甘藍(lán)型油菜異三聚體G蛋白原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立

陳 云，于一帆，潘淑芬，周 研，葛會敏，劉立軍

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

甘藍(lán)型油菜異三聚體G蛋白原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立

陳 云，于一帆，潘淑芬，周 研，葛會敏，劉立軍

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

為建立甘藍(lán)型油菜異三聚體G蛋白各組分原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系，以油菜葉片為試材，從試材選取、平搖時(shí)間和聚乙二醇濃度方面優(yōu)化了油菜原生質(zhì)體制備條件和轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明，選取30 d苗齡葉片、平搖10 min時(shí)原生質(zhì)體游離狀態(tài)最佳，產(chǎn)量為10.73×106/mL，活力可達(dá)96.4%。采用30% PEG轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高。 Western Bolt的檢測分析表明，異三聚體G蛋白各組分均參與了甘藍(lán)型油菜對ABA的應(yīng)答反應(yīng)，當(dāng)ABA濃度分別為100，150，100，50 mmol/L時(shí)，BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1蛋白的表達(dá)量最高。

油菜；原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)；異三聚體G蛋白

異三聚體G蛋白(簡稱G蛋白)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核生物最為保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。G蛋白包括3個亞基(Gα、Gβ和Gγ)以及1個G蛋白調(diào)節(jié)蛋白(RGS蛋白)。目前，已經(jīng)在擬南芥、水稻、玉米、大豆、油菜等十幾種植物中發(fā)現(xiàn)了G蛋白。在模式植物擬南芥和水稻中的研究表明，G蛋白參與了植物生長發(fā)育的諸多過程，包括種子萌發(fā)、側(cè)根和頂端鉤形成、下胚軸生長、葉片伸展，在植物響應(yīng)生物和非生脅迫中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。Gao等[3-5]于2010年先后在甘藍(lán)型油菜中分離和鑒定出了G蛋白的α亞基、β亞基和γ亞基，江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2013年鑒定出了BnRGS1蛋白[6]。通過分析G蛋白組分在不同生長時(shí)期的表達(dá)特征，以及外源激素處理后G蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)G蛋白在不同組織器官和不同生長時(shí)期表達(dá)均有差異，各個亞基在響應(yīng)激素信號時(shí)其表達(dá)水平有差異，但有關(guān)G蛋白參與這些途徑的作用機(jī)制缺乏深入研究。本試驗(yàn)在前期已經(jīng)克隆得到G蛋白相關(guān)基因及獲得相應(yīng)抗體的工作基礎(chǔ)上，優(yōu)化了油菜原生質(zhì)體分離方法，建立了G蛋白組分的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系，并應(yīng)用以上體系，采用Western Blot檢測方法，初步分析了G蛋白對脫落酸(ABA)的響應(yīng)。以期為進(jìn)一步深入闡明G蛋白在油菜中的生理功能提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)揚(yáng)油6號，種子經(jīng)4 ℃春化48 h后，播種于土壤中，置于恒溫23 ℃、光照/黑暗 16 h/8 h的培養(yǎng)箱中生長，選取生長一定葉齡的油菜葉片作為提取原生質(zhì)體的外植體材料。轉(zhuǎn)化用G蛋白組分基因(BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1)重組質(zhì)粒為江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建留存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化 取40～50株植株，將其完全展開的葉片切成0.5～1.0 mm的小段，置于預(yù)處理液中，預(yù)培養(yǎng)20 min后，置于30 mL酶解液(0.25%纖維素酶，0.05%離析酶，0.6 mol/L甘露醇)中，25 ℃黑暗培養(yǎng)16 h，在水平搖床上40 r/min平搖以釋放原生質(zhì)體。收集原生質(zhì)體，用10 mL Wash溶液(0.154 mol/L NaCl，0.125 mol/L CaCl2·2H2O，0.005 mol/L KCl，0.005 mol/L葡萄糖，pH值 5.8)洗滌，1 000 r/min離心5 min沉淀原生質(zhì)體。用10 mL預(yù)冷的Wash溶液重懸原生質(zhì)體，冰浴30 min，1 000 r/min離心5 min。最后用500 μL MMG溶液(10.93% 甘露醇，0.304% MgCl2，4% MES)重懸原生質(zhì)體。使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將20 μg DNA，200 μL原生質(zhì)體，200 μL PEG/Ca2+溶液(9.1% 甘露醇，10% CaCl2，30% PEG 4000)輕輕混勻，室溫放置15 min。用W5溶液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH值5.7)洗過后重懸于預(yù)先用5%牛血清白蛋白包被過的含200 μL WI溶液(0.5 mol/L 甘露醇，4 mmol/L MES-KOH，pH值5.7，20 mmol/L KCl)的12孔板中，室溫溫育2 h以使質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

1.2.2 原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力測定 用W5溶液將純化的原生質(zhì)懸浮液稀釋至一定倍數(shù)，取10 μL滴在0.1 mm 血球計(jì)數(shù)板上，在10倍物鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的數(shù)量，重復(fù)3次。每毫升原生質(zhì)體數(shù)量=4個大方格中細(xì)胞數(shù)之和×2 500×稀釋倍數(shù)。

取10 μL純化的原生質(zhì)體與10 μL 0.02% FDA(熒光素雙醋酸)慢慢混勻，室溫靜置10 min，在ZEISS倒置熒光顯微鏡下檢查原生質(zhì)體活力。制備良好，具有活力的原生質(zhì)體呈圓形，發(fā)黃綠色熒光。統(tǒng)計(jì)每一視野中原生質(zhì)體總數(shù)和具有活性的原生質(zhì)體數(shù)，重復(fù)觀察20個視野。原生質(zhì)體活力=發(fā)黃綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/總原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.2.3 Western Blot 檢測蛋白表達(dá)量 收集原生質(zhì)體加入蛋白提取液(1 mL PBS，20 μL廣譜蛋白酶抑制劑，10 μL PMSF，1 μL DTT)，4 ℃渦旋振蕩30 min，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、雜交、洗膜、顯色后觀察條帶。油菜異三聚體G蛋白各組分蛋白抗體為本實(shí)驗(yàn)室留存(制備方法：克隆目的基因的全長序列，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，交由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司制備抗體)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜原生質(zhì)體制備體系的優(yōu)化

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的擬南芥[7-8]和油菜[9-11]原生質(zhì)體分離方法，制備獲得了活力為70%的原生質(zhì)體。為了進(jìn)一步提高原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量。本試驗(yàn)探討了材料選取和平搖時(shí)間對原生質(zhì)體提取的影響。

2.1.1 不同苗齡油菜葉片對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力受很多因素的影響，其中苗齡很重要。選取的材料從7 d的幼苗或下胚軸到30 d的葉片都有過報(bào)道，相對應(yīng)的依據(jù)也不盡相同，有的認(rèn)為選取幼嫩的組織細(xì)胞更容易破碎，原生質(zhì)體更易釋放，有的則認(rèn)為以苗齡更大一些的葉片為試材提取原生質(zhì)體不易破碎[12-14]。本試驗(yàn)就試材選取的時(shí)期做了如下對比：

在保持酶解條件一致的前提下，選取土培20 d的扇形葉片(圖1-A)作為材料提取原生質(zhì)體，原生質(zhì)體釋放不完全，大量原生質(zhì)體仍然積聚在葉條中，且釋放出來的原生質(zhì)體較小(圖1-B)。當(dāng)選取土培30 d的鋸齒形葉片時(shí)，原生質(zhì)體可以很好地釋放出來，光鏡下可以清晰看到分離良好并完整的原生質(zhì)體，大小合適，產(chǎn)量可達(dá)10.22×106/mL(圖1-C)。因此，本試驗(yàn)采用土培30 d的鋸齒形葉片為試材。

2.1.2 酶解后平搖時(shí)間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響 酶解后平搖是原生質(zhì)體提取中的一項(xiàng)重要操作，通過低轉(zhuǎn)速(40 r/min)的平搖可以將原生質(zhì)體從破碎的細(xì)胞中更好地釋放出來。

A.不同苗齡油菜葉片；B.原生質(zhì)體形態(tài)；C.原生質(zhì)體產(chǎn)量。A.Leaves of different seedling age；B.Morphology of protoplasts；C.Yield of protoplasts.

選取每5 min為1個時(shí)間間隔進(jìn)行鏡檢，關(guān)注分離的原生質(zhì)體數(shù)量及活力，結(jié)果顯示5 min時(shí)原生質(zhì)體完整度高，但釋放不完全，產(chǎn)量只有1.64×106/mL；10 min時(shí)原生質(zhì)體的數(shù)量最多(10.73×106/mL)，活力最高(96.4%)；20 min時(shí)原生質(zhì)體數(shù)量沒有明顯增多，但是可以觀察到部分原生質(zhì)體的圓度開始受到影響，甚至已經(jīng)有部分原生質(zhì)體開始破裂(圖2)，活力下降至69.7%。因此，10 min是制備原生質(zhì)體較佳的平搖時(shí)間。

A.原生質(zhì)體形態(tài)；B.原生質(zhì)體產(chǎn)量；C.原生質(zhì)體活力。A.Morphology of protoplasts；B.Yield of protoplasts；C.Viability of protoplasts.

2.2 PEG濃度對油菜原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響

本試驗(yàn)采用PEG/Ca2+法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)油菜原生質(zhì)體，設(shè)置PEG濃度分別為10%，20%，30%，40%和50%，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后提取蛋白質(zhì)(BnRGS1蛋白)經(jīng)Western Blot檢測轉(zhuǎn)化效率。由圖3-A可以看到：隨著PEG濃度的增加，蛋白表達(dá)量先上升后下降，PEG濃度為30%時(shí)蛋白表達(dá)量最高。觀察濃度分別為30%，40%和50% PEG處理后的原生質(zhì)體的形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)30% PEG處理后原生質(zhì)體形態(tài)基本可以保持完整，少量發(fā)生破裂；40%濃度處理后原生質(zhì)體發(fā)生皺縮，部分發(fā)生破裂；50%濃度處理后原生質(zhì)體大量破裂，內(nèi)容物流出(圖3-B)。因此，選取30% PEG濃度轉(zhuǎn)化效率最高。

采用30% PEG濃度，分別將含有BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜原生質(zhì)體，用Western Blot檢測其蛋白表達(dá)量。由圖4可以看出：內(nèi)參Actin均可穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體中對應(yīng)蛋白的表達(dá)量均高于野生型，說明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體。

A.蛋白表達(dá)量；B.原生質(zhì)形態(tài)。A.Expression of protein；B.Morphology of protoplasts.

圖4 Western Blot檢測轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體中BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1表達(dá)量Fig.4 Expression of BnGA1，BnGB1，BnGG2 and BnRGS1 proteins in transgenic protoplasts

2.3 BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1對外源ABA的響應(yīng)

ABA可以顯著促進(jìn)BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1基因的表達(dá)[3-6]，表明G蛋白組分參與了油菜對ABA信號的響應(yīng)。本試驗(yàn)用不同濃度的ABA處理轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體24 h，用Western Blot檢測原生質(zhì)體中G蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明：BnGA1蛋白的表達(dá)量隨著ABA濃度增加而增加，在100 mmol/L ABA時(shí)達(dá)到最高，之后下降。BnGB1蛋白的表達(dá)量在ABA濃度為150 mmol/L時(shí)達(dá)到最高。低濃度的ABA(50～100 mmol/L) 時(shí)，BnGG2蛋白的表達(dá)量增加，在高濃度的ABA處理(150～200 mmol/L)下表達(dá)水平下降，在100 mmol/L ABA處理時(shí)表達(dá)量最高。BnRGS1蛋白表達(dá)量在ABA濃度為50 mmol/L時(shí)最大(圖5)。以上結(jié)果表明，G蛋白的各組分均參與了甘藍(lán)型油菜對植物激素的應(yīng)答反應(yīng)。

圖5 ABA處理對轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體G蛋白組分表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ABA on expression of components of G protein in transgenic protoplasts

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，為油菜異三聚體G蛋白功能研究提供研究載體。試驗(yàn)采用酶解法提取油菜原生質(zhì)體，PEG-Ca2+介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。但是直接進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)遇到了原生質(zhì)體釋放不充分、原生質(zhì)體大量嚴(yán)重破裂、轉(zhuǎn)化效率低等一系列問題。因此，在前人的基礎(chǔ)上，從試材的選取、酶解后平搖的時(shí)間和PEG濃度這幾個方面進(jìn)行了條件優(yōu)化。

無菌培養(yǎng)的幼苗子葉、下胚軸、黃化苗及生長不同時(shí)間的真葉都可以作為原生質(zhì)體游離的外殖體[12-14]。利用下胚軸或黃化苗作為外殖體，當(dāng)報(bào)告基因?yàn)镚FP或熒光素基因時(shí)，可以有效避免葉綠素自發(fā)熒光的干擾。本試驗(yàn)采用Western Blot檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，不需考慮葉綠素自發(fā)熒光的干擾。

苗齡越大，葉片表面角質(zhì)層和細(xì)胞壁發(fā)育越充分，葉片組織結(jié)構(gòu)越緊密，不利于酶與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的接觸，而使酶解效率降低，原生質(zhì)體產(chǎn)量較低。相反苗齡越小，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)較疏松，酶解較充分，但產(chǎn)生的原生質(zhì)體容易破裂，導(dǎo)致原生質(zhì)體活力下降[15-17]。在擬南芥中，生長21～28 d的第5～7片真葉是提取原生質(zhì)體最佳材料[8]。本試驗(yàn)選取土培30 d左右的鋸齒形葉片進(jìn)行原生質(zhì)體提取，原生質(zhì)體可以很好地釋放出來，產(chǎn)量可達(dá)10.22×106/mL。較幼嫩(20 d)葉片的原生質(zhì)體釋放不完全，產(chǎn)量不高，且酶解釋放出的原生質(zhì)體易破碎，活力低。

酶解后低速平搖可以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放[18]，由于沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，機(jī)械搖晃對釋放出的原生質(zhì)體可能造成損傷，致使破裂或活力下降。因此，合理控制平搖時(shí)間對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有重要影響。在本試驗(yàn)條件下，平搖10 min原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力最高，是較佳的平搖時(shí)間。

PEG/Ca2+介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)最常用的方法。PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響因不同植物試材和不同外源DNA而異，濃度自20%～50%均有報(bào)道[19-21]。本試驗(yàn)對甘藍(lán)型油菜研究的結(jié)果表明，PEG濃度為30%時(shí)轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的表達(dá)量最高，轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體形態(tài)可以基本保持完整。因此，采用以上優(yōu)化的條件進(jìn)行試驗(yàn)可以提取出完整度好、數(shù)量多的原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后在不破壞原生質(zhì)體形態(tài)的情況下可以達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化效率。

采用以上優(yōu)化的條件，有效地分離了甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體，成功轉(zhuǎn)化得到了油菜異三聚體G蛋白各組分的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系，經(jīng)Western Blot檢測功能蛋白均有效表達(dá)，G蛋白各組分對ABA信號的響應(yīng)存在劑量效應(yīng)。上述測試結(jié)果為深入研究油菜G蛋白功能提供了良好的試材依據(jù)。

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Establishment of Heterotrimeric G Protein Gene Protoplast Transient Expression System in Brassica napus

CHEN Yun，YU Yifan，PAN Shufen，ZHOU Yan，GE Huimin，LIU Lijun

(Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

To establish the protoplast transient expression system of the components of heterotrimeric G protein inBrassicanapus，the key factors in protoplast preparation and transformation including explant，flat rolling time and polyethylene glycol(PEG) concentration were optimized.The results showed that the best yield and viability of protoplasts were 10.73×106/mL and 96.4% respectively，with the optimum conditions as 30 days seedling age and 10 min rolling time.The expression of target proteins reached the maximum with 30% PEG.The responses of G protein to ABA were investigated using the protoplast transient system by Western Blot detection.The highest expression levels of BnGA1，BnGB1，BnGG2 and BnRGS1 were observed when the ABA concentration was 100，150，100，50 mmol/L，respectively.

Brassicanapus；Protoplast transient expression；Heterotrimeric G protein

2016-07-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371562；30970249)

陳 云(1973-)，女，江蘇東臺人，副教授，博士，主要從事植物生理與生化研究。

劉立軍(1973-)，男，江蘇泗陽人，教授，博士，主要從事作物栽培生理研究。

S565.03；Q819

A

1000-7091(2016)06-0021-05

10.7668/hbnxb.2016.06.004