塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌分離鑒定、系統(tǒng)發(fā)育與促生特性

李艷星，郭平毅，孫建光

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塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌分離鑒定、系統(tǒng)發(fā)育與促生特性

李艷星1,2，郭平毅1，孫建光2

（1山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801；2中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京100081）

【目的】分離鑒定塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌，研究塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育，分析測定塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的促生特性，探討塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的種群特點及其隨寄主植物的分布特征。【方法】表面消毒塊根塊莖樣品后采用低氮培養(yǎng)法分離內(nèi)生細菌；通過對菌株的PCR擴增、測序確認分離細菌是固氮菌；通過16S rRNA基因測序、比對初步鑒定菌株，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育；通過測定菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶、植物激素IAA，拮抗病原真菌研究菌株的促生特性?！窘Y果】從胡蘿卜、白蘿卜、馬鈴薯、紫甘藍、山藥、蓮藕、芋頭、紅薯、生姜、甜菜等14個塊根塊莖類作物的塊根、塊莖中共分離到內(nèi)生固氮菌219株?；?6S rRNA序列，這些菌株在系統(tǒng)發(fā)育上分別屬于、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、，共計24屬79種，顯示了塊根塊莖內(nèi)生固氮菌豐富的種群多樣性。鑒定結果顯示，219株新分離菌株中有77株系統(tǒng)發(fā)育地位屬于屬的23個種，29株屬于屬的10個種，二者合計為33種106株，分別占系統(tǒng)發(fā)育種數(shù)和新分離菌株數(shù)的41.77%和48.40％，說明和屬是新分離塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的優(yōu)勢種群。從219株新分離菌株中選取了79株代表菌株進行促生特性研究，結果顯示8.86%菌株檢測到了ACC脫氨酶活性（0.026—13.76 μmol-丁酮酸·mg-1蛋白·h-1），64.56%菌株檢測到了產(chǎn)IAA（0.34—28.99 μg·mL-1），6.33%—13.92%菌株具有拮抗病原真菌能力（抑菌率41%—63%）?！窘Y論】在正常生長的塊根塊莖類作物的塊根塊莖內(nèi)棲息著大量內(nèi)生固氮菌；塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌在科學分類地位上分布廣泛，達到24屬79種，顯示出巨大的生物多樣性；和是塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌優(yōu)勢種群；大約10%—60%的塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌顯示出產(chǎn)生ACC脫氨酶、產(chǎn)生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促進植物生長特性，這可能是內(nèi)生固氮菌有益于植物生長的內(nèi)在原因。

塊根塊莖；內(nèi)生固氮菌；系統(tǒng)發(fā)育；促生特性

0 引言

【研究意義】胡蘿卜、白蘿卜、紫甘藍、馬鈴薯、山藥、蓮藕、芋頭、紅薯、生姜、甜菜等都是常見食才（甜菜是生產(chǎn)蔗糖原料），作為蔬菜、雜糧或調(diào)味品，在人們的日常生活中起著不可或缺的重要作用。從植物學的角度，它們有一個共同特征，都是塊根塊莖類作物（紫甘藍為球莖），而且塊根塊莖正是人們?nèi)∈车牟糠?。研究塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌對于加強人們對該類作物的了解，獲得固氮菌資源，提高栽培技術，生產(chǎn)安全優(yōu)質產(chǎn)品具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物內(nèi)生菌（endophytic bactcria）指從經(jīng)過表面消毒的植物組織器官或植物體內(nèi)分離出來的對植物本身有益無害的細菌[1]。現(xiàn)在這個概念有了一些擴大，認為植物內(nèi)生菌泛指生活史或某個生命階段生活在健康植物體內(nèi)，不引起宿主植物外在病癥的細菌、真菌或放線菌[2]，但不包括在植物體內(nèi)定殖，引起寄生植物病害的致病菌，也不包括菌根真菌[3]。植物內(nèi)生固氮菌（endophytic diazotrophs）是植物內(nèi)生菌中的一個主要類群，它們不僅具有固氮作用，還有促進植物生長，提高植物抗病、抗逆等多種功能[4]。目前，人們在水稻[5]、玉米[6]、小麥[7]、甘蔗[8]等作物上都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生固氮菌，對于馬鈴薯內(nèi)生固氮菌的研究也有報道[9-10]，但對于其他塊根塊莖類作物的內(nèi)生固氮菌了解尚少?！颈狙芯壳腥朦c】通過農(nóng)田采集和市場采購兩種方式收集塊根塊莖類作物的塊根塊莖樣品，批量分離、鑒定內(nèi)生固氮菌，研究塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育、促生特性，并探討塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的種群特點及其隨寄主植物的分布特征?！緮M解決的關鍵問題】明確塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育、種群特點、分布特征、促生特性。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在中國農(nóng)業(yè)科學院完成。

1.1 樣品、試劑、培養(yǎng)基

試驗共用到塊根塊莖類作物樣品14份，包括胡蘿卜、白蘿卜、馬鈴薯、紫甘藍、山藥、蓮藕、芋頭、紅薯、生姜、甜菜等。其中5份樣品采自農(nóng)田，9份樣品購自北京蔬菜市場。樣品主要為處于成熟期的作物塊根塊莖。樣品信息詳見表1。

病原真菌靶標菌株擬枝鐮孢（）ACCC37402和尖鐮孢（）ACCC37438由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所鄧暉提供，尖鐮孢MLS1由筆者實驗室提供。試劑主要購自北京化學試劑公司和Sigma公司。

多碳源低氮培養(yǎng)基（CCM）[11]：溶液Ⅰ：KH2PO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.8 g，Na2Fe EDTA 28 mg，鉬酸鈉25 mg，酵母浸膏100 mg，甘露醇5 g，蔗糖5 g，乳酸鈉0.5 mL，蒸餾水900 mL。溶液Ⅱ：MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.06 g，蒸餾水100 mL。將溶液Ⅰ、Ⅱ分別滅菌，冷卻至50℃左右混合，加入生物素（5 μg·L-1）和維生素（10 μg·L-1）各0.5 mL。無氮培養(yǎng)基[12]：蔗糖10 g，NaCl 0.12 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，CaCO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 L，pH 7.2。LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2 內(nèi)生固氮菌分離

采用上述多碳源低氮培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基，將植物塊根塊莖樣品表面消毒后，切取內(nèi)部組織塊進行分離培養(yǎng)內(nèi)生細菌，方法參考文獻[13]。

1.3 菌株16S rRNA序列測定與初步鑒定

細菌分離物16S rRNA基因擴增方法同文獻[14]，序列測定委托北京博邁德生物技術公司完成，基于16S rRNA基因序列的初步鑒定采用EzTaxon和NCBI數(shù)據(jù)庫在線比對完成。

1.4 菌株基因檢測與序列測定

菌株固氮酶基因擴增方法同文獻[15]，序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.5 內(nèi)生固氮菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在上述16S rRNA基因序列測定和基因檢測的基礎上，采用Mega軟件分析塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育[16]。

1.6 菌株促生特性

測定菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶（1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid (ACC) deaminase）、產(chǎn)生植物激素IAA（indole acetic acid）以及拮抗病原真菌的能力。

ACC脫氨酶、IAA以及拮抗病原真菌測定方法同前述[7,15,17]。拮抗病原真菌定義抑制率（%）=（對照半徑r0-對峙培養(yǎng)病原真菌菌落半徑r1）／對照半徑r0×100。

2 結果

2.1 塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌分離、基因檢測及基于16S rRNA基因序列鑒定

從14個塊根塊莖類作物樣品的塊根、塊莖中共分離到內(nèi)生細菌219株，全部菌株檢測到了固氮酶基因，從而確認這些細菌是固氮菌。經(jīng)過16S rRNA基因序列分析比對初步確定了菌株的分類地位。新分離菌株的編號、來源及其最大相似性模式種如表1所示。

2.2 塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因序列比對結果顯示，分離到的219株塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌與已知模式種的最大相似性均在98%以上（42號菌株為97.70%），說明新分離內(nèi)生固氮菌的科學分類地位比較明確。按照16S rRNA基因序列相似性，219株塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于24屬79種。這24屬分別為、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。

以79株最大相似性模式種作為代表菌株進行的系統(tǒng)發(fā)育分析結果如圖1所示。總的來看，新分離的219株塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌在系統(tǒng)發(fā)育關系上可以分為5群：第1群包括7個屬，分別是（其中包含23個種代表77菌株）、（其中包含1個種代表17菌株）、（其中包含4個種代表17菌株）、（其中包含5個種代表6菌株）、（其中包含3個種代表5菌株）、（其中包含1個種代表1菌株）、（其中包含1個種代表1菌株），共計38個種，代表124菌株，分別占分類地位種數(shù)和新分離菌株總數(shù)的48.10%和56.62%。第2群包括3個屬，（其中包含2個種代表2菌株）、（其中包含5個種代表11菌株）、（其中包含1個種代表1菌株），共計8個種，代表14菌株，分別占分類地位種數(shù)和新分離菌株總數(shù)的10.13%和6.39%。第3群只有1個屬，包括3個種，代表5菌株，分別占分類地位種數(shù)和新分離菌株總數(shù)的3.80%和2.28%。第4群包括10個屬，（其中包含10個種代表29菌株）、（其中包含1個種代表4菌株）、（其中包含1個種代表1菌株）、（其中包含1個種代表1菌株）、（其中包含1個種代表3菌株）、（其中包含1個種代表4菌株）、（其中包含1個種代表2菌株）、（其中包含4個種代表10菌株）、（其中包含1個種代表1菌株）、（其中包含4個種代表11菌株），共計25個種，代表66菌株，分別占分類地位種數(shù)和新分離菌株總數(shù)的31.65%和30.14%。第5群包括3個屬，（其中包含2個種代表3菌株）、（其中包含1個種代表1菌株）、（其中包含2個種代表6菌株），共計5個種，代表10菌株，分別占分類地位種數(shù)和新分離菌株總數(shù)的6.33%和4.57%。

圖中種名后括號中的數(shù)字表示新分離菌株在分類地位上屬于該種的菌株數(shù)

表1 新分離內(nèi)生固氮菌及其促生特性

aACC脫氨酶ACC: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase activity (μmol-ketobutyrate·mg-1protein·h-1)；b吲哚乙酸 IAA: indole acetic acid production (μg·mL-1)；c拮抗病原真菌Antagonism: MLS1=MLS1; 37402=ACCC 37402; 37438=ACCC 37438

表2 新分離內(nèi)生固氮菌隨寄主植物分布特點

屬名后括號中的數(shù)字表示該屬的種數(shù)The number in the parentheses behind the genus name meant the number of species including in this genus

2.3 塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的分類地位及其隨寄主植物分布特點

列表分析了新分離的219株塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌的分類地位及其隨寄主植物的分布（表2），發(fā)現(xiàn)如下特點：（1）從菌株分類地位來看，屬菌株最多，有77株，占分離菌株總數(shù)的35.16%；屬居第2位，有29株，占分離菌株總數(shù)的13.24%；二者合計有106株，占新分離菌株總數(shù)的48.40%；（2）包含新分離菌株較多的屬和，也是包含細菌種數(shù)較多的屬，如芽孢桿菌屬（）包括23個種，分別是、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、；假單胞菌屬（）包括10個種，分別是、；這在一定程度上證明了新分離菌株在分類地位上的廣泛性和對寄主植物的代表性；（3）新分離塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌在寄主植物的分布上具有廣泛性，如分類地位屬于的77菌株分布在除蓮藕之外的其他13個樣品中，分類地位屬于的29菌株分布在除鐵棍山藥、紅薯、紅皮圓蘿卜之外的其他11個樣品中，分布相對均勻；（4）從寄主植物來看，分離到菌株最多的是665號樣品甜菜，分離到37菌株，占新分離菌株總數(shù)的16.89%，在分類地位是分屬于12屬21種，分布廣泛；分離到菌株最少的樣品是紅薯，只有4株菌。

2.4 菌株的促生特性

由于分離到的塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌共計219株，全部測定工作量較大，因此選取了79株代表菌株進行了促生特性研究（表1）。結果顯示，其中有7株菌檢測到了ACC脫氨酶活性，占被測菌株的8.86%，ACC脫氨酶活性為0.026—13.76 μmol-丁酮酸·mg-1蛋白·h-1。51株菌檢測到了產(chǎn)IAA，占被測菌株的64.56%，檢測到的IAA濃度為0.34—28.99 μg·mL-1。

拮抗試驗顯示有11株菌拮抗病原真菌MLS1，抑菌率為41%—63%；6株菌拮抗病原真菌ACCC37402，抑菌率為48%—59%；5株菌拮抗病原真菌ACCC37438，抑菌率為49%—55%。合計有5—11株菌對靶標真菌具有抑制作用，占被測菌株的6.33%—13.92%。菌株651gz03、651gz08、654bzr02、662bzr12和660bzr10 同時對3株靶標真菌具有抑制作用，有較好的應用前景。

2.5 新分離塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌與文獻報道其他植物內(nèi)生固氮菌的比較

筆者嘗試對照前人的工作，在種水平上分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位與寄主植物的關系。將219株新分離塊根塊莖內(nèi)生固氮菌所屬的79種列表，統(tǒng)計每種所含菌株數(shù)，就會發(fā)現(xiàn)除了、、、4個種所含菌株數(shù)相對較多，合計53株，占新分離菌株總數(shù)24.20%之外，其他75種代表了166株新分離菌株，平均每種代表2.2株。這些結果顯示了塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌極其豐富的種群多樣性（表3）[18-20]。

表3 新分離塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌與文獻報道其他植物內(nèi)生固氮菌的比較

a本文工作，表中數(shù)字表示新分離到的分類地位屬于該種的菌株數(shù)This work. The number in table meant the number of newly isolated strains which belonged to this species；b文獻數(shù)據(jù)。表中“+”號表示該種有過內(nèi)生固氮菌報道，括號中數(shù)字為參考文獻編號Data from references. “+” meant this species had been reported as endophytic diazotroph. The number in parenthese meant corresponding reference

3 討論

盡管地球上幾乎所有的植物都有內(nèi)生細菌棲息其中[21]，但當試驗結果展示出豐富多樣的微生物種群時，我們?nèi)匀粸閴K根塊莖類作物具有的內(nèi)生固氮菌多樣性感到驚奇。

本研究從14個塊根塊莖樣品分離到的219株內(nèi)生固氮菌在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于24個屬79個種，從目前檢索到的文獻資料來看，如此豐富的種群多樣性在以往報道過的植物內(nèi)生固氮菌中未曾有過。以上述79種為參照菌群，查閱文獻結果顯示，雖然關于植物內(nèi)生固氮菌的研究報道很多，但只有很少文獻能夠與此對應，只找到18種與之相同的種群有過作為植物內(nèi)生固氮菌的記載。此外，一些研究較多的植物內(nèi)生固氮菌，如[22]、[23]、[24-25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]都沒有出現(xiàn)在表3中。原因可能有下列幾個方面：一是作為作物內(nèi)生固氮菌資源研究，這些工作已經(jīng)處于研究領域的前沿，研究報道相對較少；二是塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌存在自身的種群特異性，在其他植物內(nèi)生固氮菌中沒有出現(xiàn)；三是研究方法的差異導致結果不同，如基于微生物培養(yǎng)技術的研究方法得到的信息只能是樣品中真實微生物組成的一小部分。但是，即使考慮到所有這些因素，試驗結果仍然顯示了塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌具有獨有的種群特異性。

本文共用到塊根塊莖樣品14個，涉及胡蘿卜、白蘿卜、馬鈴薯、紫甘藍、山藥、蓮藕、芋頭、紅薯、生姜、甜菜10種作物。其中5份樣品采自農(nóng)田，9份樣品采自蔬菜市場。但無論來自農(nóng)田的新鮮樣品，還是來自蔬菜市場的貯存樣品，每個樣品都分離到了內(nèi)生固氮菌，從4株到37株不等（表2）。分離菌株最少的是紅薯，得到4株菌，分類地位分別為、、、。這些結果說明，正常生長的作物塊根塊莖中普遍存在大量固氮細菌。另一方面，由于上述作物塊根塊莖是人們食用多年的常見食材，這從側面印證了內(nèi)生固氮菌對于人畜的安全性。

另一個值得討論的結果是內(nèi)生固氮菌的促生特性。廣義的微生物對植物的促生特性定義不嚴格，包含內(nèi)容較多，比如提供營養(yǎng)（固氮、溶磷、解鉀、礦化有機質等），促進生長（分泌植物激素IAA[31]等），抑制病害（拮抗病原真菌，營造微生態(tài)環(huán)境等），提高抗逆（產(chǎn)生ACC脫氨酶[32]，緩解脅迫[33]，抗寒抗旱抗?jié)车龋┑?。本研究新分離菌株中8.86%菌株檢測到了ACC脫氨酶活性，64.56%菌株檢測到產(chǎn)植物激素IAA，6.33%—13.92%菌株拮抗病原真菌，這些結果表明作物內(nèi)生固氮菌中具有促生特性的菌株比例遠高于其他環(huán)境。特別是菌株651gz03、651gz08、654bzr02、662bzr12和660bzr10同時抑制3株靶標真菌，值得進一步開發(fā)研究。

4 結論

在正常生長的塊根塊莖類作物的塊根塊莖內(nèi)棲息著大量內(nèi)生固氮菌；塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌在科學分類地位上分布廣泛，達到24屬79種，顯示出巨大的生物多樣性；和是塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌優(yōu)勢種群；大約10%—60%的塊根塊莖類作物內(nèi)生固氮菌顯示出產(chǎn)生ACC脫氨酶、產(chǎn)生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促進植物生長特性，這可能是內(nèi)生固氮菌有益于植物生長的內(nèi)在原因。

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三星期以后，這個人躺在捕鯨船“白德福號”的一個鋪位上，眼淚順著他的削瘦的面頰往下淌，他說出他是誰和他經(jīng)過的一切。同時，他又含含糊糊地、不連貫地談到了他的母親，談到了陽光燦爛的南加利福尼亞，以及桔樹和花叢中的他的家園。

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（責任編輯 岳梅）

Isolation, identification, phylogeny and Growth Promoting Characteristics of endophytic diazotrophs from tuber and root crops

LI YanXing1,2, GUO PingYi1, SUN JianGuang2

(1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Microbial Resources, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【Objective】The objectives of this study are to isolate, identify and analyze phylogenetics of endophytic diazotrophs from tuber and root crops, test plant growth promoting (PGP) characteristics of the isolates, and to explore population property and host distributions of endophytic diazotrophs from tuber and root crops. 【Method】Surface sterilization and low nitrogen medium were used to isolate endophytic diazotrophs.detection based on PCR amplification to confirm isolates as nitrogen-fixing bacteria. 16S rRNA was amplified with PCR, blasted in EzTaxon after sequencing, and analyzed with Clustalx-MEGA to make phylogenetic tree. PGP characteristics were evaluated by testing 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase activity, indole acetic acid (IAA) production and antagonism tospp. 【Result】Total 219 endophytic bacterial isolates were obtained from 14 tuber and root samples including radish, carrot, potato, ginger, beet, lotus, yam, taro, cabbage, and sweet potato. All isolates were verified as nitrogen-fixing bacteria afterinspection and identified as 79 species of 24 genera based on 16S rRNA. The 79 species are,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,This result showed the biodiversity of endophytic diazotrophs from tuber and root crops. Of the 219 endophytic diazotrophs, 77 strains are identified as 23 species of, and 29 strains are identified as 10 species of. This makes up 106 strains of 33 species, in percentages of 48.40% and 41.77% of the 219 endophytic diazotrophs and 79 identified species. Indicating thatandare dominant populations of endophytic diazotrophs from tuber and root crops. Conducted with 79 representatives of the 219 strains, PGP test showed that 8.86% strains showed ACC deaminase activity ranging from 0.026 to 13.76 μmol-ketobutyrate·mg-1protein·h-1, 64.56% strains showed IAA production ranging from 0.34 to 28.99 μg·mL-1, and 6.33%-13.92% strains showed antagonistic against phytopathogenACCC37402,MLS1 andACCC37438 with antifungal indexes of 41% to 63%. 【Conclusion】Large number of endophytic diazotrophs habitat in the tuber and root of normally growing tuber and root crops. Endophytic diazotrophs from tuber and root crops phylogenetically belong 79 species of 24 genera showing wide distribution and huge biodiversity.andare dominant populations of endophytic diazotrophs from tuber and root crops. About 10%-60% endophytic diazotrophs have PGP property of producing ACC deaminase or IAA or antagonism. This might be the underlying reasons that endophytic diazotrophs are benefit to host plants.

tuber and root crops; endophytic diazotrophs; phylogeny; growth promoting characteristics

2016-05-28；接受日期：2016-08-08

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203045）

李艷星，E-mail：LiYX@163.com。通信作者孫建光，Tel：010-82108701；E-mail：jgsun@caas.ac.cn