RNA-Seq技術(shù)在白念珠菌致病機理研究中的應(yīng)用

劉建釵，柳煥章，劉彥威,3，閆金坤,3，張鶴平，蘇敬良

RNA-Seq技術(shù)在白念珠菌致病機理研究中的應(yīng)用

劉建釵1,2,3，柳煥章2，劉彥威2,3，閆金坤2,3，張鶴平2，蘇敬良1

本文介紹了白念珠菌及其所致疾病的特點，闡述了白念珠菌致病機制的復(fù)雜性和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)的優(yōu)勢，回顧了RNA-Seq技術(shù)在白念珠菌致病機理研究中的應(yīng)用情況，分析了以往研究中存在的不足，展望了此類研究未來的可能發(fā)展趨勢?？傊?，RNA-Seq技術(shù)的不斷改進(jìn)并用于白念珠菌致病機理的深入研究將會帶來令人矚目的成就。

白念珠菌；致病機理；RNA-Seq

白念珠菌(Candidaalbicans，CA)是一種自然界普遍存在的條件致病真核微生物[1-2]。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的念珠菌中，白色念珠菌在臨床上最為常見，毒力最強[3-4]；白念珠菌宿主范圍很廣，在一定條件下可以感染人類、哺乳動物、禽類和無脊椎動物等；白念珠菌存在于健康機體的體表、消化道、呼吸道和生殖道等處，正常情況下不致病，但由于體內(nèi)外不利因素而引起免疫力下降時，可導(dǎo)致念珠菌大量繁殖而致病[1,3]。近年來，由于環(huán)境污染、化學(xué)治療以及廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等的應(yīng)用越來越廣泛，導(dǎo)致人和動物真菌感染率不斷增加[5]，尤其在機體免疫功能低下者當(dāng)中，白念珠菌可導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至致命的系統(tǒng)性感染[6-7]。雖然目前有多種抗真菌治療手段，但系統(tǒng)性念珠菌病仍有較高的致死率。例如，在院內(nèi)獲得性感染中，由念珠菌所引起的占第4位，其致死率達(dá)50%[8]，其中尤以白念珠菌感染率最高。為了對白念珠菌病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷、靶標(biāo)定位、藥物開發(fā)和有效防治，必須要探究該病的發(fā)病機理，尤其要深入研究致病過程的分子機制。鑒于白念珠菌致病機制的復(fù)雜性和新一代高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢，這里將轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)及其在白念珠菌致病機理研究中的應(yīng)用情況加以綜述，并對未來可能的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

1 白念珠菌致病機制的復(fù)雜性

1.1 基因組廣泛可塑性和種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜性 幾種不同的分子分型方法(MLST、MLMT和DNA fingerprinting等)已經(jīng)產(chǎn)生了大量有關(guān)白念珠菌流行病學(xué)和群體結(jié)構(gòu)的信息。例如，在白念珠菌多位點序列分型數(shù)據(jù)庫(Candida albicans MLST Databases)中公布的序列型(STs)就多達(dá)3 210個，而且絕大部分是來源于人，動物來源的很少。這些研究揭示了白念珠菌群體是由多重主要和次要的分支構(gòu)成，其中的一些顯示出地理或表型富集。雖然該菌是以無性繁殖為主，但重組致雜合性丟失、準(zhǔn)性生殖循環(huán)、大范圍非整倍體容忍和單倍體菌株生存都證明了白念珠菌基因組的廣泛可塑性。在壓力環(huán)境條件下，重組和總?cè)旧w重排更加普遍，對于這種機會致病菌的進(jìn)化起著重要作用。此外，白念珠菌基因家族的擴張對該菌的毒力具有重要意義[9]。

根據(jù)CGD數(shù)據(jù)庫(Candida Genome Database)最新記錄，僅在標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314基因組中已發(fā)現(xiàn)12 405個編碼基因開放閱讀框(ORFs)，其中得到證實的3 260個(26.28%)，存疑的303個(2.44%)，未定性的8 842個(71.28%)，占大多數(shù)；而包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、ncRNA和各類重復(fù)序列、著絲粒、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、假基因、封閉閱讀框在內(nèi)的基因和序列只發(fā)現(xiàn)875個，其中非編碼RNA(ncRNA)序列僅10個?？梢姡瑢τ谝寻l(fā)現(xiàn)的ORFs、ncRNA和其它序列大部分的功能、表達(dá)和調(diào)控方式等都是未知的；從以往研究結(jié)果可以推測，在自然界存在的白念珠菌種群中仍有大量的差異基因、功能序列和新基因型尚未被發(fā)現(xiàn)，它們的功能、結(jié)構(gòu)、調(diào)控機制和流行病學(xué)特點都需要發(fā)掘。

白念珠菌基因組廣泛的可塑性和種群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了該物種具有豐富多樣的基因型和表現(xiàn)型；作為適應(yīng)性強、宿主范圍廣的機會致病真菌，白念珠菌具有非常復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些典型的生物學(xué)特征賦予了該物種強大的致病能力和復(fù)雜的致病機制。

1.2 雙重生活方式與條件致病性 白念珠菌通常以無害的酵母方式與其他微生物群共棲于大部分人的黏膜表面，只有在特定條件下(正常菌群失衡、免疫抑制、組織屏障損傷等)才能導(dǎo)致表面侵染或威脅生命的系統(tǒng)感染。幾乎所有的白念珠菌侵染都是內(nèi)源性的，由宿主自身微生物群的共棲菌株引起。Liu H指出，白念珠菌共棲和致病的雙重生活方式與其形態(tài)可塑性有關(guān)。白念珠菌用一套共同的保守途徑調(diào)控二態(tài)性、交配和表型轉(zhuǎn)換。已知調(diào)控二態(tài)性的主要途徑包括通過Cph1的促分裂原活化蛋白(MAP)激酶途徑、通過Efg1的cAMP依賴蛋白激酶途徑和通過Rfg1 和 Nrg1由Tup1調(diào)節(jié)的抑制途徑。Cph1調(diào)控的MAP激酶途徑對交配過程很重要，而這三條途徑都與white-opaque轉(zhuǎn)換的調(diào)控有關(guān)。所有這些發(fā)育途徑調(diào)控著菌絲專一和相專一基因的表達(dá)；大部分菌絲專一基因和相專一基因編碼的蛋白直接或間接有助于白念珠菌的致病作用和毒力。因此，白念珠菌毒力基因與細(xì)胞形態(tài)發(fā)生是被共同調(diào)控的。從這個結(jié)論也可以推測，白念珠菌共棲和致病的獨特表現(xiàn)可能在于二態(tài)性和表型轉(zhuǎn)換的發(fā)展過程[10]。盡管進(jìn)行了大量的研究，但從無害的共棲菌向侵染性的病原菌轉(zhuǎn)化機制問題仍然不清楚[11-15]。

1.3 致病因子多樣性與互作 目前已知的白念珠菌致病相關(guān)因子包括形態(tài)可塑性、黏附和侵入、分泌水解酶類、生物膜形成、群體感應(yīng)、溶血性、免疫逃避與細(xì)胞損傷、觸感與向觸性、pH感知與應(yīng)變、代謝適應(yīng)、環(huán)境脅迫反應(yīng)、熱休克蛋白和金屬元素獲得等方面[16-20]。這些因素之間還存在各種復(fù)雜聯(lián)系，例如形態(tài)可塑性與細(xì)胞疏水性、黏附、侵入、分泌水解酶類、生物膜形成、群體感應(yīng)、免疫逃避與細(xì)胞損傷、向觸性、pH感知與應(yīng)變和環(huán)境脅迫反應(yīng)等都有一定關(guān)系。盡管許多白念珠菌毒力因子已經(jīng)被描述，但在不同的侵染類型和階段中它們的精確作用仍然是一個激烈爭論的話題[21]。

1.4 病原與宿主互作 白念珠菌病的發(fā)生既受白念珠菌的致病力的影響也受宿主易感性的影響。一方面，在白念珠菌病的發(fā)病過程中，病原對宿主組織的侵染是致病的一個重要步驟，但并非所有的白念珠菌菌株具有相同的侵染和毒力特性。例如，臨床菌株SC5314是侵染菌株，而ATCC10231是非侵染菌株，與前者相比其侵染能力極弱[22]。另一方面，不同宿主種類、同種宿主的不同個體和同一個體的不同狀態(tài)對白念珠菌的易感性可能不同，會產(chǎn)生各種不同的宿主免疫應(yīng)答。最終宿主發(fā)病與否、發(fā)病類型與程度是兩者共同作用的結(jié)果[23]。有研究表明，在適當(dāng)?shù)倪x擇壓力下，即使中心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)也可能很快重建。例如，白念珠菌無菌絲突變體cph1Δ/efg1Δ在巨噬細(xì)胞吞噬體中敵對環(huán)境的連續(xù)選擇壓力下，在較短時限內(nèi)通過菌絲形成進(jìn)化而具有逃避巨噬細(xì)胞的能力[24]。

Cottier F和Pavelka N指出，宿主-真菌互作的復(fù)雜性起始于呈現(xiàn)在真菌細(xì)胞壁上的多種病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，它們被幾類宿主細(xì)胞表達(dá)的多重病原識別受體(PRRs)所識別。PAMP-PRR互作引起各種胞內(nèi)信號途徑，導(dǎo)致一系列廣泛的免疫應(yīng)答，其中一些促使真菌清除，而其它一些有助于致病。由于許多正常共棲在宿主胃腸道的細(xì)菌產(chǎn)生一些分子，或直接調(diào)節(jié)白念珠菌的生存和毒力，或間接調(diào)節(jié)宿主的抗真菌免疫應(yīng)答。更加復(fù)雜的是，這種宿主-微生物組-真菌互作表現(xiàn)出動態(tài)系統(tǒng)特征，其中白念珠菌能在不同時間輕易進(jìn)行不同形態(tài)間的轉(zhuǎn)變，不同形態(tài)會產(chǎn)生不同的PAMPs。此外，白念珠菌能夠快速積累基因組的改變，進(jìn)一步修改其免疫系統(tǒng)的識別位點、毒力和對抗真菌藥物的抗性。因此，只基于現(xiàn)有可用的分子數(shù)據(jù)，很難構(gòu)建一種系統(tǒng)的模型來解釋共棲和毒性之間的平衡，并預(yù)測白念珠菌侵染的結(jié)果[25]。

1.5 病原與藥物相互作用 由于白念珠菌致病因子的多樣性，需要針對性地研發(fā)各種抗菌藥物，而不同類別抗菌藥物的靶標(biāo)和作用機制各不相同；經(jīng)抗真菌藥物治療以后，白念珠菌可能經(jīng)歷微進(jìn)化，導(dǎo)致抗藥性的出現(xiàn)。然而，這種真菌的微進(jìn)化適應(yīng)能力超過了抗真菌藥物的研發(fā)[24]。白念珠菌耐藥的分子機制復(fù)雜多樣，呈現(xiàn)出多靶點、多層級水平的變化，針對不同類甚至同一類的不同種藥物，白念珠菌都可能產(chǎn)生與其對應(yīng)的耐藥途徑[26]。

1.6 侵染方式多樣性與轉(zhuǎn)化 白念珠菌可以引起兩類不同的念珠菌病，即黏膜皮膚性感染和散播性感染。前者主要導(dǎo)致黏膜上皮或皮膚的局部感染，如口咽(鵝口瘡)、外陰陰道、消化道黏膜等白念珠菌??；后者主要是通過血液散播的系統(tǒng)白念珠菌病，一般分為三個階段：經(jīng)血液傳播、穿過內(nèi)皮從血液遷出和侵染深部器官[23]。此外，局部感染在一定條件下可以轉(zhuǎn)變?yōu)橄到y(tǒng)感染。為完成這種轉(zhuǎn)化，白念珠菌必須通過活躍的物理障礙(如上皮細(xì)胞層)穿透作用和(或)誘導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入血液。一旦進(jìn)入血液，白念珠菌就可傳遍整個機體，常造成多器官感染[22]。

由于白念珠菌致病機制的復(fù)雜性，需要人們對此進(jìn)行廣泛而深入的研究。目前雖然對白念珠菌致病的分子和細(xì)胞機制的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但對于致病過程缺乏一種有關(guān)病原和宿主的全基因組動態(tài)規(guī)律的認(rèn)識。

2 RNA-Seq技術(shù)與致病機理研究

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法與RNA-Seq技術(shù) 轉(zhuǎn)錄組是生物體特定組織或細(xì)胞在某一特定發(fā)育階段、功能狀態(tài)或環(huán)境條件下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(ncRNA)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究某一特定轉(zhuǎn)錄組中全部轉(zhuǎn)錄本的種類、結(jié)構(gòu)、功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。由于轉(zhuǎn)錄組具有基因組和蛋白質(zhì)組的“橋梁”作用，使得轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來并得到廣泛的應(yīng)用[27-29]。目前用于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得和分析的技術(shù)平臺主要有Microarray、SAGE、MPSS和RNA-Seq等[30]。

轉(zhuǎn)錄組測序(transcriptome sequencing，RNA-Seq)是近年來發(fā)展起來并不斷更新的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，它是把mRNA、small RNA 和ncRNA的全部或部分采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序和分析的技術(shù)。與傳統(tǒng)的Sanger測序法和基因芯片技術(shù)相比，RNA-Seq具有諸多優(yōu)點。①檢測信號數(shù)字化、分辨率和靈敏度高：無交叉反應(yīng)和背景噪音，可直接測定每個轉(zhuǎn)錄本序列，區(qū)分單個堿基差異、同基因家族相似基因、可變剪切位點及cSNP、UTR區(qū)域等；能夠檢測到細(xì)胞中僅有幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本。②檢測范圍廣：可檢測到6個數(shù)量級以上的動態(tài)范圍，能夠同時鑒定和定量正常轉(zhuǎn)錄本、超表達(dá)轉(zhuǎn)錄本和低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本；能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，無需了解物種基因信息和設(shè)計特異性探針；能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本，豐富基因組和轉(zhuǎn)錄組信息。③重復(fù)性好、樣本消耗少：測定準(zhǔn)確度高，無需技術(shù)重復(fù)，因而對起始樣本需求量少，尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析[27]。由此可見，RNA-Seq 技術(shù)能夠在轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究、轉(zhuǎn)錄本變異研究、基因表達(dá)水平研究、非編碼區(qū)域功能研究和低豐度轉(zhuǎn)錄本研究等領(lǐng)域發(fā)揮較大的作用[30-31]。目前，該技術(shù)已在人類、鼠、擬南芥、洋槐、葡萄、裂殖酵母和芽殖酵母等生物中得到應(yīng)用，并獲得了很多有用的生物學(xué)信息，推動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的進(jìn)展[32]。

2.2 RNA-Seq用于白念珠菌致病機理研究的必要性 過去對白念珠菌致病機制的研究多傾向于從病原的個別致病因子或宿主內(nèi)外環(huán)境因子入手，得到的結(jié)果往往具有孤立性和片面性。例如，就某一菌株致病力進(jìn)行研究時，如果僅僅從某一種毒力因子的試驗結(jié)果來判斷該菌株的致病力就會出現(xiàn)偏差，甚至可能得出錯誤的結(jié)論。Sascha Thewes等研究表明，一些白念珠菌菌株的毒力差異并不是由于缺乏某些特定基因，而是由于某些普通基因表達(dá)、功能或活性的差異[22]。從白念珠菌致病機制的復(fù)雜性來看，若要全面深入地了解白念珠菌的基本生物學(xué)信息和致病機理，必須對來源不同、遺傳差異的各種菌株進(jìn)行廣泛的研究，并在各種不同的體內(nèi)外環(huán)境條件下對白念珠菌進(jìn)行功能基因組學(xué)方面的深入研究。

作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的新技術(shù)，RNA-Seq具有獨特的優(yōu)勢和強大的功能，具有高通量、高特異性、高敏感性、動態(tài)性、開放性和數(shù)字化的特點。該技術(shù)能夠滿足白念珠菌致病機理研究中不同菌株、環(huán)境、宿主、生態(tài)位、生長期或侵染期之間的轉(zhuǎn)錄組比較和分析的要求；對活體組織或混合樣本中的低豐度真菌RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析[33]；對病原、宿主和微生物群進(jìn)行雙重或多重轉(zhuǎn)錄組分析[34]；能夠區(qū)分編碼基因與非編碼基因在致病過程中的作用；能夠分析個別基因在特定情況下的轉(zhuǎn)錄水平及其對致病作用的貢獻(xiàn)；能夠在轉(zhuǎn)錄組水平整體上把握白念珠菌致病過程中的基因表達(dá)與調(diào)控。此外，Dale Muzzey等應(yīng)用RNA-Seq和核糖體分析技術(shù)，分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對二倍體酵母白念珠菌進(jìn)行等位基因特異表達(dá)(ASE)測定。他們發(fā)現(xiàn)來自翻譯與轉(zhuǎn)錄水平的ASEs在受影響基因數(shù)和差異大小上都是相似的?；谝幌盗械膶傩詫⒌任换騾?shù)化，發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點和預(yù)測的mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與翻譯水平的順式ASE有關(guān)[35]。這說明轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果與蛋白質(zhì)組在很大程度上具有一致性。綜上所述，RNA-Seq技術(shù)是可以作為白念珠菌致病機理研究的強大工具。

2.3 RNA-Seq用于白念珠菌致病機理研究的現(xiàn)狀 RNA-Seq技術(shù)在白念珠菌研究中的應(yīng)用時間較短。2010年Vincent M. Bruno等首先用RNA-Seq方法在幾種不同的環(huán)境條件下試驗，生成一個白念珠菌轉(zhuǎn)錄組高分辨率映射圖。他們對這些不同條件下的所有轉(zhuǎn)錄區(qū)進(jìn)行定量測定，鑒定出602個新的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(TARs)和許多新內(nèi)含子，這些在當(dāng)下的基因組注釋中沒有被描述。有趣的是，這些TARs的表達(dá)許多是以條件專一的方式被調(diào)控。這種全面的轉(zhuǎn)錄組分析顯著提升了白念珠菌原有基因組注釋的水平，為全面認(rèn)識這種重要的真核致病菌的分子致病機制提供了必要的框架[36]。隨后，許多學(xué)者相繼采用RNA-Seq技術(shù)對白念珠菌致病機理進(jìn)行了多方面的研究。

2.3.1 致病因子及其互作 Christian Grumaz等為了深入了解白念珠菌和都柏林念珠菌形態(tài)發(fā)生的不同路徑，通過cDNA深度測序的方法研究了兩者轉(zhuǎn)錄組的定性和定量差異。將他們的注釋與公開可用的白念珠菌和都柏林念珠菌基因模型比較，確證了約95%已經(jīng)預(yù)測的基因，也揭示了這兩種菌當(dāng)下未知的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)(TARs)。RNA-Seq定量轉(zhuǎn)錄組分析表明，兩個種之間直系同源物的表達(dá)存在顯著差異。他們界定了一個這兩種菌都需要的含84個菌絲特異基因的核心子集，還有42個基因在白念珠菌菌絲形態(tài)發(fā)生中被特異誘導(dǎo)[37]。他們的研究方法為相近的病原菌種類或同種病原菌的不同菌株類型之間的轉(zhuǎn)錄組比較分析提供了借鑒。

Denes Hnisz等采用ChIP-Seq和RNA-Seq結(jié)合的方法研究表明，Set3C在白念珠菌中是作為代謝和形態(tài)發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔助因子，并確定了Set3C在白念珠菌酵母細(xì)胞和菌絲細(xì)胞全基因組中調(diào)控的靶基因。他們發(fā)現(xiàn)CaSet3C與釀酒酵母的同系物相似，專門修飾編碼區(qū)，與高轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。然而在菌絲誘導(dǎo)條件的短暫時期，Set3C通過調(diào)節(jié)4種相專一性轉(zhuǎn)錄因子基因(BRG1,TEC1,NRG1,EFG1)的轉(zhuǎn)錄水平，延遲了菌絲特異基因的表達(dá)。由此可見，在白念珠菌中Set3C既是轉(zhuǎn)錄的活化物又是轉(zhuǎn)錄的阻遏物[38]。

李立平等用白念珠菌SC5314和2.538菌株的酵母型和菌絲型樣品分別構(gòu)建sncRNA轉(zhuǎn)錄組深度測序文庫，通過Hiseq2000測序系統(tǒng)測序；將測序結(jié)果用Cufflinks軟件包分析酵母型與菌絲型菌株樣品間ncRNAs表達(dá)譜的差異，從而鑒定與白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換相關(guān)的ncRNAs。結(jié)果，在菌株SC5314中檢測到21個與形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)的ncRNA；在菌株2.538中檢測到60個與形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)的ncRNA；在兩個菌株中同時檢測到與形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)的ncRNA共有17個[39]。此方法可作為白念珠菌基因組非編碼序列的功能和致病過程的關(guān)系研究方面的參考。

孫靜等應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對白念珠菌生物膜形成的分析表明，在細(xì)胞與附著表面接觸30min內(nèi)即可發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的差異。結(jié)合白念珠菌滯留菌水平在早期階段生物膜(0-2 h)中的變化趨勢，共有228個基因被初步確認(rèn)可能與白念珠菌生物膜滯留菌形成相關(guān)。在生物膜形成早期階段(0-2 h)，基因表達(dá)變化趨勢與白念珠菌滯留菌形成變化趨勢一致的基因約有97個，與白念珠菌滯留菌形成變化趨勢相反的基因約有131個[40]。此方法可用于白念珠菌生物膜形成分子機制的研究。

發(fā)熱是宿主對感染的普遍反應(yīng)，白念珠菌已經(jīng)進(jìn)化出對熱感知和應(yīng)答的復(fù)雜通路。Michelle D. Leach等利用RNA-seq和ChIP-seq發(fā)現(xiàn)，熱休克轉(zhuǎn)錄因子Hsf1結(jié)合在核小體稀少的啟動子區(qū)的不同基序，調(diào)節(jié)白念珠菌熱休克基因和相關(guān)毒力的基因，結(jié)果熱應(yīng)激增強了白念珠菌對宿主細(xì)胞的黏附、損傷和毒力；在基礎(chǔ)和熱應(yīng)激條件下Hsf1的激活依賴于分子伴侶Hsp90。研究表明，Hsp90通過調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答基因啟動子上的核小體水平來控制整體轉(zhuǎn)錄過程。所以，白念珠菌通過Hsf1和Hsp90協(xié)調(diào)基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的溫度應(yīng)答機制，從而產(chǎn)生溫度適應(yīng)和其它毒力[41]。

以上僅列舉了利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究白念珠菌致病因子的幾個事例，實際上該技術(shù)完全可以推廣到其它致病因子的研究上，尤其用于多種致病因子及其互作關(guān)系的研究，更能發(fā)揮RNA-seq技術(shù)高通量和綜合性分析的優(yōu)勢。

2.3.2 白念珠菌與宿主相互作用 Lanay Tierney等采用同步RNA-Seq技術(shù)，在樹狀突細(xì)胞的吞噬作用過程中，按照時間段對白念珠菌和小鼠全基因組的基因表達(dá)動力學(xué)進(jìn)行了量化。通過NetGenerator處理這個數(shù)據(jù)集，產(chǎn)生一個強有力的網(wǎng)絡(luò)推斷圖，預(yù)測了宿主與抗原之間新的互作關(guān)系[42]。Sylvie Schulze等通過擴展NetGenerator算法解釋病原-宿主互作(PHI)的特點。他們把白念珠菌與小家鼠樹狀突細(xì)胞一起培養(yǎng)，基于雙重RNA-Seq數(shù)據(jù)對方差合并法進(jìn)行評估，并通過預(yù)測以前查明的PHIs為魯棒交互來驗證他們的方法[43]。

Vincent M. Bruno等用RNA-Seq方法鑒定了外陰陰道念珠菌病(VVC)發(fā)病早期的小鼠陰道和真菌的轉(zhuǎn)錄組。通過小鼠在感染和非感染時的差異表達(dá)基因路徑分析預(yù)測出幾個以前未與VVC聯(lián)系的信號途徑的激活和抑制，包括NLRP3炎性體的激活。此外發(fā)現(xiàn)，白念珠菌菌絲相關(guān)SAP4-6強烈表達(dá)，而它們是已知的炎性體激活劑。盡管定植方面與野生型菌株相似，ΔSAP4-6三重突變株和ΔSAP5單突變株在陰道內(nèi)接種誘發(fā)的多形核白細(xì)胞(PMNs)和IL-1β顯著減少[44]。這項研究證明了炎性體在VVC免疫發(fā)病機理中的一種新作用，并暗示在VVC期間菌絲相關(guān)SAPs作為主要的白念珠菌毒力決定因素。

Yaoping Liu等用RNA-Seq技術(shù)鑒定了在體外侵染時白念珠菌和人內(nèi)皮細(xì)胞或口腔上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出幾個激活的信號途徑，以前并沒有發(fā)現(xiàn)它們與宿主對病原真菌的反應(yīng)有關(guān)。他們用siRNA敲除的方法確定這些途徑中的2個(PDGFBB和NEDD9)通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對白念珠菌的攝取來控制宿主-病原互作。用RNA-Seq分析血液散播念珠菌病(HDC)鼠模型和人外陰念珠菌病(VVC)發(fā)作期，發(fā)現(xiàn)在黏膜性VVC和(或)散播性HDC體內(nèi)侵染中有許多相同的信號途徑被激活[45]。

Sara Amorim-Vaz等研發(fā)了一種高分辨率定量分析白念珠菌轉(zhuǎn)錄組的方法，轉(zhuǎn)錄組來自早期和晚期階段系統(tǒng)感染的兩個不同宿主模型(小鼠和大蠟螟)。結(jié)果表明，RNA-Seq數(shù)據(jù)豐富了真菌轉(zhuǎn)錄本，達(dá)到生物素化誘餌探針捕獲白念珠菌序列的1600倍。盡管鑒定出一些宿主和時間點特定基因，但在對兩種宿主和兩個時間點的侵染中該真菌的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答表現(xiàn)出驚人的相似。在侵染中被強烈誘導(dǎo)的基因涉及脅迫應(yīng)答、黏附、鐵吸收和生物膜形成等[46]。該研究使用的真菌RNA富集程序?qū)⒂兄诟玫罔b定在感染宿主中白念珠菌的應(yīng)答，并可用于其它微生物病原體。

在自然侵襲或臨床感染中，白念珠菌生長在宿主特定的內(nèi)環(huán)境并與宿主進(jìn)行復(fù)雜的免疫反應(yīng)，其生長狀態(tài)和基因表達(dá)與體外差異很大。因此，致病機理研究的理想樣本應(yīng)來自感染狀態(tài)下的組織或其它原位材料。在這類材料中病原物或檢測對象的含量往往很低，對分辨率低的研究方法帶來很大困難。而這里可以充分發(fā)揮RNA-seq敏感度高、特異性強的優(yōu)勢，同時完成雙重或多重轉(zhuǎn)錄組的測定，并可進(jìn)行病原-宿主互作網(wǎng)絡(luò)分析。

2.3.3 白念珠菌與藥物相互作用 Nuo Sun等在研究白念珠菌線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ι(CI)突變體與唑類藥物敏感性的關(guān)系時，選擇了兩個對氟康唑過敏的CI無效突變株goa1Δ和 ndh51Δ，用RNA-Seq方法對其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，兩者(尤其goa1Δ)都顯著下調(diào)了編碼外排蛋白的基因CDR1和CDR2。另外，呼吸作用與突變株對唑類藥物的敏感性有關(guān)，外排基因下調(diào)可能是呼吸功能障礙的結(jié)果。然而，另一些突變體特異的變化也可能增加這些白念珠菌突變株對唑類的敏感性[47]。

Sanjiveeni Dhamgaye等用RNA-Seq分析白念珠菌藥物抗性(CDR)菌株和同基因型的藥物敏感菌株的轉(zhuǎn)錄組，揭示了228個基因的差異表達(dá)。其中包括：以前鑒定的有關(guān)CDR基因；以前沒有鑒定的CDR表型相關(guān)基因；基因功能尚未鑒定的新轉(zhuǎn)錄本。他們首次提出了CDR的獲得與編碼基因為CZF1的轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)有關(guān)[48]。

為了鑒定白念珠菌生物膜細(xì)胞對通用抗真菌藥物咪康唑抗性的分子途徑，Kaat De Cremer等采用RNA-seq完成了咪康唑處理的白念珠菌生物膜的全轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果，在咪康唑處理的生物膜細(xì)胞中，涉及甾醇合成的基因和編碼藥物外排泵的基因被高度誘導(dǎo)。而其它過程也受到影響，如電子傳遞鏈(ETC)中的8個組分的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)。在轉(zhuǎn)錄表達(dá)受影響途徑的17種阻遏物或誘導(dǎo)物中，ETC阻遏物與咪康唑高度協(xié)同對抗白念珠菌生物膜細(xì)胞。對于浮游生長的白念珠菌培養(yǎng)物或當(dāng)生物膜在缺氧條件下處理時，沒有觀察到協(xié)同作用，表明這是一種生物膜專一的氧依賴性耐受機制。可見，ETC阻遏物導(dǎo)致線粒體功能障礙和影響活性氧類產(chǎn)生，能夠增強咪康唑?qū)Π啄钪榫锬ぜ?xì)胞的殺傷活性[49]。

王平等通過轉(zhuǎn)錄組測序比較白念珠菌原代耐藥株與香蓮?fù)庀匆赫T導(dǎo)下恢復(fù)敏感株的轉(zhuǎn)錄組情況，應(yīng)用基因本體(gene ontology，GO)方法分析香蓮?fù)庀匆赫T導(dǎo)下恢復(fù)敏感菌株的差異表達(dá)基因。結(jié)果表明，對比原代耐藥株，香蓮?fù)庀匆赫T導(dǎo)恢復(fù)敏感株有165個基因的RPKM指標(biāo)表達(dá)上調(diào)，144個基因RPKM指標(biāo)表達(dá)下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)：上下調(diào)基因主要歸類于GO：0015903(氟康唑運輸)?？梢娤闵?fù)庀匆嚎烧T導(dǎo)耐藥白念珠菌恢復(fù)對氟康唑的敏感性，推測可能與開啟氟康唑轉(zhuǎn)運通路有關(guān)[50]。

Qianqian Yang等用RNA-seq技術(shù)完成了經(jīng)黃連解毒湯(HLJDD)治療后白念珠菌基因表達(dá)變化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。鑒定了總共6057個預(yù)計的蛋白質(zhì)編碼基因。通過基因表達(dá)分析，共獲得735個差異表達(dá)基因(DEGs)，其中有700個上調(diào)基因和35個下調(diào)基因。編碼多藥物轉(zhuǎn)運蛋白如ABC轉(zhuǎn)運體和MSN轉(zhuǎn)運體的基因被鑒定為顯著上調(diào)。同時，通過路徑富集分析，鑒定了26條重要路徑，其中主要涉及DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)運體活化路徑。該研究結(jié)果可能提供有關(guān)HLJDD對白念珠菌抑制機制的深入了解[51]。

多年來，由于白念珠菌病治療藥物品種單一、治療周期長和患者自身免疫力低下等導(dǎo)致了普遍存在的耐藥菌株，甚至出現(xiàn)多重耐藥菌株；此外，生物膜的形成也是白念珠菌抗藥性的重要方面。這些情況使得白念珠菌病的臨床治療效果大打折扣。因此，近年來白念珠菌的耐藥性和生物膜形成機制的研究已成為熱點。從上述例證來看，RNA-Seq可以用于白念珠菌的藥物敏感性、耐藥性、耐藥-敏感轉(zhuǎn)換、生物膜形成和生物膜與藥物互作等機制的研究，所以在一定程度上有助于上述問題的解決。

2.3.4 白念珠菌對環(huán)境適應(yīng) Fabien Cottier等基于RNA-Seq分析方法，系統(tǒng)地研究了白念珠菌在幾個時間點對乳酸、乙酸、丙酸和丁酸處理的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)激反應(yīng)。數(shù)據(jù)揭示了一種復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答：各種弱有機酸(WOAs)會引起獨特的基因表達(dá)譜；在短暫和長期暴露之間有重要的差別；盡管有這些不同，在每種WOA誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化中存在著明顯交叉[52]。此研究使他們發(fā)現(xiàn)了一種重要的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，基本上與之前其他人發(fā)表的白念珠菌應(yīng)激反應(yīng)無關(guān)。Shelley Lane等對白念珠菌的轉(zhuǎn)錄組測序表明，分別由轉(zhuǎn)錄因子Cph2和缺氧條件調(diào)控的基因有明顯的重疊，而且在糖酵解和檸檬酸循環(huán)中Cph2對一些缺氧反應(yīng)基因的選擇性表達(dá)是重要的[53]。這說明Cph2與缺氧條件的調(diào)控途徑相關(guān)。

磷酸鹽應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子Pho4對白念珠菌抵抗宿主內(nèi)環(huán)境脅迫(如超氧自由基、陽離子通量等)至關(guān)重要。Mélanie A.C. Ikeh等通過RNA-seq分析指出，Pho4并不直接誘導(dǎo)脅迫防護基因，而Pho4缺失會影響到金屬陽離子的毒性、積累和生物利用度。Pho4調(diào)節(jié)的多磷酸鹽合成可調(diào)節(jié)對錳的抗性；Pho4對調(diào)節(jié)銅的生物利用度、支持銅/鋅超氧化物岐化酶Sod1的活性具有重要作用。試驗證明，pho4Δ細(xì)胞對超氧化物、金屬和非金屬陽離子敏感，對巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的殺傷作用極度敏感，并在動物感染模型中表現(xiàn)弱毒性[54]。此研究表明，在磷酸代謝、金屬體內(nèi)平衡和超氧脅迫抗性之間的關(guān)聯(lián)突出了代謝適應(yīng)在提高白念珠菌在宿主中生存的重要性。

對體內(nèi)外環(huán)境的超強適應(yīng)性是白念珠菌致病性的重要方面，因為大部分其它毒力因子的作用建立在其基礎(chǔ)上或與之密切相關(guān)。然而，從以往的研究報道情況來看，對于這方面的研究明顯不足。顯然，RNA-seq技術(shù)也可在這方面發(fā)揮重要作用。

3 問題與展望

綜上所述，白念珠菌具有遺傳類型豐富、形態(tài)生理多變、環(huán)境適應(yīng)性強、宿主范圍廣泛、毒力因子多樣、致病機制復(fù)雜等特點。盡管國內(nèi)外學(xué)者對白念珠菌與念珠菌病進(jìn)行了大量的研究，但對其致病機理的研究仍不夠全面和深入，尤其對毒力相關(guān)因子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、病原與宿主免疫應(yīng)答、多重藥物抗性以及病原與機體內(nèi)外環(huán)境互作的分子機制等缺乏足夠了解。而這些直接關(guān)系到白念珠菌病防控的靶標(biāo)定位、藥物開發(fā)和策略選擇。從現(xiàn)有的研究資料來看，對白念珠菌及其所致疾病的研究多集中于人類，對動物源的菌株和動物白念珠菌病的研究明顯偏少，更鮮見其轉(zhuǎn)錄組水平的研究資料。然而，據(jù)悉近年來動物尤其禽類白念珠菌病的發(fā)生有明顯上升趨勢，加之白念珠菌病具有人獸共患的特點，不能排除不同來源(人和動物)的菌株具有交叉致病的可能。因此，對動物來源白念珠菌基因組特征及其變化的研究也是很有必要的。

有理由相信，隨著RNA-Seq和有關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，其高效率、高準(zhǔn)確性、高靈敏度、廣適應(yīng)性和低成本的優(yōu)勢會更加突出。對于白念珠菌致病機制研究可能在以下幾方面有所進(jìn)展和突破：1)從以人源標(biāo)準(zhǔn)菌株或臨床菌株研究為主擴展到來自哺乳動物、禽類、無脊椎動物等菌株的廣泛研究；2)從單一菌株的研究發(fā)展到不同基因型或不同菌株間的比較研究；3)從體外培養(yǎng)的菌體樣本到感染狀態(tài)下體內(nèi)特定器官或組織中菌體樣本的研究；4)從著眼白念珠菌自身致病性和毒力因子的研究發(fā)展到病原與宿主免疫系統(tǒng)間相互作用機制的研究；5)從白念珠菌單一轉(zhuǎn)錄組研究擴展到特定生態(tài)位的白念珠菌、其它致病性或非致病性微生物和宿主細(xì)胞的宏轉(zhuǎn)錄組研究?？傊D(zhuǎn)錄組測序及其分析技術(shù)的不斷進(jìn)步有望為白念珠菌致病機制深入研究帶來令人矚目的成就。

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RNA-Seq for pathogenesis ofCandidaalbicans

LIU Jian-chai1,2,3, LIU Huan-zhang2, LIU Yan-wei2,3,YAN Jin-kun2,3, ZHANG He-ping2, SU Jing-liang1

(1.ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China; 2.HebeiUniversityofEngineering,Handan056021,China; 3.EngineeringResearchCenterofPoultryDiseaseinHebeiProvince,Handan056021,China)

In the paper, we introduced the peculiarity ofCandidaalbicansand the disease caused by it, expounded the complexity of the pathogenesis, enumerated the advantages of the RNA-Seq and reviewed its application to study on the pathogenesis ofCandidaalbicans, found out some shortages in previous studies, and anticipated the possible trends of such study in future. In conclusion, some remarkable achievements will bring about by use of improved RNA-Seq for intensive researches on the pathogenesis ofCandidaalbicans.

Candidaalbicans; pathogenesis; RNA-Seq

Su Jing-liang, Email:suzhang@cau.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.014

蘇敬良，Email：suzhang@cau.edu.cn

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系，北京 100094； 2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，邯鄲 056021； 3.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，邯鄲 056021

R379.4

A

1002-2694(2017)01-0072-09

2016-05-03 編輯：劉岱偉

河北省科技支撐項目(No.16226311D)

Supported by the Science and Technology Support Project of Hebei Province(No.16226311D)