綠盲蝽AlEcR-A的單克隆抗體制備及在外源20E誘導(dǎo)下的應(yīng)答

譚永安，肖留斌，郝德君，趙靜，孫洋，柏立新

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綠盲蝽AlEcR-A的單克隆抗體制備及在外源20E誘導(dǎo)下的應(yīng)答

譚永安1，肖留斌1，郝德君2，趙靜1，孫洋1，柏立新1

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014；2南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京210037）

【目的】獲得綠盲蝽（）蛻皮激素受體（）原核表達(dá)的重組蛋白，制備單克隆抗體，分析綠盲蝽在外源蛻皮激素(20E)誘導(dǎo)下mRNA及蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)，為進(jìn)一步研究的功能奠定前期基礎(chǔ)，同時(shí)也為構(gòu)建20E信號(hào)傳導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)圖譜提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭谇捌讷@得綠盲蝽的基礎(chǔ)上，將含有其基因的T載體經(jīng)I和I雙酶切，構(gòu)建AlEcR-A原核表達(dá)載體（pCzn1-AlEcR-A），將該表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白Ni-IDA親和純化，以獲得基因功能區(qū)的純化蛋白。進(jìn)一步用其進(jìn)行免疫反應(yīng)，取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA及Western blot篩選驗(yàn)證是否為目的抗體，通過抗體純化，Western blot檢測(cè)該抗體能否特異性結(jié)合AlEcR-A重組蛋白及綠盲蝽總蛋白，從而制備得到AlEcR-A蛋白單克隆抗體。最后利用RT-PCR及Western blot方法，進(jìn)行20E微注射綠盲蝽2齡若蟲，分析8 d內(nèi)的mRNA及蛋白含量的變化，明晰20E誘導(dǎo)下的應(yīng)答反應(yīng)?！窘Y(jié)果】 經(jīng)I和I雙酶切后原核表達(dá)載體pCzn1-AlEcR-A在大腸桿菌Arctic express中能高效表達(dá)一個(gè)約為55 kD的蛋白，且該重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后主要以包涵體的形式存在；經(jīng)Ni-IDA親和層析后，pCzn1-AlEcR-A重組蛋白的包涵體純度僅在55 kD附近有一條明顯的特異性條帶，說明靶蛋白已得到純化。進(jìn)一步通過小鼠免疫、細(xì)胞融合及腹水制備，獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗AlEcR-A蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為8H7；Western blot分析表明，該細(xì)胞株不僅能與綠盲蝽總蛋白結(jié)合，還可特異性與AlEcR-A重組蛋白反應(yīng)，且條帶大小一致，說明制備的AlEcR-A單克隆抗體準(zhǔn)確、有效；RT-PCR及Western blot結(jié)果表明，與注射蒸餾水相比，20E微注射處理后的綠盲蝽mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量均顯著升高，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其增值幅度也逐漸增高?！窘Y(jié)論】獲得了一株高特異性的能穩(wěn)定分泌AlEcR-A單克隆抗體的細(xì)胞株，20E有誘導(dǎo)mRNA及蛋白表達(dá)的作用。

綠盲蝽；蛻皮激素受體；20-羥基蛻皮酮；單克隆抗體；表達(dá)量

0 引言

【研究意義】自20世紀(jì)90年代轉(zhuǎn)Bt基因棉花在中國(guó)大面積商業(yè)種植以來，其靶標(biāo)鱗翅目害蟲如棉鈴蟲（）等得到有效控制，棉田化學(xué)農(nóng)藥的施用頻率及使用量大幅度降低，從而使得棉田害蟲的生態(tài)位發(fā)生了一系列的演替變化，綠盲蝽（）已上升成為長(zhǎng)江及黃河流域棉區(qū)上的主要致災(zāi)性害蟲[1-3]。目前，防治綠盲蝽主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，但也隨之帶來了諸多問題，如抗藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致防治效果下降、污染環(huán)境及食品安全等[4]。因此綠盲蝽的防控減災(zāi)亟需開拓基于新靶標(biāo)的有效技術(shù)。與化學(xué)農(nóng)藥相比，昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑具有高毒力且與環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)[5]，其作用機(jī)理多為干擾昆蟲蛻皮激素或保幼激素，導(dǎo)致昆蟲不能蛻皮而死亡[6]。【前人研究進(jìn)展】類固醇激素 20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）是昆蟲蛻皮激素的主要活性形式，在昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用[7]。已有研究表明，昆蟲蛻皮激素受體（ecdysone receptors，）為20E的作用靶標(biāo)受體，在蛻皮激素信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵角色[8]。昆蟲隸屬于核受體（nuclear receptor，NR）基因家族，該家族通常具有5個(gè)模塊結(jié)構(gòu)域：A/B域（反式調(diào)控域）、C域（DNA結(jié)合域，DNA binding domain，DBD）、D域、E域（配體結(jié)合域，ligand binding domain，LBD）和F域[9]，其中C域及E域相對(duì)保守，且C域含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)[10]。迄今，已經(jīng)明確了20E與其受體在調(diào)控昆蟲蛻皮時(shí)的分子機(jī)制，EcR首先與20E結(jié)合形成一個(gè)配體-受體復(fù)合物，再與（超氣門蛋白，另一個(gè)20E核受體）結(jié)合形成 20E-EcR-USP異源二聚體來行使生理功能[11]。此異源二聚體可對(duì)昆蟲血淋巴中的蛻殼啟動(dòng)激素（ecdysis-triggering hormone，ETH）進(jìn)行雙重調(diào)控，當(dāng)昆蟲血淋巴中20E滴度下降后，羽化激素（eclosion hormone，EH）可促進(jìn)ETH的分泌，最終使得ETH啟動(dòng)昆蟲的蛻皮過程[12]。20E-EcR-USP綁定形成的配體-受體復(fù)合物引發(fā)20E初級(jí)應(yīng)答基因的表達(dá)，由20E初級(jí)反應(yīng)基因誘導(dǎo)表達(dá)的20E次級(jí)應(yīng)答基因級(jí)聯(lián)放大20E信號(hào)[13]，從而在基因組途徑上調(diào)控昆蟲蛻皮、變態(tài)及生殖等重要生理過程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】昆蟲自身在外源20E誘導(dǎo)下的應(yīng)答反應(yīng)如何，目前還不清晰?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在筆者實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的綠盲蝽蛻皮激素受體基礎(chǔ)上，分析其在外源20E誘導(dǎo)后的mRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)，及利用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行重組表達(dá)獲得純化蛋白，通過小鼠免疫、細(xì)胞融合獲得特異性的AlEcR-A單克隆抗體，進(jìn)一步分析外源20E誘導(dǎo)后AlEcR-A蛋白表達(dá)的差異。為在蛋白水平上進(jìn)一步研究的功能打下基礎(chǔ)，同時(shí)也可為豐富20E信號(hào)傳導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)圖譜提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年4月至2016年5月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx

初始綠盲蝽蟲源采自江蘇大豐及東臺(tái)早春蠶豆（）田，于室內(nèi)用四季豆（）豆莢繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期12L﹕12D，成蟲期補(bǔ)充10%蜂蜜水。

1.2 主要試劑與儀器

20E為Sigma公司產(chǎn)品，SYBR Premix Ex Taq Kit為TaKaRa產(chǎn)品，iCycler iQ為Bio-Rad產(chǎn)品，原核表達(dá)載體pCzn1、大腸桿菌Arctic express菌株、SP2/0細(xì)胞株及含有的T載體均為筆者實(shí)驗(yàn)室前期保存，6—8周齡雌性BALB/c小鼠購于揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，限制性內(nèi)切酶I和I，dNTPs，IPTG，Acr、Bis、Tris、ExTaq酶，質(zhì)粒提取試劑盒及PEG為Sigma產(chǎn)品。Pfu DNA聚合酶為Zoonbio公司產(chǎn)品，卡那霉素、咪唑、尿素為上海生工工程生物公司產(chǎn)品，DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為AnyGen公司產(chǎn)品，TEMED為Bio-Rad公司產(chǎn)品，Tyrptone、Yeast Extract為Oxoid公司產(chǎn)品，Ni2+IDA親和層析膠為Novagen公司產(chǎn)品，組織蛋白提取試劑盒為南京鐘鼎公司產(chǎn)品。其余所需各種試劑、藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3在大腸桿菌Arctic Express中的表達(dá)及純化

1.3.1 重組蛋白AlEcR-A的誘導(dǎo)表達(dá)I和I雙酶切含有的T載體及pCzn1載體，DNA Fragment Purification Kit回收，T4DNA連接酶大片段連接。將上述陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Arctic Express克隆菌株中，挑取陽性克隆子后，將1 μl質(zhì)粒加入100 μl感受態(tài)細(xì)胞，冰孵20 min，42℃熱激90 s后迅速置冰中5 min；最后加入600 μl LB培養(yǎng)液，37℃ 220 r/min振搖1 h后離心，涂布于含50 μg·ml-1Amp的LB平板后培養(yǎng)過夜。

挑取單個(gè)菌落接種于含50 μg·ml-1Amp的3 ml LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜，次日按1﹕100的比例接種于LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振搖至菌體OD600值為0.6—0.8時(shí)，取1 ml培養(yǎng)物，10 000 ×室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，37℃ 220 r/min振搖4 h，以誘導(dǎo)AlEcR-A-His融合蛋白表達(dá)，取1 ml培養(yǎng)物，12 000 ×室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，收集菌液，取適量菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)照為不加IPTG。

1.3.2 重組蛋白AlEcR-A的親和純化 于0℃，6 000×離心上述菌液10 min后置于lysis buffer中進(jìn)行沉淀重懸與超聲破碎；將超聲破碎的細(xì)胞裂解液于4℃，10 000×離心20 min后收集沉淀；用洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素，pH 8.0），按比例溶解包涵體，將上述溶液滴加20 mmol·L-1Tris-HCL及5 mmol·L-1EDTA Buffer（pH 7.8）緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于PBS（pH 7.4）溶液中透析過夜。

將上述包涵體溶液上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱上，用Ni-IDA Binding-Buffer進(jìn)行沖洗，再用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）進(jìn)行沖洗，最后用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白，收集流出液，將上述收集的蛋白溶液用PBS緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行透析過夜。取適量透析液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 單克隆抗體的制備

1.4.1 免疫 選取5只6—8周齡雌性BALB/c小鼠，于其腹部和背部皮下多點(diǎn)注射上述純化后的AlEcR-A重組蛋白，注射量為50—100 μg/只。具體方法：用等體積弗氏完全佐劑乳化AlEcR-A重組蛋白，每隔14 d用弗氏不完全佐劑乳化的蛋白免疫2次，2周后加強(qiáng)免疫1次（劑量加倍），四免后采血ELLSA確定血清抗體效價(jià)，并利用Western blot檢測(cè)重組蛋白是否陽性，以進(jìn)行下一步的細(xì)胞融合。

1.4.2 建立雜交瘤細(xì)胞株 采用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的融合方法將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合[14]。融合后4 d查看雜交瘤細(xì)胞株的克隆率，將ELLSA法檢測(cè)為陽性的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，有限稀釋法克隆3次，待陽性雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定分泌抗體后擴(kuò)增培養(yǎng)定株。

1.4.3 制備腹水 將0.2 mL弗氏不完全佐劑注射至小鼠腹腔，于7 d后再注入適量的上述陽性雜交瘤細(xì)胞后收集腹水。

1.5 單克隆抗體的鑒定

1.5.1 抗體的純化 將腹水與PBS按1﹕1混勻后緩慢上樣置層析柱（蛋白A瓊脂糖介質(zhì)填裝），待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，立即在PBS中進(jìn)行4℃透析過夜，隔日進(jìn)行純度、濃度和效價(jià)檢測(cè)。

1.5.2 Western blot檢測(cè)單克隆抗體的特異性 Western blot測(cè)定方法按照Song等[15]的方法進(jìn)行并稍作修改。將原核表達(dá)的AlEcR-A重組蛋白及新鮮孵化的綠盲蝽3齡若蟲進(jìn)行SDS-PAGE分析。轉(zhuǎn)印PVDF膜后封閉，一抗為上述制備的蛋白抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠HRP。

1.6 20E微注射處理

蒸餾水溶解20E，配置成1.0 mg·ml-1母液后置于-20℃儲(chǔ)存待用。于新鮮孵化的2齡若蟲第一腹足注射20E，濃度為4 μg/頭。每處理60頭綠盲蝽若蟲，3次重復(fù)，以注射蒸餾水為對(duì)照（Control組），注射后每隔1 d取樣，共取8次，用于后續(xù)的mRNA及蛋白表達(dá)量分析。

1.7 Western blot分析AlEcR-A蛋白表達(dá)差異

將上述20E處理后的不同日齡綠盲蝽用組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用二奎琳甲酸法測(cè)定其濃度。Western blot測(cè)定方法同1.5。

1.8 熒光定量PCR

TRIzol法提取各處理的綠盲蝽RNA樣本，MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA模板后進(jìn)行RNase處理，-20℃保存待用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前期克隆得到的（KM401656）設(shè)計(jì)RT-PCR引物，具體為ALEcR-A-F：GGGCAGACGATGACTGGATG，ALEcR-A-R：GTAGCTGTTGCTGGACATAGTTG；并設(shè)定（JN616391）為內(nèi)參基因：具體為AL--actin-F：ACCTGTACGCCAACACCGT，AL-- actin-R：TGGAGAGAGAGGCGAGGAT。RT-PCR試驗(yàn)步驟按照SYBR Premix Ex Taq Kit說明書上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：原始預(yù)變性95℃ 3 min；95℃ 5 s；60℃ 10 s；循環(huán)40次。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置5個(gè)技術(shù)重復(fù)，計(jì)算方法為2-ΔΔCt法[16]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

不同處理的綠盲蝽相對(duì)表達(dá)量變化以2-ΔΔCt計(jì)算。差異顯著性采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.0中的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體pCzn1-AlEcR-A的構(gòu)建及重組AlEcR-A蛋白的表達(dá)

測(cè)序結(jié)果表明，T4DNA連接酶可將經(jīng)雙酶切后的表達(dá)載體pCzn1及含有序列的T載體大面積連接，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)亞克隆到pCzn1載體上，將其命名為pCzn1-AlEcR-A（圖1）。隨后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express表達(dá)菌株中，對(duì)在37℃培養(yǎng)下的pCzn1-AlEcR-A重組載體的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析。SDS-PAGE電泳顯示，經(jīng)0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的pCzn1-AlEcR-A重組質(zhì)?？商禺愋员磉_(dá)一個(gè)約55 kD的蛋白，與理論大小相符，說明已在大腸桿菌Arctic Express細(xì)胞中成功表達(dá)，而不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pCzn1-AlEcR-A重組質(zhì)粒無此條帶的蛋白表達(dá)。此外，此誘導(dǎo)表達(dá)的重組AlEcR-A蛋白主要分布在沉淀體中，上清液中幾乎沒有表達(dá)，說明AlEcR-A重組蛋白主要以包涵體的形式存在（圖2）。

M：DL10000；1：酶切前質(zhì)粒Plasmid before enzyme digestion；2：酶切后質(zhì)粒Plasmid after enzyme digestion

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物Protein molecular weight marker；1：對(duì)照（無IPTG誘導(dǎo)、沉淀）un-induced (without IPTG induction, precipitate)；2：37℃過夜培養(yǎng)（總蛋白1） Overnight culture of 37℃ (total protein 1)；3：37℃過夜培養(yǎng)（總蛋白2）Overnight culture of 37℃(total protein 2)；4：37℃過夜培養(yǎng)（沉淀）Overnight culture of 37℃(precipitate)；5：37℃過夜培養(yǎng)（上清液）Overnight culture of 37℃(supernatant)

2.2 重組蛋白的Ni柱親和純化

利用SDS-PAGE電泳分析了經(jīng)Ni柱親和純化后pCzn1-AlEcR-A基因重組蛋白的純化情況。經(jīng)緩沖液洗脫、透析后，上述含有pCzn1-AlEcR-A基因重組蛋白的包涵體純度有較大程度的改善，僅在55 kD附近有一條明顯的特異性條帶，并未見其他條帶，說明已得到純化的AlEcR-A重組蛋白（圖3）。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物Protein molecular weight marker；1：未純化的包涵體un-purified inclusion body；2：未與Ni柱結(jié)合的雜蛋白Miscellaneous protein un-combined with Ni；3：與Ni柱結(jié)合的目的蛋白Protein combined with Ni

2.3 抗AlEcR-A蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立

用上述制備的重組蛋白pCzn1-AlEcR-A免疫小鼠，細(xì)胞融合4 d后發(fā)現(xiàn)，包被抗原的細(xì)胞株陽性克隆率均達(dá)到了100%，且不同時(shí)期收集的雜交瘤細(xì)胞上清的OD450 nm值幾乎沒有變化。將得到的能穩(wěn)定分泌抗AlEcR-A蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為8H7，進(jìn)而擴(kuò)增培養(yǎng)定株，以進(jìn)行下一步的抗體特異性鑒定。

2.4 AlEcR-A蛋白單克隆抗體的特異性鑒定

ELISA檢測(cè)效價(jià)結(jié)果顯示，細(xì)胞株8H7的腹水效價(jià)達(dá)到了5.12×105。Western blot分析表明，所制備的單克隆抗體不僅能與綠盲蝽總蛋白結(jié)合，還可特異性與AlEcR-A重組蛋白反應(yīng)（圖4），且條帶大小一致，說明制備的AlEcR-A單克隆抗體準(zhǔn)確、有效，可以用于后續(xù)的Western blot檢測(cè)。

2.5 外源20E對(duì)綠盲蝽mRNA含量的影響

RT-PCR結(jié)果表明，與注射蒸餾水相比，外源20E處理的綠盲蝽相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著升高（＜0.05或0.01）。在處理的8 d內(nèi)，外源20E處理的相對(duì)表達(dá)量分別為1.15、1.25、1.32、1.35、1.43、1.63、1.66和1.61，說明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量的增值幅度也逐漸增高，且在20E處理后的第7天達(dá)到峰值（圖5），20E有誘導(dǎo)綠盲蝽mRNA表達(dá)的作用。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物Protein molecular weight marker；1：3齡綠盲蝽若蟲3rd instar nymph；2：重組蛋白pCzn1-AlEcR-A Recombinant protein pCzn1-AlEcR-A

2.6 外源20E對(duì)綠盲蝽AlEcR-A蛋白含量的影響

Western blot結(jié)果表明，隨著20E處理時(shí)間的延長(zhǎng)，綠盲蝽AlEcR-A蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。此外，與蒸餾水處理組（CK）相比，20E處理的綠盲蝽AlEcR-A蛋白表達(dá)量均有一定富集效果，且注射蒸餾水處理組（CK）的AlEcR-A蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其mRNA相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)較為一致（圖6），20E有誘導(dǎo)綠盲蝽AlEcR-A蛋白表達(dá)的作用。

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上標(biāo)注的不同字母表示同一天AlEcR-A相對(duì)表達(dá)量差異顯著或極顯著 The histogram bars represented mean±SE of at least three replicates. Different letters above each bar indicated statistical difference based on Duncan’s Multiple Comparison test

圖6 不同處理對(duì)AlEcR-A蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

可溶性蛋白質(zhì)的異源表達(dá)已經(jīng)有較多的表達(dá)系統(tǒng)可用，目前很多可溶性蛋白以融合蛋白的形式得到成功表達(dá)[17-19]。本研究在前期保存在含有完整T載體的基礎(chǔ)上，通過原核表達(dá)載體構(gòu)建、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni親和純化、小鼠免疫、細(xì)胞融合及腹水制備等技術(shù)手段，成功制備了綠盲蝽AlEcR-A的單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)IPTG能夠很好地誘導(dǎo)重組pCzn1- AlEcR-A質(zhì)粒的表達(dá)，但主要以包涵體的形式存在。SDS-PAGE結(jié)果表明，經(jīng)Ni柱的包涵體進(jìn)行親和純化后，重組pCzn1-AlEcR-A質(zhì)粒純度可明顯提高（圖3），且無需經(jīng)過尿素的變性和復(fù)性，避免了蛋白在此過程中活性的降解和產(chǎn)量的降低。單克隆抗體的成功制備需要良好的免疫原和穩(wěn)定的篩選方法，在AlEcR-A單克隆抗體篩選過程中，以重組質(zhì)粒pCzn1-AlEcR-A作為初始免疫制得的AlEcR-A蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株，ELISA檢測(cè)顯示，該細(xì)胞株的腹水效價(jià)較高，Western blot分析結(jié)果也表明該單克隆抗體可同時(shí)與綠盲蝽總蛋白及AlEcR-A重組蛋白特異性結(jié)合（圖4），可用于檢測(cè)綠盲蝽體內(nèi)AlEcR-A蛋白的豐度變化。

由于A/B域的堿基差異，昆蟲EcR基因分為A、B1和B2這3個(gè)亞型蛋白，目前僅黑腹果蠅（）中發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在3個(gè)亞型蛋白[20]，而在其他昆蟲中僅存在A型或B型。本試驗(yàn)的昆蟲綠盲蝽中也存在A和B兩種亞型蛋白[21-22]。近年來，針對(duì)昆蟲蛻皮激素與EcR之間的互作機(jī)制越來越受到研究者的重視，尤其在它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的機(jī)制獲得了許多重要突破。研究表明，EcR-USP異源二聚體在分子伴侶蛋白復(fù)合物Hsp90和Hsc70的協(xié)助下才能獲得DNA結(jié)合活性[23]。此外，20E需要通過解除共阻遏因子和募集共激活因子來激活EcR-USP異源二聚體并啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄[24]。研究還表明，蛋白激酶C（protein kinase）是一種昆蟲蛻皮激素的細(xì)胞膜受體，在傳遞20E信號(hào)中的功能也可發(fā)揮重要作用[25]。此外，20E還能激活一種非基因組途徑——鈣離子/鈣調(diào)蛋白來調(diào)控下游基因的表達(dá)[26]。上述的研究均側(cè)重于20E傳導(dǎo)過程中各種受體對(duì)其下游基因的影響，或者是進(jìn)行了20E信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中各種影響因子的功能鑒定，而在這過程中，這些受體自身在20E誘導(dǎo)下的表達(dá)模式如何，如受體的mRNA及蛋白的表達(dá)目前還未見報(bào)道。前人研究結(jié)果表明，昆蟲EcR的表達(dá)豐度與體內(nèi)20E滴度息息相關(guān)，家蠶（）絲腺中的EcR只有在20E滴度超過5 ng·ml-1時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[27]。在本研究中，對(duì)照處理組綠盲蝽的mRNA及蛋白表達(dá)量表現(xiàn)為波浪線的變化趨勢(shì)，由于本試驗(yàn)綠盲蝽為2齡初孵若蟲，其平均若蟲齡期為1.6、2.2、1.8和3.2 d（2—5齡若蟲）[28]，其表達(dá)量上升的時(shí)間正是綠盲蝽蛻皮的節(jié)點(diǎn)，一般來說，昆蟲蛻皮時(shí)其體內(nèi)的蛻皮激素含量較高。因此，綠盲蝽mRNA及蛋白表達(dá)量有明顯的齡期表達(dá)特性，即在其蛻皮時(shí)，表達(dá)量顯著上升。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量均可受到外源20E的誘導(dǎo)，呈現(xiàn)出表達(dá)量顯著上升的趨勢(shì)，再次證實(shí)了EcR是昆蟲蛻皮激素的作用靶標(biāo)，下一步的研究應(yīng)著重進(jìn)行20E的細(xì)胞膜受體的鑒定及其在20E信號(hào)傳導(dǎo)中的功能分析。

4 結(jié)論

獲得了AlEcR-A原核表達(dá)的純化蛋白，制備了高特異性的AlEcR-A單克隆抗體，進(jìn)一步明確了外源20E有誘導(dǎo)mRNA及蛋白表達(dá)的作用。

References

[1] Lu Y H, Wu K M, Jiang Y Y, Xia B, Li P, Feng H Q, Wyckhuys K A G, Guo Y Y. Mirid bug outbreaks in multiple crops correlated with wide-scale adoption of Bt cotton in China., 2010, 328(5982): 1151-1154.

[2] Lu Y H, Wu K M, Wyckhuys K A G, Guo Y Y. Overwintering hosts of(Hemiptera: Miridae)in northern China., 2010, 29(9): 1026-1033.

[3] Wu K M, Li W, Feng H Q, Guo Y Y. Seasonal abundance of the mirids,andspp. (Hemiptera: Miridae) on Bt cotton in northern China., 2002, 21(10): 997-1002.

[4] Lu Y H, Wu K M, Jiang Y Y, Guo Y Y, Desneux N. Widespread adoption of Bt cotton and insecticide decrease promotes biocontrol services., 2012, 487(7407): 362-365.

[5] Nedjoua Z, Noureddine S. Environmental risks of two chitin synthesis inhibitors on Gambsia affinis: chronic effects on growth and recovery of biological responses., 2011, 59: 106-113.

該工廠于3月份投產(chǎn)，目前生產(chǎn)板材厚度為2～35 mm。其日產(chǎn)量為650 m3，由此Action Tesa公司成為印度最大的MDF生產(chǎn)商，年產(chǎn)能 51.1 萬 m3。

[6] Li Y Q, Qin Y G, Yang N, Sun Y F, Yang X L, Sun R F, Wang Q M, Ling Y. Studies on insecticidal activities and action mechanism of novel benzoylphenylurea candidate NK-17., 2013, 8(6): e66251.

[7] Levine R B, Fahrback S E, Weeks J C. Steroid hormones and the reorganization of the nervous system during metamorphosis., 1991, 3(6): 437-447.

[8] Billas I M L, Browning C, Lawrence M C, Graham L D, Moras D, Hill R. The structure and function of ecdysone receptor//Smagghe G.. Springer, Berlin, 2009: 335-360.

[9] Riddiford L M, Cherbas P, Truman J W. Ecdysone receptors and their biological actions., 2000, 60: 1-73.

[10] Reinking J, Lam M M S, Pardee K, Sampson H M, Liu S, Yang P, Williams S, White W, Lajoie G, Edwards A, Krause H M. Thenuclear receptor E75 contains heme and is gas responsive., 2005, 122(2): 195-207.

[11] Riddiford L M, Hiruma K, Zhou X F, Nelson C A. Insights into the molecular basis of the hormonal control of molting and metamorphosis fromand., 2003, 33(12): 1327-1338.

[12] 郭恩恩, 李勝, 曹陽. 昆蟲蛻皮的激素網(wǎng)絡(luò)調(diào)控. 蠶業(yè)科學(xué), 2008, 34(2): 370-374.

[13] Spindler K D, H?nl C, Tremmel C, Braun S, Ruff H, Spindler-Barth M. Ecdysteroid hormone action., 2009, 66(24): 3837-3850.

[14] 武強(qiáng). 雙水相萃取分離免疫球蛋白和單克隆抗體研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2014.

WU Q. Separation of immunoglobulin and monoclonal antibody by aqueous two-phase extraction[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014. (in Chinese)

[15] Song N N, Ding W H, Chu S Y, Zhao J, Dong X, Di B B, Tang C S. Urotensin II stimulates vascular endothelial growth actor secretion from adventitial fibroblasts in synergy with angiotensin II.2012, 76(5): 1267-1273.

[16] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[17] Schluepmann H, Pellny T, van Dijken A, Semmkens S, Paul M. Trehalose 6-phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in., 2003, 100 (11): 6849-6854.

[18] 譚永安, 肖留斌, 孫洋, 柏立新. 綠盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表達(dá)、純化與酶學(xué)特性. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(17): 3587-3593.

Tan Y A, Xiao L B, Sun Y, Bai L X. Prokaryotic expression, purification and functional activity assayof soluble trehalse from, 2013, 46(17): 3587-3593. (in Chinese)

[19] 譚永安, 肖留斌, 柏立新, 孫洋. 綠盲蝽膜結(jié)合型海藻糖酶ALTre-2基因表達(dá)、純化及酶學(xué)特性. 棉花學(xué)報(bào), 2013, 25(5): 396-402.

Tan Y A, Xiao L B, Bai L X, Sun Y. Expression, purification and enzymatic activity of a membrane-bound trehalase gene from., 2013, 25(5): 396-402. (in Chinese)

[20] Hoskins R A, Carlson J W, Kennedy C, Acevedo D, Evans-Holm M, Frise E, Wan K H, Park S, Mendez-Lago M, Rossi F, Villasante A, Dimitri P, Karpen G H, Celniker S E.Sequence finishing and mapping ofheterochromatin., 2007, 316(5831): 1625-1628.

[21] Tan Y A, Xiao L B, Zhao J, Sun Y, Bai L X. Molecular and functional characterization of the ecdysone receptor isoform-A from the cotton mirid bug,(Meyer-Dür)., 2015, 574(1): 88-94.

[22] Tan Y A, Xiao L B, Zhao J, Xiao Y F, Sun Y, Bai L X. Ecdysone receptor isoform-B mediate soluble trehalase expression to regulate growth and development in the mirid bug,(Meyer-Dür)., 2015, 24(6): 611-623.

[23] Arbeitman M N, Hogness D S. Molecular chaperones activate theecdysone receptor, an RXR heterodimer., 2000, 101(1): 67-77.

[24] Kimura S, Sawatsubashi S, Ito S, Kouzmenko A, Suzuki E, Zhao Y, Yamagata K, Tanabe M, Ueda T, Fujiyama S, Murata T, Matsukawa H, Takeyama K, Yaegashi N, Kato S.arginine methyltransferase 1 (DART1) is an ecdysone receptor co-repressor., 2008, 371(4): 889-893.

[25] Sun Y N, An S H, Henrich V C, Sun X P, Song Q S. Proteomic identification of PKC-mediated expression of 20E-induced protein in., 2007, 6(11): 4478-4488.

[26] Jing Y P, Liu W, Wang J X, Zhao X F. The steroid hormone 20-hydroxyecdysone via non-genomic pathway activates Ca2+/calmodulin- dependent protein Ⅱ to regulate gene expression., 2015, 290(13): 8469-8481.

[27] Manabu K, Shuichiro T, Makoto K, Haruhiko F. Tissue-specific and stage-specific expression of two silkworm ecdysone receptor isoforms ecdysteroid-dependent transcription in cultured anterior silk glands., 1997, 248(3): 786-793.

[28] Lu Y H, Wu K M, Wyckhuys K A G, Guo Y Y. Temperature- dependent life history of the green plant bug,(Meyer-Dür) (Hemiptera: Miridae)., 2010, 45(3): 387-393.

（責(zé)任編輯 岳梅）

preparation of monoclonal antibody against AlEcR-A protein and its response induced by exogenous 20-hydroxyecdysone in

Tan Yongan1, Xiao LiuBin1, Hao Dejun2, Zhao Jing1, Sun Yang1, Bai Lixin1

(1Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014;2College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)

【Objective】The objectives of this study are to prepare the monoclonal antibody against ecdysone receptors protein and clarity the response ofunder exogenous ecdysterone hormone (20E) in.【Method】The vector containingwas double enzyme restricted byIandI, then the cDNA identified by sequencing was constructed to pCzn1 vector and transformed into Arctic express of. The target recombinant protein has over expressed and has been purified by using Ni-NTA agarose. BALB/c mice were immunized with the purified recombinant fusion protein. The spleen cells of mouse were fused with SP2/0 cells. Thespecificity of hybridoma cell line was characterized by ELISA and Western blot analysis. Finally, the mRNA relative expression and protein content of AlEcR-A treated with exogenous 20E by RT-PCR and Western blot were analyzed, respectively.【Result】The recombinant plasmid pCzn1-AlEcR-A was high-efficient expression in Arctic expresswhen induced by 37℃ and 5.0 mmol·L-1IPTG. The 55 kD target protein from the strain containing AlEcR-A was obtained by the Ni-NTA agarose. One hybridoma cell line, named 8H7, was obtained and characterized by ELISA and Western blot analysis, which could specifically combine with the total protein ofand recombinant protein of AlEcR-A. By using RT-PCR and Western blot analysis, both the mRNA relative expression and protein content ofwere remarkably increased after treating with 20E which compared with control.【Conclusion】the high specificity monoclonal antibody of AlEcR-A protein was obtained, and 20E could induce the mRNA and protein expressions of AlEcR-A.

; ecdysone receptor; 20E; monoclonal antibodies; expression level

2016-09-18；接受日期：2016-10-20

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD19B05）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31301668）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-18-16）、轉(zhuǎn)基因棉花環(huán)境安全性評(píng)價(jià)技術(shù)（2016ZX08011）、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金（611613）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(14)5026）

譚永安，E-mail：kellytan001@163.com。通信作者柏立新，E-mail：jaasblx@jaas.ac.cn