橡膠樹白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

馮霞，林春花，康迅，金洋，劉曉，何其光，劉文波，繆衛(wèi)國，鄭服叢

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橡膠樹白粉病菌的克隆及功能分析

馮霞，林春花，康迅，金洋，劉曉，何其光，劉文波，繆衛(wèi)國，鄭服叢

（海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海口570228）

【目的】Pbs2是MAPK信號途徑HOG-MAPK通路的重要成員之一，在植物病原菌滲透壓調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。橡膠樹白粉病菌（）是專性寄生菌，論文借助橡膠樹炭疽病菌（），研究橡膠樹白粉病菌的功能?！痉椒ā坎捎猛纯寺》椒?，分別以橡膠樹白粉病菌基因組DNA和cDNA為模板，PCR擴增；利用生物信息學(xué)分析該基因的結(jié)構(gòu)域，對該基因和其他真菌的7個同源蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，并利用MEGA6中最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來進一步分析鑒定該基因；利用同源重組和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將轉(zhuǎn)化到缺失的橡膠樹炭疽菌突變體中；在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，同時提取轉(zhuǎn)化子的基因組作為模板，用橡膠樹白粉病菌OhPbs2的引物對進行PCR鑒定，選擇正確的轉(zhuǎn)化子進行后續(xù)表型測定；在不同培養(yǎng)條件下，比較、和野生型菌株生長狀態(tài)，并在橡膠樹葉片接菌檢測3個菌株致病力?！窘Y(jié)果】基因序列全長1 927 bp，cDNA序列全長1 860 bp，含有一個內(nèi)含子，編碼一個619個氨基酸的蛋白；生物信息學(xué)分析表明該蛋白具有與CgPbs2相同的S_TKc功能域，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)橡膠樹白粉病菌Pbs2蛋白與煙曲霉（）Pbs2蛋白親緣關(guān)系最近，相似度為55%，與橡膠樹炭疽病菌的相似度為49%，與粗糙脈孢菌（)、稻瘟菌（）、釀酒酵母（）、禾谷鐮孢（）的Pbs2蛋白具有較近的親緣關(guān)系， 相似度分別為54%、53%、53%、50%；菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培養(yǎng)基上長出白色菌落，菌株不能生長，并且測序結(jié)果顯示已成功轉(zhuǎn)入；在MM培養(yǎng)基上菌落呈白色，氣生菌絲較短，不同于wild type菌株。在含有不同濃度NaCl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培養(yǎng)基上，、和wild type菌株隨著濃度增加，菌落生長速度逐漸降低，不僅能恢復(fù)橡膠樹炭疽菌菌株耐滲透壓尤其耐受山梨醇的能力以及對咯菌腈的敏感性，甚至具有增強的能力，互補改變了橡膠樹炭疽病菌顏色，抑制了氣生菌絲生長；可能參與了橡膠樹炭疽病菌致病性，但互補沒有恢復(fù)其致病性。【結(jié)論】可能參與調(diào)控病菌的營養(yǎng)生長、氧化應(yīng)激反應(yīng)、滲透壓響應(yīng)及細胞壁形成等，并能增強橡膠樹炭疽病菌相應(yīng)功能，但與調(diào)控病菌致病力的機制可能存在不同。

橡膠樹白粉病菌；；基因克??；滲透壓；致病性

0 引言

【研究意義】由白粉病菌（）引起的橡膠樹白粉病危害嚴重，是中國早春防治“兩病一蟲”的重點[1]。目前，橡膠樹白粉病的研究多集中于化學(xué)防治[2]，對該病的發(fā)病規(guī)律及病菌致病機理缺乏深入研究。研究橡膠樹白粉病菌致病相關(guān)基因功能有助于了解其致病機理并為該病的防治提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】MAPK是一類生物進化上較為保守的蛋白激酶，它普遍存在于真核生物中，主要參與胞外信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞的多種生物學(xué)過程[3-4]。根據(jù)其蛋白的功能，MAPK信號途徑分為Fus3、Kss1、Slt2、Hog1和Smk1等信號途徑[5-9]。Hog1級聯(lián)系統(tǒng)是經(jīng)典的MAPK級聯(lián)途徑，該途徑首先在釀酒酵母（）中發(fā)現(xiàn)[10]，參與誘導(dǎo)脅迫反應(yīng)基因的表達，信息素反應(yīng)途徑的阻遏，細胞形態(tài)恢復(fù)及致病性等[11]，調(diào)控這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的途徑就是Hog1類蛋白（Ste11→Pbs2→Hog1）[12]，Pbs2是Hog1類蛋白中的重要成員[13]。已報道的Pbs2作用機理為該途徑受到外界高滲條件的誘導(dǎo)，通過激活甘油合成相關(guān)酶基因的表達，使胞內(nèi)積累高濃度甘油，從而維持細胞較高的膨壓[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)Pbs2與殺真菌劑的敏感性和真菌細胞壁代謝相關(guān)[4,17-18]，或者在感受外界冷熱等壓力變化中起重要作用[19-20]?！颈狙芯壳腥朦c】是一種專性寄生菌，有關(guān)的MAPK信號途徑及相關(guān)基因功能研究未見報道。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)橡膠樹白粉病菌基因組中含有25個MAPK信號途徑相關(guān)基因，并運用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及聚類分析，構(gòu)建橡膠樹白粉病菌中的MAPK級聯(lián)途徑簡圖，共發(fā)現(xiàn)了2個MAPK基因、2個MAPKK基因和5個MAPKKK基因[21]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從橡膠樹白粉病菌菌株HO-73中克隆并鑒定MAPK信號途徑中的重要基因的同源基因（），利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將該基因轉(zhuǎn)化到橡膠樹炭疽菌（）的對應(yīng)敲除突變體中，通過表型分析推測的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2016年4月在海南大學(xué)熱帶分子植物病理學(xué)實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 橡膠樹白粉病菌HO-73、橡膠樹炭疽病菌野生型菌株wild type（Cg-1）及其基因突變體（該突變體由作者之一林春花構(gòu)建，未發(fā)表）等，保存于海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院熱帶分子植物病理學(xué)實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 PDA+1.5 mol·L-1山梨醇：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，山梨醇 182.17 g，瓊脂粉13 g加蒸餾水定容至1 L；PDB+1.5 mol·L-1山梨醇：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，山梨醇 182.17 g加蒸餾水定容至1 L；MM培養(yǎng)基：K2HPO47 g，KH2PO43 g，(NH4)SO41 g，MgSO40.1 g，檸檬酸鈉0.5 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉18 g加蒸餾水定容至1 L。

NaCl、30% H2O2為分析純試劑（廣州化學(xué)試劑）；山梨醇、十二烷基硫酸鈉SDS（Solarbio公司）；咯菌腈（Fluka公司）。

1.2基因克隆及生物信息學(xué)分析

基因組DNA的提取參照OMEGA Fungal DNA Kit說明書?？俁NA提取參照RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，利用試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。采用本地BLAST和同源克隆的方法，參照GenBank報道的真菌Pbs2序列，設(shè)計一對引物1，OhPbs2-F-1：5′-AAAGACCTAACTCAATGCCCTA-3′，OhPbs2-R-1：5′-AAGAATGGTTTTTACCTAATGG-3′，分別以橡膠樹白粉病菌基因組DNA和cDNA為模板，PCR擴增的DNA和cDNA序列。同時設(shè)計一對引物2，OhPbs2-F-2：5′-GAAGAGGGTGTCAAGGATCCAAC G-3′，OhPbs2-R-2：5′-CCTCATCCCATAGATAGGAA TATG-3′，以橡膠樹白粉病菌基因組DNA為模板，PCR擴增包括以及起始密碼子前1 300 bp左右和終止密碼子后300 bp左右共3 526 bp用于后續(xù)轉(zhuǎn)化。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后送上海生工測序公司測序。利用在線分析工具預(yù)測蛋白功能域（http://smart.embl-heidelberg.de/），利用MEGA6 中最大簡約法（Maximum Parsimony Methods）進行氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選

參照林春花等[22]的方法制備的原生質(zhì)體，在每份200 μL原生質(zhì)體（1×107個原生質(zhì)體/mL）中加入10 μg用于回補的切膠回收片段進行轉(zhuǎn)化。由于在Hog1通路中處于關(guān)鍵位置，沒有該基因的菌株在高滲透壓力的培養(yǎng)基上無法生長，反之則可以正常生長，故在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，參照1.2的方法提取轉(zhuǎn)化子的基因組作為模板，用橡膠樹白粉病菌的引物對OhPbs2-F/R-2進行PCR鑒定，選擇正確的轉(zhuǎn)化子進行后續(xù)表型測定。

1.4 橡膠白粉病菌轉(zhuǎn)化子的功能測定

將、和wild type 3個菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫靜置培養(yǎng)8 d后在菌落外緣相同的位置用直徑為9 mm的打孔器打菌餅用于測定。

1.4.1 菌落形態(tài)的觀察及生長速率的測定 將3個菌株菌餅分別接種在PDA和MM培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)。從第1天起用十字交叉法逐日測量菌落直徑，繪制菌落生長曲線，同時觀察菌落形態(tài)及顏色變化并拍照。

1.4.2在病菌耐受滲透壓力中的調(diào)節(jié)作用 將3個菌株菌餅分別接種于含有NaCl（濃度為0.3、0.5、0.7、1.0 mol·L-1）、山梨醇（濃度為1.0、1.5、2.0 mol·L-1）的MM培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后觀察并測量菌落直徑，計算抑制率。菌株抑制率=（對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.4.3在病菌細胞壁發(fā)育中的作用 參照1.4.2的方法在含有SDS（濃度為25、50、100 μg·mL-1）的MM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個菌株，計算菌株抑制率。

1.4.4在氧化壓力調(diào)節(jié)中的作用 參照1.4.2的方法在含有H2O2（濃度為1、3、5和10 mmol·L-1）的MM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個菌株，計算菌株抑制率。

1.4.5在病菌對咯菌腈敏感性中作用 參照1.4.2的方法在含有咯菌腈（濃度為10、30、40 μg·mL-1）的MM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個菌株，計算菌株抑制率。

1.4.6對病菌致病力的影響 采用離體健康的幼嫩葉片進行接種。在35 mm×45 mm的白色磁盤中鋪兩層吸水紙，用水浸透后保濕，將橡膠樹嫩綠初期葉片放在吸水紙上，噴灑水霧于葉片上，葉柄用濕潤的棉花保濕，用滅過菌的接種針刺傷半邊葉片，將3個菌株的菌餅在葉表面?zhèn)谔幗臃N，保鮮膜包住白磁盤，在潮濕環(huán)境下水霧依然存在，以刺傷接種同樣大小的無菌PDA培養(yǎng)基小塊為空白對照，置于25℃培養(yǎng)7 d后觀察接種處葉片發(fā)病情況，參照崔華威等[23]的方法測量橡膠樹葉片相對病斑面積。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS進行數(shù)據(jù)分析，1.4.1—1.4.5的所有試驗至少重復(fù)3次，1.4.6的試驗至少重復(fù)50次。

2 結(jié)果

2.1基因克隆及生物學(xué)信息學(xué)分析

用引物對OhPbs2-F/R-1經(jīng)PCR擴增獲得的DNA和cDNA序列?；蛉L1 927 bp（GenBank登錄號：KX675257），cDNA全長1 860 bp（圖1-A左），含有一個內(nèi)含子，編碼一個619個氨基酸的蛋白，且該蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)含有一個S_TKc功能域（圖1-C）。用引物對OhPbs2-F/R-2經(jīng)PCR擴增獲得包括以及起始密碼子前 1 300 bp左右和終止密碼子后300 bp左右共3 526 bp（圖1-A右）。利用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1-B）。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)橡膠樹白粉病菌的Pbs2蛋白與煙曲霉（，Af293 XP_752961.1）Pbs2蛋白親緣關(guān)系最近，相似度為55%，與橡膠樹炭疽病菌（Cg-1 KT387309）的相似度為49%，與粗糙脈孢菌（，XP_965727）、稻瘟菌（，70-15 EAQ71627.1）、釀酒酵母（YJM789 EDN63254.1）、禾谷鐮孢（，PH-1 ESU14622.1）的Pbs2蛋白具有較近的親緣關(guān)系，相似度分別為54%、53%、53%、50%。

2.2的互補及鑒定

經(jīng)過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得陽性轉(zhuǎn)化子，能在篩選培養(yǎng)基（含有1.5 mol·L-1山梨醇的PDA）平板上長出菌落，并產(chǎn)生白色菌絲，而對照在該平板上不能夠生長（圖2-A）。以該陽性轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，用引物對OhPbs2-F/R-2進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在3 000—5 000 bp處有單一條帶，而無條帶出現(xiàn)（圖2-B）。膠回收測序與序列比對驗證后，說明被成功轉(zhuǎn)化到橡膠樹炭疽菌的突變體中，獲得了互補轉(zhuǎn)化子。

A：培養(yǎng)基篩選，左側(cè)為ΔCgPbs2菌株，右側(cè)為ΔCgPbs2+OhPbs2菌株Medium filter, the left side was ΔCgPbs2 strain, the right side was ΔCgPbs2+ OhPbs2 strain；B：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)（5000）DNA Marker (5000)；1：ΔCgPbs2+OhPbs2菌株DNA中OhPbs2的PCR擴增OhPbs2 amplification from the ΔCgPbs2+OhPbs2 DNA by PCR；CK：ΔCgPbs2菌株 DNA中OhPbs2的PCR擴增OhPbs2 amplification from the ΔCgPbs2 DNA by PCR

2.3 表型分析

2.3.1 菌落形態(tài)的觀察及生長速率的測定 將、和wild type分別接種于PDA和MM培養(yǎng)基上（圖3-A）。在PDA培養(yǎng)基上，6 d之前，生長速度更接近，但培養(yǎng)6 d后，與wild type生長速率一致（圖3-B），盡管如此，3個菌株菌落生長速率沒有顯著差異，同時在菌落顏色上也沒有顯著差異。在MM培養(yǎng)基上，菌落生長速度雖快于wild type，但與wild type無顯著性差異（圖3-C）。在菌落顏色上，wild type呈灰白色，與趨于一致，而菌落顏色趨近白色，且氣生菌絲稀疏，不同于和wild type。

2.3.2在調(diào)節(jié)病菌滲透壓力中的作用 在不同濃度NaCl或山梨醇存在的條件下培養(yǎng)7 d，生長最快，wild type次之，而生長最慢；生長速度表現(xiàn)為隨著NaCl或山梨醇濃度增加，菌落的生長速度逐漸降低。至山梨醇濃度為1.5、2.5 mol·L-1時，的菌絲不生長，與wild type仍可生長，并且兩者達顯著差異，而在NaCl存在條件下，兩者無顯著差異（圖4-A、4-B）。

A：將ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type分別接種于PDA培養(yǎng)基上6 d后和MM培養(yǎng)基上7 d后的菌落大小和形態(tài)Colony size and morphology of ΔCgPbs2, ΔCgPbs2+OhPbs2 and wild type after inoculated 6 days in PDA medium and 7 days in MM medium；B：PDA培養(yǎng)基上菌落直徑生長速度colony diameter growth rate in PDA medium；C：MM培養(yǎng)基上菌落直徑生長速度colony diameter growth rate in MM medium

2.3.3在病菌細胞壁發(fā)育中的作用 在不同濃度SDS存在的條件下，生長最快，wild type次之，而生長最慢；隨著SDS濃度的增加，3個菌株生長速度逐漸減緩，但與wild type沒有顯著差異，兩個菌株與有顯著差異（圖4-C）。

2.3.4在氧化壓力調(diào)節(jié)中的作用 在不同濃度H2O2存在的條件下，生長最快，wild type次之，而生長最慢；生長量表現(xiàn)為隨H2O2濃度增加，3個菌株菌落的生長速度逐漸降低。至H2O2濃度為10 mmol·L-1時，仍可生長，但和wild type均不能生長（圖4-D）。

A：NaCl；B：山梨醇Sorbitol；C：SDS；D：H2O2；E：咯菌腈fludioxonil

2.3.5對病菌抗殺菌劑咯菌腈的影響 在不同濃度咯菌腈存在的條件下，生長最快，次之，而wild type生長最慢；生長量表現(xiàn)為隨著咯菌腈濃度增加，3個菌株菌落的生長速度逐漸降低，與和wild type差異顯著，但和wild type差異不顯著（圖4-E）。

2.3.6 致病力測定 在葉片上接種菌餅3 d后便表現(xiàn)出了明顯的橡膠樹炭疽病斑，隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)病斑直徑不斷擴展，7 d后調(diào)查結(jié)果顯示，wild type病斑面積最大，病斑面積占整個葉片面積21%，和次之病斑面積分別占整個葉片面積16%和14%，和二者無顯著差異，但與wild type差異顯著（圖5）。

圖5 致病力測定

3 討論

橡膠樹白粉病菌是一類專性活體寄生真菌[24]，在橡膠樹白粉病菌中目前不能做敲除和互補等實驗操作，而專性活體寄生真菌的等基因功能研究尚未見報道，所以本試驗借用研究較為深入的真菌來驗證橡膠樹白粉病菌中重要基因的功能。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將轉(zhuǎn)化到橡膠樹炭疽菌的對應(yīng)敲除突變體中，筆者發(fā)現(xiàn)橡膠樹炭疽病菌的敲除并不影響橡膠樹炭疽病菌菌落的生長及顏色，橡膠樹白粉病菌的互補使與wild type菌落顏色、生長速率及氣生菌絲有差異，說明橡膠樹白粉病菌的互補影響了橡膠樹炭疽病菌菌落的顏色和氣生菌絲生長，有研究表明蕓薹生鏈格孢不影響菌落顏色和菌株菌落生長速率[25]，玉米大斑病菌可造成菌落顏色變淡，氣生菌絲變短（稀疏）或者不明顯[26]。但以往報道互補后菌株的生長速率均慢于野生型菌株，而的生長速率高于wild type，并有顯著差異，這與以往報道不同，說明參與調(diào)控并能增強橡膠樹炭疽病菌的營養(yǎng)生長。

是調(diào)控滲透壓和氧化壓力的重要基因，有研究表明煙曲霉不僅參與滲透壓的傳導(dǎo)，還參與氧化壓力的傳導(dǎo)，但只參與傳導(dǎo)特定的氧化壓力[27]；玉米大斑病菌參與調(diào)控該菌的高滲脅迫反應(yīng)和氧脅迫反應(yīng)并具有正調(diào)控作用[26]；在蕓薹生鏈格孢的滲透壓調(diào)節(jié)中也起到了一定的作用[25]。本研究也表明的互補可以恢復(fù)橡膠樹炭疽病菌耐滲透壓和耐氧化壓力的能力，但是的互補可在一定程度上增強橡膠樹炭疽病菌耐滲透壓和氧化壓力的能力，尤其顯著增強病菌對山梨醇的耐受能力，這與以往報道不同，有研究報道額外拷貝煙曲霉的和能增強菌株對高滲透壓和氧化壓力的抵抗能力[28]，這兩者的機制是否相同有待驗證。

咯菌腈是一種苯基吡咯類殺菌劑，由于它比天然產(chǎn)物硝吡咯菌素抗光解，能專一性地抑制霉菌而廣泛地應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的真菌性病害[29-30]。有研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌的沉默使轉(zhuǎn)化子對殺菌劑的抗性明顯增強，表明該基因表達的蛋白很可能就是該殺菌劑的作用位點[26]，蕓薹生鏈格孢也參與了調(diào)控對殺菌劑的抗性[25]。本研究結(jié)果也驗證了的缺失使菌株對咯菌腈的抗性增強。目前未見報道互補是否可恢復(fù)病原菌抗性，本研究中，互補恢復(fù)了橡膠樹炭疽病菌對咯菌腈的敏感性，但并沒有增強其對咯菌腈敏感性趨勢，這可能也與OhPbs2蛋白的結(jié)構(gòu)及其來源不同有關(guān)。

玉米大斑病菌參與調(diào)控病菌細胞壁的發(fā)育，并且隨著表達量的降低，突變體菌落生長速率依次降低，說明的沉默對細胞壁的發(fā)育起正調(diào)控的作用[26]。本研究表明的互補不僅可以恢復(fù)橡膠樹炭疽病菌耐SDS的能力，而且可增強病菌耐SDS能力，該結(jié)果未見報道。蕓薹生鏈格孢參與調(diào)控該病原菌致病力強弱，互補的互補子致病力大致恢復(fù)到野生型[25]。本研究中的缺失導(dǎo)致橡膠樹炭疽病菌的致病力下降，但的互補并沒有恢復(fù)橡膠樹炭疽病菌的致病力，而與的致病力一致。從上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與橡膠樹炭疽病菌滲透壓、氧化壓力等方面的調(diào)控，但對橡膠樹炭疽病菌致病力的影響可能與不同。

在植物病原真菌中，同源基因的功能是比較復(fù)雜的，在不同的病菌中該類基因的功能均有所不同，但是目前比較一致的看法是該類基因參與調(diào)控病菌的各種脅迫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)，這在本研究中也得到了證實。試驗中發(fā)現(xiàn)在MM培養(yǎng)基中加入NaCl、山梨醇、H2O2、SDS、咯菌腈等時，與野生型相比，菌落較大，但的致病力比野生型弱，對于其中的原因還有待進一步研究。

本研究從橡膠樹白粉病菌中鑒定了MAPK信號通路中Hog1類蛋白家族中的重要成員Pbs2的編碼基因，其同源基因在真菌中廣泛存在且相對保守。OhPbs2與煙曲霉Pbs2蛋白親緣關(guān)系最近，相似度為55%，這可能與煙曲霉和橡膠樹白粉病菌都為半知菌類有關(guān)，OhPbs2與粗糙脈孢菌、稻瘟菌、釀酒酵母、禾谷鐮孢中的Pbs2蛋白具有較近的親緣關(guān)系，但同為橡膠樹重要致病菌，OhPbs2與橡膠樹炭疽菌的Pbs2相似度僅為49%，這預(yù)示OhPbs2與CgPbs2在病菌生長發(fā)育及其致病性等方面可能存在較大不同。

4 結(jié)論

橡膠樹白粉病菌參與調(diào)控橡膠樹炭疽菌的營養(yǎng)生長、氧化應(yīng)激反應(yīng)、滲透壓響應(yīng)及細胞壁發(fā)育等，并且可能具有增強病菌相應(yīng)功能的能力，尤其在調(diào)控病菌顏色、耐受山梨醇、SDS等的能力方面與以往報道不同，同時與調(diào)控病菌致病力的機制可能存在不同。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Gene cloning and functional analysis of

FENG Xia, LIN ChunHua, KANG Xun, JIN Yang, LIU Xiao, HE QiGuang, LIU WenBo, MIAO WeiGuo, ZHENG FuCong

(College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228)

【Objective】Pbs2 is one of the important members of HOG-MAPK pathway in MAPK signaling pathway, and plays an important role in osmotic regulation of plant pathogens.is an obligate parasite. In this paper, the function and effect ofofwere studied by using【Method】The homologous cloning method was used to amplify theby using the genomic DNA and cDNA as template. The domain of this gene was analyzed by bioinformatics. Phylogenetic analysis of seven homologous protein sequences of other fungi and OhPbs2 was conducted, and the phylogenetic tree was constructed by the maximum parsimony method in MEGA6 to further analyze and identify this gene. Using homologous recombination and protoplast transformation,was transformed into theof. The transformant was screened on PDA+1.5 mol·L-1sorbitol. At the same time, the genome of the transformant was extracted as a template and identified with the primer pairs of OhPbs2, and the correct transformantwas selected for subsequent phenotypic determination. The growth state of,and wild type strains was compared under different culture conditions. And the pathogenicity of the three strains was detected by inoculating the leaves of the rubber tree.【Result】The full-length of theis 1 927 bp, cDNA of theis 1 860 bp, and contains an intron that encodes a 619 amino acids protein. Bioinformatics analysis showed that the protein had the same S_TKc domain as CgPbs2. The phylogenetic tree showed that the Pbs2 protein was closely related toPbs2 protein, and the similarity was 55%. And the similarity towas 49%, also it was close to Pbs2 protein of,,and, the similarities were 54%, 53%, 53% and 50%, respectively.strain could grow white colonies on PDA+1.5 mol·L-1sorbitol medium, butstrain could not grow. The sequencing results showed that thehad been successfully transferred into the. The color of,and wild type strains decreased gradually with increasing concentration in MM medium containing different concentrations of NaCl, sorbitol, SDS, H2O2and fludioxonil.not only restored the ability of the wild type strain to tolerate osmolality, especially to sorbitol, but also to the susceptibility to fludioxonil, and even to enhance potency.Butcomplementary changed the color ofand inhibited the growth of aerial hyphae.might be involved in the pathogenicity of, howeverdid not restore its pathogenicity, but weakened its pathogenic ability to a certain extent.【Conclusion】may be involved in the regulation of the vegetative growth, oxidative stress, osmotic pressure and cell wall formation of the pathogen, and enhance the corresponding function of the.may be involved in the pathogenicity of the pathogen, but pathogenicity may be different from.

;; gene cloning; osmotic pressure; pathogenicity

2016-10-08；接受日期：2016-11-10

國家自然科學(xué)基金（31660033）、重點發(fā)展（“973”）（2011CB111612）、國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-34-GW8）、海南自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團隊項目（2016CXTD002）

馮霞，E-mail：952372934@qq.com。通信作者繆衛(wèi)國，E-mail：weiguomiao1105@126.com。通信作者鄭服叢，E-mail：zhengfucong@126.com