNA expression of PPARγ and C/EBPα were lower in heart, spleen, lung, kidney, and longissimus dorsi of Jiangkou Luobo Pig, higher in subcutaneous adipose withissue-specificity. The expression amount increased with the age, and the increase of subcutaneous fat was the most. The expression levels of PPARγ in the small intestine, longissimus dorsi, and subcutaneous adipose at 3 and 4 months also were extremely different with that at 6 and 7 months (＜0.01). The expression levels of C/EBPα in the small intestine, subcutaneous adipose at 3 month were extremely different with that at 5, 6, and 7 months (＜0.01). The mRNA expression of PPARγ and C/EBPα in the subcutaneous adipose of Congjiang Xiang Pig was the highest. The expression of PPARγ was not significantly increased with the age. The expression of C/EBPα was significantly increased with the age. The expression levels of PPARγ and C/EBPα in the small intestine, longissimus dorsi, and subcutaneous adipose at 3, 4 months were different with that at 6 and 7 months (＜0.05). With growing, the mRNA expression levels of PPARγ and C/EBPα were basically the same in the model, and showed an increasing trend, then maintained the higher expression levels in 6 and 7 months. The mRNA expression levels of PPARγ and C/EBPα were gradually increased with the increase of the age and maintained a relatively stable level at the late growth stage. The expression of PPARγ and C/EBPα was the highest in subcutaneous adipose, the higher in liver, lung, small intestine, and the lowest in heart, spleen, and kidney. The PPARγ and C/EBPα mRNA expression in different tissues of Jiangkou Luobo Pig, Congjiang Xiang Pig were higher than that of Large White Pig. The correlation of gene expression and IMF content showed that the PPARγ and C/EBPα expression level were positively related to IMF content. 【Conclusion】It was inferred that PPARγ and C/EBPα gene may be related to regulatory mechanism of lipid metabolism and fat deposition.

pig; PPARγ; C/EBPα; gene expression; intramuscular fat

2015-11-24；接受日期：2016-10-26

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合NY【2014】3045號）、國家科技富民強縣專項行動計劃項目（黔科合縣市科技計劃(2012) 7024號）、貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（研農(nóng)2015026）

盤道興，E-mail：pandaoxing1989@163.com。通信作者劉若余，E-mail：liury04@163.com